和厚樸酚衍生物的合成及防治結(jié)腸癌作用機制的預(yù)測

何明會, 黨笑笑, 李 軍, 董登祥*

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽 550000； 2. 西安解碼生物科技有限公司,陜西 西安 710000)

結(jié)腸癌是一種發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤,隨著人民生活水平的提高,我國結(jié)腸癌患者在急速上升,發(fā)病率和死亡率也越來越高,嚴重威脅到患者的生活質(zhì)量[1]。目前常規(guī)化療藥物的治療,常因選擇性不高,產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng),包括腹瀉、中性粒細胞減少、惡心嘔吐、胃腸道毒性和肝毒性等[2-3]。而中藥及單體化合物在治療結(jié)腸癌上取得了一定的成果,可以減輕化療帶來的不良反應(yīng)和結(jié)腸癌患者術(shù)后的痛苦,提高患者免疫力,降低復(fù)發(fā)率及提高結(jié)腸癌患者在預(yù)后的生活質(zhì)量方面發(fā)揮了重要作用[4-6]。因此,尋找安全性高、效果好的抗結(jié)腸癌藥物是當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者們迫切需要解決的科學(xué)問題。

厚樸(MagnoliaofficinalisRehdetWils)為木蘭科、木蘭屬的植物,主要以干燥皮、根皮及枝皮入藥[7]。近年來,厚樸藥材中所含天然化合物的研究已經(jīng)取得了較大的成果[8],發(fā)現(xiàn)其主要含有苯丙素類、生物堿類、揮發(fā)油類等化合物,而苯丙素類成分是厚樸主要有效成分之一,如厚樸酚、和厚樸酚、苯乙醇苷等[9]。厚樸酚與和厚樸酚的藥理活性與厚樸的傳統(tǒng)功效密切相關(guān)。近年來,國內(nèi)外學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)[10-14],和厚樸酚具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化等廣泛的藥理活性,尤其在抗腫瘤作用上療效顯著[15-18],有學(xué)者研究證實了[19-20]和厚樸酚在結(jié)腸癌細胞中具有明顯的抗增殖活性,和厚樸酚可能是一種可開發(fā)的結(jié)腸癌候選藥物。和厚樸酚最初是由Obovata等從厚樸藥材中提取分離得到的一種白色粉末狀酚類化合物(Chart 1)。但其難溶于水,易溶于極性較大或中極性的有機溶劑,穩(wěn)定性差等理化性質(zhì),使其研究開發(fā)及臨床應(yīng)用受到了極大的限制[21]。因此,解決和厚樸酚水溶性低、穩(wěn)定性差的缺陷是當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者研究的熱點領(lǐng)域。

Chart 1

糖是為人類提供能量的三大物質(zhì)之一,是生命體存活的必須物質(zhì)。在十九世紀(jì)二十年代初期,國外科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)了六碳糖的結(jié)構(gòu),之后科學(xué)技術(shù)越來越先進,人們借助各種技術(shù)和儀器對其進行了深入的研究[22]。迎來了糖化學(xué)的熱潮,糖化學(xué)也得到了迅猛發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[23]細胞膜糖蛋白,糖脂是由碳水化合物基團和蛋白質(zhì),脂質(zhì),磷脂組成。同時還發(fā)現(xiàn)其可參與細胞的識別和增殖,組織器官的形成,胚胎發(fā)育,激素調(diào)節(jié)等多種生命過程。另外有研究表明[24]糖基化結(jié)構(gòu)改造可以提高藥物的水溶性,使其與原苷元結(jié)合后水溶性、穩(wěn)定性、活性均有所提高。雖然已有學(xué)者[25-27]對和厚樸酚進行了結(jié)構(gòu)的改造及修飾,但和厚樸酚糖基化結(jié)構(gòu)改造及修飾的文獻報道較少?；诖?本文在和厚樸酚結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,引入簡單的糖基結(jié)構(gòu),合成和厚樸酚的糖苷化合物,以達到提高其水溶性和穩(wěn)定性的目的,進而提高其生物利用度[28-29]。

