固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物源食品中氯苯胺靈殘留

楊麗霞, 黃小貝, 曾希珂, 易 姿

(1. 長沙市食品藥品檢驗(yàn)所, 湖南 長沙 410036; 2. 國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 湖南 長沙 410036)

氯苯胺靈(chlorpropham,結(jié)構(gòu)式見圖1)既是植物生長調(diào)節(jié)劑又是除草劑,常用于馬鈴薯的采后處理,以抑制其發(fā)芽[1,2],也可用于果樹的疏花、疏果及防除一年生禾本科雜草和少數(shù)闊葉雜草[3]。按照我國農(nóng)藥規(guī)定,氯苯胺靈為低毒農(nóng)藥,但是氯苯胺靈在作物種植中的不當(dāng)或過量使用,會(huì)隨著食物鏈和水循環(huán)影響動(dòng)物源食品安全以及人體健康[4,5]。因氯苯胺靈母體和代謝物3-氯苯胺靈具有嚴(yán)重的慢性風(fēng)險(xiǎn),對消費(fèi)者、非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物存在潛在內(nèi)分泌干擾特性,歐盟委員會(huì)決定不再批準(zhǔn)氯苯胺靈的使用[6]。目前,豬、牛、羊、雞、鴨等動(dòng)物飼養(yǎng)周期短,易導(dǎo)致藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝不完全,存在藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)。為降低食品安全風(fēng)險(xiǎn),建立一種動(dòng)物源食品中氯苯胺靈殘留量的檢測方法,可為氯苯胺靈的風(fēng)險(xiǎn)評估提供檢測技術(shù)依據(jù)。

圖 1 氯苯胺靈的分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecular structure of chlorpropham

根據(jù)GB 2763-2019《食品中農(nóng)藥殘留最大殘留量》[7],氯苯胺靈在牛肉中的限量值為0.1 mg/kg、牛內(nèi)臟和生乳限量值均為0.01 mg/kg,檢測方法為GB 19650-2006《動(dòng)物肌肉中478種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》[8]和GB/T 23210-2008《牛奶和奶粉中511種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》[9];氯苯胺靈在馬鈴薯中的限量值為30 mg/kg,檢測方法為GB 23200.9-2016《糧谷中475種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》[10]、GB 23200.113-2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定》[11],采用的均為氣相色譜-質(zhì)譜法。文獻(xiàn)報(bào)道氯苯胺靈的檢測方法有反相高效液相色譜法[12]、氣相色譜法、液相色譜法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14]等。現(xiàn)有文獻(xiàn)大多針對植物源性樣品,對動(dòng)物源性食品中氯苯胺靈的研究較少。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與氣相色譜-質(zhì)譜法相比,具有較高的靈敏度,抗干擾能力強(qiáng),檢測時(shí)間更短,檢測效率更高,更加適用于大批量樣品的檢測。本文結(jié)合氯苯胺靈的物理和化學(xué)性質(zhì)、固相萃取的凈化優(yōu)勢和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏特性,優(yōu)化前處理過程和色譜-質(zhì)譜條件,開發(fā)出了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(SPE-UHPLC-MS/MS)來測定不同動(dòng)物源食品中氯苯胺靈殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500+型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX公司), SF-16R型高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司), Direct-Q?8 UV-R型超純水機(jī)(美國Millipore公司), MV5全自動(dòng)高通量平行濃縮儀(萊伯泰科有限公司), HES-24B真空固相萃取裝置(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司), KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), CM-1000型振蕩混勻器(日本EYELA公司), GM200刀式研磨儀(德國Retsch(萊馳)), ProElut PLS固相萃取柱(200 mg/6 mL)(上海迪柯馬分析技術(shù)有限公司)。

氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心;甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)購于德國Merck KGa A公司;正己烷(色譜純)購于美國Tedia公司;甲酸(色譜純)購于aladdin公司;無水硫酸鈉(AR純)和氯化鈉(AR純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,0.22 μm聚四氟乙烯濾膜(PTFE)購自希波氏公司。

