基于分子對(duì)接研究甜菊醇、異甜菊醇對(duì)赤霉素受體GID1的作用機(jī)制

張 軍，王 杭，于寧康，張 珂，韓文龍

(鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044)

赤霉素(gibberellins，GAs)是雙萜類植物激素，是植物生長(zhǎng)過(guò)程中必需的生長(zhǎng)激素之一[1-2]，對(duì)植物從種子萌發(fā)到開(kāi)花結(jié)果整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程都擔(dān)負(fù)著重要作用[3]。1938年，日本植物學(xué)家藪田首次發(fā)現(xiàn)赤霉素，至今已經(jīng)分離確定了130多種，其中赤霉素GA3因其分布最廣、活性最強(qiáng)，成為研究熱點(diǎn)[4]。

隨著“有機(jī)農(nóng)業(yè)”的到來(lái)，人們對(duì)健康越來(lái)越關(guān)注。根據(jù)發(fā)酵工業(yè)網(wǎng)報(bào)道，全球赤霉素產(chǎn)量2016年達(dá)到480.9噸，年平均增長(zhǎng)率為4.62%[5]。人工合成赤霉素在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被大量使用，所產(chǎn)生的安全問(wèn)題也越來(lái)越引起人們的重視。EL-MOFTY等[6]研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素對(duì)小鼠腫瘤誘發(fā)率為18%(雄)和36%(雌)，飼喂14個(gè)月小鼠肺中發(fā)現(xiàn)支氣管肉芽腫；許春爽[7]研究顯示，赤霉素暴露可增加精子凋亡。因此，開(kāi)發(fā)安全、對(duì)人類健康無(wú)任何毒副作用的赤霉素替代物成為重要的課題[8]。

甜菊醇、異甜菊醇來(lái)自甜菊糖(stevioside)的雙萜貝殼杉烯母環(huán)。由于甜菊糖高甜、低熱，安全性好，被稱為世界第三種天然糖源[9]，F(xiàn)DA等批準(zhǔn)其作為飲食補(bǔ)充劑使用。甜菊糖(Stevioside)經(jīng)酶解或使用高碘酸鈉和大量強(qiáng)堿處理可以得到甜菊醇(steviol)，甜菊醇在酸性條件下發(fā)生wagner-meerwein分子重排，生成異甜菊醇(isosteviol)，異甜菊醇也可以由甜菊糖經(jīng)稀硫酸直接水解得到。甜菊醇與異甜菊醇互為同分異構(gòu)體[10]，分子式為C20H30O3。OGORODNOVA等[11]發(fā)現(xiàn)甜菊醇、異甜菊醇可以刺激小麥生長(zhǎng)，增強(qiáng)低溫抗性；張亮等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)異甜菊醇浸種處理的油菜種子發(fā)芽率、幼苗根長(zhǎng)、葉綠素含量等明顯提高；劉秀芳等[13]指出，甜菊醇、異甜菊醇促進(jìn)水稻種子發(fā)芽活性優(yōu)于赤霉素作用，但是沒(méi)有對(duì)刺激生長(zhǎng)信號(hào)機(jī)理進(jìn)一步探討。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，研究配體-受體構(gòu)效關(guān)系的建模技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物生理學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)、制藥等方面[14]。近二十年來(lái)對(duì)GAs作用機(jī)制的研究，揭示了GAs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制依賴于GID1蛋白的配體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮作用[15-17]。因此，本研究采用分子對(duì)接技術(shù)，以GAs受體蛋白GID1為靶點(diǎn)，以GA3為對(duì)照物，分析甜菊醇、異甜菊醇對(duì)赤霉素結(jié)合受體GID1蛋白[18-20]相互作用模式和機(jī)理，探討對(duì)接結(jié)合自由能與活性相關(guān)性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)赤霉素的安全替代物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

AutoDock Vina分子對(duì)接軟件[21]；AutoDock Tools 1.5.6蛋白對(duì)接軟件，從美國(guó)斯克利普斯研究所官網(wǎng)(http://autodock.scripps.edu)下載；PyMol視圖處理軟件；LigPlot疏水性分析軟件。

1.1.1 小分子配體準(zhǔn)備

從zinc小分子數(shù)據(jù)庫(kù)(https://zinc.docking.org/)中搜索赤霉素GA3(ZINC3860467)、甜菊醇(ZINC6491272)和異甜菊醇(ZINC4044743)分子3D結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)，保存為mol2格式文件。

圖1 (a)赤霉素GA3，(b)甜菊醇和(c)異甜菊醇分子結(jié)構(gòu)

1.1.2 受體蛋白準(zhǔn)備

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)下載赤霉素受體GID1蛋白晶體結(jié)構(gòu)，保存為PDB格式。GID1蛋白有351個(gè)氨基酸，來(lái)自于模式植物擬南芥。GID1受體蛋白三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖2 GID1三維結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 配體預(yù)處理

對(duì)赤霉素GA3、甜菊醇和異甜菊醇小分子進(jìn)行質(zhì)子化、計(jì)算電荷等處理，并檢測(cè)出小分子可旋轉(zhuǎn)鍵(見(jiàn)圖3)。

圖3 (a)赤霉素GA3，(b)甜菊醇和(c)異甜菊醇小分子可旋轉(zhuǎn)鍵

1.2.2 受體預(yù)處理

用AutoDock Tools軟件在PMV導(dǎo)入GID1受體蛋白，打開(kāi)GID1分子，確認(rèn)其加氫、電荷計(jì)算、質(zhì)子化狀態(tài)，進(jìn)行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義，并保存為pdbqt文件。