近些年,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)為中藥及單體化合物作用機制的研究提供了思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要是通過構(gòu)建和整合“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”多層次網(wǎng)絡(luò),分析特定信號節(jié)點之間的相互作用關(guān)系,從系統(tǒng)、整體角度探索藥物與機體相互作用的一門新學(xué)科[30]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認為是一種提高新藥臨床試驗成功率和節(jié)省藥物研發(fā)費用的新方法[31-32]。

綜上所述,本文以和厚樸酚為先導(dǎo)化合物,以D-半乳糖、D-葡萄糖、α-乳糖等為起始原料,通過對糖羥基保護與去保護,得到一系列單糖、二糖片段、三糖片段(Scheme 1),再與和厚樸酚上的4′-OH結(jié)合,得到和厚樸酚的單糖、二糖、三糖衍生物(Scheme 2)。再將得到的目標(biāo)化合物通過1H NMR、13C NMR等方法進行結(jié)構(gòu)鑒定。同時,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù),初步揭示和厚樸酚衍生物防治結(jié)腸癌的作用機制,以期為和厚樸酚類藥物及衍生物的深入研究及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WFH-203B型三用紫外分析儀；INOVA-600 MHz型核磁共振儀(DMSO、 D2O或CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))。

D-半乳糖、D-葡萄糖、α-乳糖、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽,國藥集團化學(xué)試劑有限公司；和厚樸酚,西安開來生物工程有限公司；2,3,4,6-四-O-乙?；?D-吡喃葡萄糖亞胺脂(a), 3,4,6-三-O-乙酰基2-去氧-2-苯甲酰亞胺基-D-吡喃葡萄糖亞胺脂(c),對甲基-苯基-S-(2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2,6-O-甲基-β-D吡喃半乳糖苷(e),對甲基-苯基-S-[(2′,3′,4′,6′-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-2,3,6-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-(1→4)-2,6-二-O-甲基-β-D-吡喃半乳糖苷(f)，其中，a,c,e,f的合成見Scheme 1；其余所用試劑均為分析純。

Scheme 2

1.2 合成

(1)2的合成

稱取化合物10.1g(0.37 mmol和a0.05 g(0.07 mmol)放置反應(yīng)瓶中,量取適量DCM溶解底物,用N2保護反應(yīng)體系,將反應(yīng)瓶置于0 ℃平衡10 min后,取3 μL TMhof加入,0 ℃攪拌反應(yīng),每隔10 min用TLC監(jiān)測反應(yīng)體系(展開劑：Cy/EtOAc=2/1,V/V),反應(yīng)30 min后完成(計算得Rf=0.64)。加入1 mL TEA,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH至中性,終止反應(yīng)。DCM萃取,收集有機相,除水,過濾,減壓濃縮得粗產(chǎn)物。用200～300目硅膠填充硅膠柱后純化粗產(chǎn)物(洗脫劑：Cy/EtOAc=5/1或Cy/EtOAc=8/1,V/V)得淡黃色固體b0.062 g,產(chǎn)率65.6%。