13種動(dòng)物源食品(豬肉、牛奶、牛肉、雞肉、鴨肉、雞蛋、雞胗、鴨蛋、豬腰、豬肝、牛肝、羊肉、鴨胗)均購自當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確吸取1 mL氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L),用甲醇稀釋定容至25 mL,配制成40 mg/L的氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)儲備液轉(zhuǎn)移至棕色玻璃瓶中,于0～4 ℃避光儲存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確吸取氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,用甲醇稀釋,配制成1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液,于0～4 ℃避光儲存,備用。臨用時(shí),用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋成適當(dāng)濃度,待測。

1.3 樣品制備

1.3.1樣品預(yù)處理

牛、羊、豬、鴨、雞等畜禽類樣品取可食肌肉組織、內(nèi)臟約300 g,切碎后經(jīng)刀式研磨儀充分?jǐn)囁榛靹?裝入潔凈容器內(nèi),密封,于-18 ℃以下冷凍保存。牛奶樣品取300 g,混勻,裝入潔凈容器內(nèi),密封,于0～4 ℃冷藏保存。蛋類樣品取10枚,去殼后經(jīng)刀式研磨儀充分?jǐn)囁榛靹?裝入潔凈容器內(nèi),密封,于0～4 ℃冷藏保存。

1.3.2樣品前處理

稱取均質(zhì)樣品3.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞塑料離心管中,靜置使其恢復(fù)至室溫;用移液管準(zhǔn)確移取10 mL乙腈加入至樣品中,超聲5 min,均質(zhì)15 min;加入約2 g氯化鈉和約3 g無水硫酸鈉,均質(zhì)3 min; 10 000 r/min離心3 min;取上清液7.0 mL于10 mL塑料離心管中;加入用乙腈飽和過的正己烷2 mL,均質(zhì)2 min, 10 000 r/min離心2 min,去除正己烷層;準(zhǔn)確移取5 mL提取液于帶刻度的具塞離心管中,45 ℃氮吹濃縮至約0.5 mL,用超純水定容至5 mL,待進(jìn)一步凈化。

用5 mL甲醇和5 mL水活化ProElut PLS固相萃取柱,上樣,用5 mL 30%乙腈水溶液淋洗除雜后抽干小柱,用8 mL乙腈洗脫,洗脫液于45 ℃氮吹至約0.5 mL,用乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液(1∶1, v/v)定容至2 mL,過0.22 μm PTFE濾膜,待測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.5 mL/min;流動(dòng)相:A為0.2%(v/v)甲酸-水溶液,B為乙腈。流動(dòng)相梯度洗脫程序:0～1.00 min, 15%B; 1.00～5.00 min, 15%B～90%B; 5.00～8.00 min, 90%B; 8.00～8.01 min, 90%B～15%B; 8.01～10.0 min, 15%B。進(jìn)樣體積:5 μL。

質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描方式:正離子掃描;離子源溫度(TEM): 550 ℃;霧化氣(Gas 1)壓力:379 kPa(55 psi);輔助氣(Gas 2)壓力:379 kPa(55 psi);離子噴霧電壓(IS):+5 500 V;氣簾氣(CUR)壓力:241 kPa(35 psi);檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。氯苯胺靈在正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 氯苯胺靈在正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters for chlorpropham

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

氯苯胺靈為弱極性化合物,液相色譜方法常用的色譜柱為C18柱[15,16],本方法比較了3種規(guī)格的C18色譜柱的分離效果(見圖2)。本方法以豬肉樣品為研究對象,在流動(dòng)相均采用0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈的梯度洗脫條件下,比較了Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(100 mm×2.1 mm, 5 μm)和Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)3種色譜柱對氯苯胺靈的保留能力和出峰效果。結(jié)果表明,100 mm柱與150 mm柱比較,保留時(shí)間出現(xiàn)前移,但峰形有明顯的拖尾;EclipsePlus C18柱與ZORBAX SB-C18相比,采用ZORBAX SB色譜柱時(shí),氯苯胺靈的峰形更好,更對稱。因此,選用Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)作為氯苯胺靈的分離色譜柱。

圖 2 采用不同色譜柱時(shí)氯苯胺靈的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of chlorpropham on different columns