將精密稱量的化合物b0.05 g置于反應(yīng)瓶中,加適量MeOH溶解底物,加入10 mL新制甲醇鈉(NaOMe),常溫攪拌反應(yīng)。每隔30 min用TLC監(jiān)測反應(yīng)體系(展開劑：Cy/EtOAc=2/1,V/V),反應(yīng)1 h后完成(Rf=0)。加入陰離子交換樹脂,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至中性,終止反應(yīng)。萃取,除水,收集有機相,減壓蒸餾干燥,得到粗產(chǎn)物。用凝膠柱純化粗產(chǎn)物(洗脫劑：甲醇),得和厚樸酚-4′-O-2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷(2) 0.51 g,白色固體粉末,收率99.8%, m.p.88～89 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO)δ： 7.91(d,J=14.5 Hz, 1H, Ar-6′), 7.37(dd,J=13.7 Hz, 8.1 Hz, 1H, Ar-4), 7.31(s, 1H, Ar-6), 7.20(dd,J=15.2 Hz, 8.1 Hz, 1H, Ar-3), 7.11(d,J=8.0 Hz, 1H, Ar-5′), 7.06(m, 2H, 8,8′-H), 6.78(s, 1H, Ar-3′), 5.42(d,J=10.5 Hz, 1H, Glu-1-H), 4.90(dd,J=9.0 Hz, 3.4 Hz, 2H, 9′-H), 4.48(d,J=9.5 Hz, 2H, 9-H), 4.21(d,J=6.9 Hz, 4H, 7,7′-H), 4.08～4.02(m, 5H, Glu-2,3,5,6-H), 3.08(m, 1H, Glu-4-H);13C NMR(151 MHz, DMSO)δ： 167.8(Ar-C4′), 162.8(Ar-C2), 137.9(Ar-C2′), 137.3(C8′, C8), 135.2(Ar-C4), 133.0(Ar-C5), 131.9(Ar-C6), 131.4(Ar-C1′), 130.6(Ar-C1), 130.1(Ar-C4), 129.8(Ar-C6), 128.6(C9, C9′), 123.8(Ar-C3), 123.5(Ar-C3′), 102.1(Glu-C1), 97.9(C9’, C9), 75.1 (Glu-C2), 73.4(C5), 73.0(C3), 69.1(C4), 68.6(C6), 29.9(C7’, C7)。

(2)3的合成

稱取化合物10.1 g(0.37 mmol)和c0.05 g放置反應(yīng)瓶中,取適量DCM溶解底物,用N2保護反應(yīng)體系,將反應(yīng)瓶置于0 ℃平衡10 min后,量取3 μL TMSoTf加入,0 ℃攪拌反應(yīng),每10 min用TLC監(jiān)測反應(yīng)體系(展開劑：Cy/EtOAc=2/1,V/V),反應(yīng)30 min后完成(計算得Rf=0.39)。加適量TEA,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH至中性,終止反應(yīng)。DCM萃取,收集有機相,干燥,過濾,減壓濃縮,得粗產(chǎn)物。用200～300目硅膠填充硅膠柱后純化粗產(chǎn)物(洗脫劑：Cy/EtOAc=5/1或Cy/EtOAc=8/1,V/V),得淡黃色固體d0.056 g,產(chǎn)率59.7%。

將精密稱量的化合物d0.05 g,置于反應(yīng)瓶中,加適量MeOH溶解底物,加入10 mL新制甲醇鈉(NaOMe)(稱取Na粒100 mg置于10 mL MeOH調(diào)至PH=11～12),常溫攪拌反應(yīng)。每30 min用TLC監(jiān)測反應(yīng)體系(展開劑為：Cy/EtOAc=2/1,V/V),反應(yīng)1 h后完成(Rf=0)。加入陰離子交換樹脂,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至中性,終止反應(yīng)。萃取,除水,收集有機相,減壓蒸餾干燥,得到粗產(chǎn)物。用凝膠柱純化粗產(chǎn)物(洗脫劑：甲醇)。得和厚樸酚-4′-O-2-鄰苯二甲酰亞胺基-β-D-吡喃氨基葡萄糖苷(3)0.045 g,白色固體粉末,收率為90.5%, m.p.90～92 ℃;1H NMR(600 MHz, D2O)δ： 7.67(dd,J=5.7 Hz, 3.3 Hz, 1H, Ar-6′), 7.54(dd,J=5.7 Hz, 3.3 Hz, 1H, Ar-4), 7.38(t,J=7.8 Hz, 1H, Ar-3), 7.30(s, 2H, Ar-3′，6), 7.24(d,J=8.1 Hz, 1H, Ar-5′), 7.15(d,J=6.8 Hz, 2H, 8,8′-H), 7.10(d,J=7.9 Hz, 2H, N-Ar-H), 7.04(d,J=7.9 Hz, 2H, N-Ar-H), 5.74(m, 1H, Glu-1), 4.14(m, 4H, 9,9′-H), 3.98(t,J=10.3 Hz, 4H, 7,7′-H), 3.82(d,J=6.4 Hz, 4H, N-CH2), 3.76(m, 1H, Glu-2), 3.66(m, 2H, Glu-6), 3.64(m, 1H, Glu-3), 3.40(m, 1H, Glu-4), 3.31(m, 1H, Glu-5);13C NMR(151 MHz, D2O)δ： 168.6(Ar-C4′), 167.6(Ar-C2), 133.9 (Ar-C2′), 132.6(C8′, C8), 131.4(Ar-C5), 130.9(Ar-C1′), 129.5(Ar-C1), 129.2(C9′, C9) , 129.1(Ar-C6’), 129.0(Ar-C5′), 128.1(Ar-C4), 127.9(Ar-C6), 122.6(Ar-C3), 120.6(Ar-C3′), 118.2(Glu-C1), 117.2(C9′, C9), 74.8(Glu-C2), 69.5(Glu-C3), 69.4(Glu-C5), 67.8(Glu-C4), 60.9(N-C), 60.4(N-C), 54.1(Glu-C6), 39.9(C7′, C7)。

(3)4的合成

稱取化合物10.1 g(0.37 mmol)、0.05 ge和0.1 g NBS放置反應(yīng)瓶中,量取適量DCM溶解底物,用N2保護反應(yīng)體系,將反應(yīng)瓶置于0 ℃平衡10 min后,取3 μL TfoH加入,0 ℃攪拌反應(yīng),每10 min用TLC監(jiān)測反應(yīng)體系(展開劑：Cy/EtOAc=2/1,V/V),反應(yīng)30 min完成(計算得Rf=0.41)。先加入飽和的硫代硫酸鈉至無色,再加入飽和碳酸鈉,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH至中性,終止反應(yīng)。DCM萃取,收集有機相,干燥,過濾,減壓濃縮得粗產(chǎn)物。用200-300目硅膠填充硅膠柱后純化粗產(chǎn)物(洗脫劑：Cy/EtOAc=5/1或Cy/EtOAc=8/1,V/V),得和厚樸酚-4′-O-(2′,3′,4′,6′-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2,6-二-O-甲基-β-D-吡喃半乳糖苷(4)0.058 g,淡黃色固體,產(chǎn)率59.1%, m.p.119～122 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ： 7.60(d,J=1.9 Hz, 1H, Ar-6′), 7.41(d,J=8.2 Hz, 1H, Ar-4), 7.29(s, 2H, Ar-3′,6), 7.13(d,J=8.1 Hz, 2H, Ar-3,5′), 7.05(d,J=1.9 Hz, 2H, 8,8′-H), 5.98～5.91(m, 2H, Glu-1,1′-H), 5.20～5.06(m, 7H, Glu-2′,3′,4′,5′,6′-H), 4.33(t,J=6.7 Hz, 4H, 9,9′-H), 3.35(d,J=6.7 Hz, 4H, 7,7′-H), 2.37～2.31(m, 7H, Glu-2,3,5,6-H), 2.26(s, 3H, Glu-2-OCH3), 1.28(s, 3H, Glu-6-OCH3);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ：172.2(Glu-3′-C=O), 170.4(Glu-2′-C=O), 170.1(Glu-4′-C=O), 167.4(Glu-6′-C=O), 153.2(Ar-C4′), 150.0(Ar-C2), 138.7(Ar-C2′), 137.4(Ar-C3), 136.7(Ar-C5), 133.9(C8′, C8), 132.0(Ar-C4), 129.8(Ar-C6, C6′), 128.5(Ar-C1, C1′), 124.4(Ar-C3′), 116.51(C9′, C9), 86.5(Glu-C1, C1′), 77.2(Glu-C2), 76.2(Glu-C5), 71.4(Glu-C5′), 69.5(Glu-C3′), 69.4(Glu-C2′), 68.6(Glu-C3), 66.6(Glu-C4′), 65.3(Glu-C4), 64.2(Glu-2-OCH3), 38.77(C7′, C7), 29.7(Glu-4-OCH3)。