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別考察了氯苯胺靈在正負(fù)兩種質(zhì)譜電離模式條件下的響應(yīng)情況。取1.0 mg/L的氯苯胺靈工作液,分別用正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行條件優(yōu)化。結(jié)果表明,正離子模式的響應(yīng)要明顯優(yōu)于負(fù)離子模式。氯苯胺靈分子結(jié)構(gòu)中帶有-NH,可能容易加合氫離子形成帶正電荷的離子,提高離子化效率,故氯苯胺靈在正離子環(huán)境中響應(yīng)更高。

在針泵連續(xù)進(jìn)樣方式下,采取Q1 Scan全掃描模式對目標(biāo)物進(jìn)行全掃,得到母離子(m/z213.9),采取Product Ion Scan(MS2)模式對子離子進(jìn)行掃描,得到相對豐度較高的特征碎片離子:m/z172.0和m/z154.1。對特征離子對的儀器參數(shù)(去簇電壓和碰撞能)進(jìn)一步優(yōu)化,得到最優(yōu)化的分析參數(shù)。

2.1.3流動(dòng)相的選擇

在正離子模式下,考察了3種流動(dòng)相體系:0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)相體系、0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)相體系和水與乙腈流動(dòng)相體系(見圖3)。結(jié)果表明,采用甲酸水-乙腈流動(dòng)相體系時(shí),氯苯胺靈的響應(yīng)明顯高于水-乙腈流動(dòng)相體系,并且隨著酸性的提高,響應(yīng)更好,峰形更對稱且尖銳。因此,實(shí)驗(yàn)選擇0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作流動(dòng)相。

圖 3 采用不同流動(dòng)相時(shí)氯苯胺靈的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of chlorpropham obtained with different mobile phases

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

氯苯胺靈難溶于水,易溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑,對植物基質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)常用正己烷、乙腈等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取[11,17]?？紤]到本方法檢測對象為動(dòng)物源食品,其成分較為復(fù)雜,蛋白和油脂含量都比較高,故使用肉類提取常用溶劑乙腈進(jìn)行提取,并使用正己烷對提取液進(jìn)行除油處理。

2.2.2固相萃取柱的選擇

各種SPE柱對樣品的凈化效果不同,本研究比較了陽離子交換SPE柱ProElut PXC(60 mg/3 mL)、陰離子交換SPE柱ProElut PXA(60 mg/3 mL)、硅酸鎂SPE柱ProElut Florisil(200 mg/3 mL)、親水親脂平衡SPE柱ProElut PLS(200 mg/6 mL)4種SPE柱對氯苯胺靈的柱保留量。采用5 mL 0.1 mg/L的氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液過柱,測定流出液中氯苯胺靈的含量,計(jì)算4種SPE柱的柱保留量,其柱保留量百分比分別為:PLS 98.3%、PXA 85.3%、PXC 88.7%和Florisil 60.2%。結(jié)果表明,PLS SPE柱的保留能力較強(qiáng),可提高方法的最終回收效率。

2.2.3淋洗液和洗脫液的選擇

淋洗液:以體積比為0∶100、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0的乙腈-水溶液作為淋洗液,收集濾液,采用優(yōu)化好的色譜-質(zhì)譜條件測定。結(jié)果顯示:當(dāng)淋洗液乙腈-水溶液有機(jī)相比例達(dá)到≥40%時(shí),濾液中可檢出氯苯胺靈,且含量隨著有機(jī)相比例升高而增大(見圖4)。為有效去除蛋白、油脂等雜質(zhì),又能獲得更好的回收率,本實(shí)驗(yàn)選用乙腈-水溶液(30∶70, v/v)作為固相萃取淋洗液。

圖 4 不同體積比例的乙腈-水溶液對氯苯胺靈的淋洗能力(n=3)Fig. 4 Washing capacity of acetonitrile-water solution with different volume ratios on the recovery of chlorpropham (n=3)