(4)5的合成

稱取化合物10.1 g(0.37 mmol)、f0.05 g(0.07 mmol)和0.1 g NBS放置反應(yīng)瓶中,加適量DCM溶解底物,用N2保護反應(yīng)體系,將反應(yīng)瓶置于0 ℃平衡10 min后,量取3 μL TfoH加入,0 ℃攪拌反應(yīng),每10 min用TLC監(jiān)測反應(yīng)體系(展開劑：Cy/EtOAc=2/1),反應(yīng)1.5 h完成(計算得Rf=0.34)。先加入飽和的硫代硫酸鈉至無色,再加入飽和碳酸鈉,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH至中性,終止反應(yīng)。DCM萃取,收集有機相,干燥,過濾,減壓濃縮得粗產(chǎn)物。用200～300目硅膠填充硅膠柱后純化粗產(chǎn)物(洗脫劑：Cy/EtOAc=5/1或Cy/EtOAc=8/1,V/V),得和厚樸酚-4′-O-[(2′,3′,4′,6′-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-2,3,6-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖基]-(1→4)-2,6-二-O-甲基-β-D-吡喃半乳糖苷(5)0.055 g,淡黃色固體,產(chǎn)率為58.3%, m.p.131～132 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ： 7.39(d,J=1.9 Hz, 1H, Ar-6’), 7.29(s, 2H, Ar-3′,6), 7.23(dd,J=8.2 Hz, 2.0 Hz, 1H, Ar-5′), 7.14(d,J=1.9 Hz, 2H, 8,8′-H), 6.03～5.91(m, 3H, Glu-1,1′,1″-H), 5.51～5.45(m, 4H, Glu-3′5′,3″, 5″-H), 5.18～5.08(m, 7H, Glu-2,2′,2″,4′,4″,6″-H), 4.94(dd,J=10.3 Hz, 3.6 Hz, 1H, 9-H), 4.76(d,J=8.0 Hz, 1H, 9′-H), 4.29～4.24(m, 7H, Glu-3,4,5,6,6′-H), 4.16(d,J=12.1 Hz, 2H, 7-H), 3.43(d,J=6.7 Hz, 2H, 7′-H), 2.98(s, 3H, Glu-2-OCH3)), 2.91(s, 3H, Glu-2-OCH3);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ：171.1(Glu-2′-C=O), 170.4(Glu-2″-C=O), 170.0(Glu-3-C=O), 169.5(Glu-3″-C=O), 169.3(Glu-4″-C=O), 169.1(Glu-6′-C=O), 168.50(Glu-6″-C=O), 146.3(Ar-C4′), 137.7(Ar-C2), 136.9(Ar-C3), 136.7(Ar-C5), 133.9(Ar-C2′), 132.2(C8′, C8), 131.2(Ar-C4), 131.1(Ar-C1′), 130.2(Ar-C1), 128.9(Ar-C6), 125.4(Ar-C6′), 122.4(Ar-C3′), 116.5(C9, C9′), 116.2(Glu-C1, C1′), 111.2(Glu-C1″), 77.2～76.8 (Glu-C2, C3, C4, C5, C6, C2′, C3′, C4′, C5′, C6′, C2″, C3″, C4″, C5″, C6″), 53.4(Glu-2-OCH3), 39.55(C7′, C7), 29.7(Glu-4-CH3)。

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測和厚樸酚衍生物防治結(jié)腸癌的作用機制

2.1 和厚樸酚衍生物作用靶點的預(yù)測

運用Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫,預(yù)測和厚樸酚衍生物的作用靶點,整合所有靶點,刪除重復(fù)靶點,建立和厚樸酚衍生物靶點數(shù)據(jù)集。最后,利用UniProt數(shù)據(jù)庫將上述篩選得到的所有靶點均轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。

2.2 結(jié)腸癌靶點的建立

利用GEO DataSets 以“colon cancer”為關(guān)鍵詞,檢索“結(jié)腸癌”相關(guān)的文獻,以“Series,Expression profiling by array和Homo sapiens”為篩選條件,選擇基因芯片數(shù)據(jù)(Platform): GSE74604/GPL6104和GSE44076/GPL13667。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫以“colon cancer”為關(guān)鍵詞,檢索“結(jié)腸癌”相關(guān)的基因。整合所有基因,刪除重復(fù)基因,建立結(jié)腸癌靶點數(shù)據(jù)集。

2.3 核心靶基因的篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將和厚樸酚衍生物防治結(jié)腸癌的主要調(diào)控靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI network, protein protein interaction network),并根據(jù)Degree值大小篩選和厚樸酚衍生物治療結(jié)腸癌的核心靶基因。

2.4 和厚樸酚衍生物防治結(jié)腸癌網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建“成分-靶點-疾病”和“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析

首先,將核心靶基因的Gene Symbol名轉(zhuǎn)化entrez ID。然后使用R語言BiocManager“ClusterProfiler”中的enrichGO和enrichKEG函數(shù),進行GO生物學(xué)過程和KEGG通路富集分析。

2.6 分子對接

首先,利用PDB數(shù)據(jù)庫下載Degree值排名最前的8個核心靶基因的晶體結(jié)構(gòu)。將晶體結(jié)果導(dǎo)入DS軟件中,除去水分子、加極性氫原子及構(gòu)象優(yōu)化等處理后,確定活性結(jié)合位點；同時使用Prepare Ligands模塊對小分子化合物進行配體預(yù)處理。然后,使用AutoDock進行分子對接,得到每個化合物與核心靶基因的對接結(jié)合親和力(Affinity, kcal/mol),以Affinity作為評價指標(biāo)。Affinity絕對值越大,配體與受體之間的結(jié)合能力越穩(wěn)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 合成

本文共合成4個和厚樸酚糖苷衍生物,其中3～5未見文獻報道。和厚樸酚為新型木質(zhì)素,其結(jié)構(gòu)中含有兩個酚羥基,將其長時間暴露在空氣當(dāng)中容易發(fā)生氧化,造成和厚樸酚苷元的損失；或者反應(yīng)產(chǎn)物不宜與其氧化物分離。因此,在保存和厚樸酚苷元時,應(yīng)避光密封低溫條件下保存,且經(jīng)過糖修飾后其穩(wěn)定性得到了相應(yīng)的提高。

在合成化合物4、5兩個糖苷衍生物時,產(chǎn)率較低。猜測可能是由于其原料糖是合成糖,合成糖存在大量的乙酰基結(jié)構(gòu),因此其結(jié)構(gòu)較大難與苷元上的酚羥基相結(jié)合。同時合成糖的端羥基是用離去基團對甲苯硫酚修飾的,導(dǎo)致產(chǎn)率較低。

合成的二糖、三糖與和厚樸酚合成后,將得到的衍生物的糖上羥基采用新制Na(MeOH)強堿法還原,發(fā)現(xiàn)用甲氧基保護的糖羥基無法正常還原,因此該問題仍需要探索解決。

3.2 和厚樸酚衍生物防治結(jié)腸癌的作用機制

預(yù)測得到723個和厚樸酚衍生物的作用靶點和20249個與“結(jié)腸癌”相關(guān)的靶點,通過Swiss TargetPrediction、GEO DataSets和GeneCards的作用靶點繪制韋恩圖(見圖1,圖2),篩選得到36個核心靶點。

圖1 和厚樸酚合成產(chǎn)物治療結(jié)腸癌主要調(diào)控靶點韋恩圖

圖2 和厚樸酚衍生物治療結(jié)腸癌核心靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

軟件構(gòu)建“核心靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)(圖3,圖4)。

圖3 和厚樸酚衍生物治療結(jié)腸癌“成分-核心靶點-結(jié)腸癌”網(wǎng)絡(luò)圖(紫色六邊形代表結(jié)腸癌,綠色三角形代表和厚樸酚衍生物,紅色四邊形代表核心靶基因)