洗脫液:比較了100%甲醇、100%乙腈、1%甲酸-甲醇、90%甲基叔丁基醚-乙腈、5%氨水-甲醇、100%乙酸乙酯、90%乙酸乙酯-甲醇7種常用洗脫溶劑對氯苯胺靈在ProElut PLS SPE柱上的洗脫能力。同時(shí)用以上7種溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。洗脫能力采用洗脫后測定的峰面積(AX)與配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積(A0)之比評價(jià)(洗脫能力=AX/A0×100%),結(jié)果依次為97.8%、98.5%、95.5%、89.3%、87.1%、68.3%、69.5%,表明用100%甲醇、100%乙腈、1%甲酸-甲醇3種溶液洗脫效果較好,考慮到樣品提取使用的是乙腈,本實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為流動(dòng)相洗脫液。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)評價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的組分在分析過程中對目標(biāo)物有顯著的干擾,從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線,通過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估[18]?；|(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率×100%。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)值在85%～115%之間時(shí),說明無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

本工作用豬肉、牛奶、牛肉、雞肉、鴨肉、雞蛋、雞胗等空白樣品基質(zhì)提取液和溶劑溶液(乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液(1∶1, v/v))分別配制成0.5、1.0、2.25、4.5、9.0、45.0、100.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照優(yōu)化好的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析,對氯苯胺靈的峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x, μg/L)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果表明:13種樣品的基質(zhì)效應(yīng)值在90.9%～106.6%之間(見表2),基質(zhì)增強(qiáng)或減弱效應(yīng)不明顯,但由于各基質(zhì)成分復(fù)雜且存在一定差異性,為了檢測的準(zhǔn)確性,所有樣品檢測均用空白基質(zhì)匹配溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行樣品檢測。

表 2 不同基質(zhì)中氯苯胺靈的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r2), and matrix effects (ME) of chlorpropham in different matrices

表 3 不同基質(zhì)中氯苯胺靈的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precision of chlorpropham in different matrices (n=6)

2.4 線性范圍和定量限

表2數(shù)據(jù)同時(shí)表明,豬肉、牛奶、牛肉、雞肉、鴨肉、雞蛋、雞胗、鴨蛋、豬腰、豬肝、牛肝、羊肉、鴨胗13種樣品基質(zhì)中氯苯胺靈在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好,其線性相關(guān)系數(shù)均不低于0.992 9。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)所測基質(zhì)樣品溶液信噪比(S/N)≥10計(jì)算得到該方法檢測氯苯胺靈的定量限(LOQ)為0.003 mg/kg,與文獻(xiàn)報(bào)道和國標(biāo)方法相比具有更高的靈敏度:文獻(xiàn)[17]的方法定量限為0.006 7 mg/kg,GB 19650-2006[8]的方法定量限為0.083 mg/kg,GB/T 23210-2008[9]的方法定量限為0.028 mg/kg(牛奶基質(zhì))和0.139 mg/kg(奶粉基質(zhì))。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

通過對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收,考察本方法的準(zhǔn)確度與精密度。按照優(yōu)化后的提取和凈化步驟,在上述13種基質(zhì)樣品中分別添加0.003、0.006、0.060 mg/kg 3個(gè)水平的氯苯胺靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行(見表3),不同基質(zhì)加標(biāo)水平為3 μg/kg時(shí)的色譜圖見圖5。結(jié)果顯示,在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下,不同基質(zhì)樣品中氯苯胺靈的平均回收率為74.9%～97.6%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～9.5%,符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[19]規(guī)定的要求,可用于動(dòng)物源食品中氯苯胺靈的定量檢測。

圖 5 不同基質(zhì)溶液加標(biāo)樣品中氯苯胺靈(3 μg/kg)的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of chlorpropham (3 μg/kg) spiked in different matrices

2.6 實(shí)際樣品的測定

利用本方法對市售的上述13種動(dòng)物源食品共計(jì)60批次樣品進(jìn)行氯苯胺靈殘留量檢測,均未檢出氯苯胺靈。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件,采用乙腈提取,選擇ProElut PLS SPE柱,優(yōu)化 SPE淋洗液、洗脫液成分,以空白基質(zhì)匹配溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物源食品中氯苯胺靈殘留的檢測方法。該方法前處理簡便易行,基質(zhì)干擾小,靈敏度高,線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度滿足方法學(xué)要求,適用于多種動(dòng)物源食品中氯苯胺靈的定性和定量檢測。