圖4 和厚樸酚衍生物治療結(jié)腸癌“核心靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將36個核心靶點進行GO富集分析,保留P≤0.05的結(jié)果。結(jié)果共富集得到323條生物過程,36條細胞組成和21條分子功能,根據(jù)P-value越小,列舉了顯著性排名前20的生物過程進行可視化分析。結(jié)果表明,和厚樸酚衍生物治療結(jié)腸癌涉及的主要生物過程包括有絲分裂核分裂、染色體分離的調(diào)控、細胞周期相變的調(diào)控、細胞周期G2/M相變、減數(shù)分裂細胞周期、、蛋白酶體介導(dǎo)的泛素依賴性蛋白分解過程、G2/M過渡有絲分裂細胞周期的調(diào)控、細胞器組織的負調(diào)控、泛素蛋白連接酶活性的調(diào)節(jié)、DNA完整性檢查點涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、組蛋白磷酸化、膜拆卸、DNA代謝過程的調(diào)控等。這些生物過程既可能彼此調(diào)節(jié)配合,又可能相互制約,共同達到防治結(jié)腸癌的目的。

將36個核心靶點進行KEGG通路富集分析,保留P≤0.05的結(jié)果,并對信號通路行進行可視化分析。結(jié)果共富集得到13條信號通路,分別為細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂、孕激素介導(dǎo)的卵母細胞成熟、人T細胞白血病病毒1感染、p53信號通路、FoxO信號通路、小細胞肺癌、細胞衰老、病毒致癌、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、鉑耐藥、乙型肝炎、EB病毒感染。

使用Docking模塊進行分子對接,得到8個和厚樸酚衍生物與核心靶基因的對接結(jié)合親和力,結(jié)果表明,這8個核心靶基因與和厚樸酚衍生物的親和力在-10.1～-6.2 kcal/mol,兩者結(jié)合相對較穩(wěn)定,與網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)的篩選結(jié)果基本一致,結(jié)果見表1。

表1 核心靶點與和厚樸酚合成產(chǎn)物分子對接結(jié)果(kcal/mol)a

研究已證實,和厚樸酚具有治療結(jié)腸癌的作用。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,結(jié)果表明AURKB、CDK1、CCNB1、PLK1、AURKA為和厚樸酚糖苷衍生物防治結(jié)腸癌的主要核心靶點。PLK1基因編碼的ser/thr蛋白激酶在有絲分裂過程中高度表達,并且在許多不同類型的癌癥中都有升高的水平,其在癌細胞中的缺失顯著地抑制了細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡,為癌癥治療的靶點[33]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建了“和厚樸酚糖苷衍生物-核心靶點-疾病”、“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)和厚樸酚糖苷衍生物抗結(jié)腸癌的作用機制涉及多個生物過程、多條通路。提示和厚樸酚糖苷衍生物抗結(jié)腸癌的作用機制可能是上述靶點和信號通路共同作用的結(jié)果。課題組下一步,將對預(yù)測結(jié)果進行動物實驗加以驗證。

本文報道的方法不僅改善和厚樸酚穩(wěn)定性差及水溶性低的問題,還豐富了和厚樸酚衍生物的種類,為和厚樸酚類藥物及其衍生物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,通過數(shù)據(jù)挖掘和篩選,分別構(gòu)建和厚樸酚糖苷衍生物防治結(jié)腸癌的“成分-核心靶點-疾病”、“靶點-通路”和PPI網(wǎng)絡(luò),篩選得到了核心靶基因,并對核心靶基因進行GO和KEGG富集分析,通過分子對接初步探討了和厚樸酚衍生物防治結(jié)腸癌的分子機制,體現(xiàn)出和厚樸酚衍生物多靶點、多通路的特點,但需進一步通過動物及細胞實驗對預(yù)測結(jié)果進行驗證。