1.3 對(duì)接

根據(jù)赤霉素與GID1結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)置對(duì)接參數(shù)：

receptor = D:AutoDockprotein.pdbqt(受體蛋白文件位置)-> ligand = D:AutoDockligand.pdbqt(赤霉素分子文件位置)->out = all.pdbqt(輸出格式為pdbqt)->center_x = 52.855 center_y = 58.616 center_z = 39.571(設(shè)置對(duì)接中心坐標(biāo))->size_x = 20 size_y = 20 size_z = 20(設(shè)置對(duì)接區(qū)域)->energy_range = 4(運(yùn)算結(jié)果最大結(jié)合能之差)->exhaustiveness = 15(運(yùn)算精度)->num_modes = 10(顯示結(jié)果數(shù))，保存為config.txt，之后運(yùn)用程序語(yǔ)(“D:AutoDockGID1vina.exe” --receptor protein.pdbqt --ligand ligand.pdbqt --config config.txt --log log.txt --out out.pdbqt)進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照物GA3與GID1配體蛋白的對(duì)接驗(yàn)證

利用分子對(duì)接軟件AutoDock Vina構(gòu)建對(duì)照物GA3與GID1酶的對(duì)接模型，確定并驗(yàn)證該條件的準(zhǔn)確性。圖4展示了對(duì)照物GA3與GID1酶的對(duì)接模式和氫鍵相互作用。

(A1)GA3與GID1蛋白結(jié)合區(qū)，(A2)GA3與GID1蛋白口袋 ，(A3)GA3與GID1蛋白相互作用圖4 GA3與GID1的分子對(duì)接效果圖

對(duì)照物GA3與GID1的分子對(duì)接用AutoDock分子對(duì)接軟件，對(duì)接結(jié)合能最小為 -11.10 kcal/mol， 其均方根偏差refRMS值為1.36，一般refRMS值小于2就可認(rèn)為小分子與蛋白質(zhì)受體是有效對(duì)接[22]。由圖4可見(jiàn)，對(duì)照物GA3與GID1酶能很好地結(jié)合，說(shuō)明參數(shù)設(shè)置合適。把對(duì)接結(jié)果用可視化軟件PyMol進(jìn)行分析，結(jié)果顯示配體作用位點(diǎn)具體為：ILE2-4，PHE-27，LYS-28，TYR-31，ARG-35，GLY-114，GLY-115，SER-116，ILE-126，TYR-127，ASP-190，SER-191，PHE-238，VAL-239，THR-240，ASP-243，ARG-244，TYR-247，VAL-319，GLY-320，TYR-322和LEU-323，其中與SER-116，TYR-127，SER-191和PHE-238作用位點(diǎn)形成氫鍵作用。由此可見(jiàn)，對(duì)照物GA3與GID1的主要作用力是范德華力和氫鍵作用。

2.2 甜菊醇、異甜菊醇與GID1配體蛋白的對(duì)接結(jié)果

為了進(jìn)一步確定甜菊醇、異甜菊醇與GID1蛋白受體的結(jié)合情況，分析甜菊醇、異甜菊醇與GID1蛋白配體結(jié)合的本質(zhì)，分別進(jìn)行分子對(duì)接分析。經(jīng)AutoDock Vina運(yùn)算分析，采用半柔性對(duì)接方法，選擇結(jié)合自由能最低的構(gòu)象進(jìn)行后續(xù)分析，得到甜菊醇、異甜菊醇與GID1蛋白受體的最佳復(fù)合結(jié)果。

圖5為甜菊醇與GID1蛋白受體對(duì)接結(jié)果，表明其結(jié)合位點(diǎn)的位置。B1可看到結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，B2半透明區(qū)域表明甜菊醇進(jìn)入GID1蛋白受體內(nèi)部活性口袋，B3表示甜菊醇與GID1蛋白受體殘基的相互作用。由圖5甜菊醇與GID1蛋白受體對(duì)接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛋白活性中心點(diǎn)氨基酸殘基中，ILE-24，PHE-27，PHE-28，TYR-31，ARG-35，GLY-114，GLY-115，SER-116，TYR-127，SER-191，PHE-238，VAL-239，THR-240，ASP-243，ARG-244，TYR-247，VAL-319，GLY-320，TYR-322和LEU-323氨基酸殘基最容易與甜菊醇配體相互作用，其中與蛋白受體PHE-238形成氫鍵。這些位于GID1蛋白受體的功能域內(nèi)氨基酸均與甜菊醇相互作用形成氫鍵、范德華力等作用力，對(duì)接結(jié)合能最小為 -10.81 kcal/mol，對(duì)于GID1蛋白受體的抑制活性有著重要的作用。

(B1)Steviol與GID1蛋白結(jié)合區(qū)，(B2)Steviol與GID1蛋白口袋，(B3)Steviol與GID1蛋白相互作用圖5 甜菊醇與GID1的分子對(duì)接效果圖

由圖6異甜菊醇與GID1蛋白受體對(duì)接效果圖發(fā)現(xiàn)，異甜菊醇能與GID1蛋白受體結(jié)合，并可以進(jìn)入GID1蛋白受體蛋白內(nèi)部，與溶劑等形成活性包裹口袋，能與GID1蛋白受體氨基酸形成氫鍵。圖6中C2表明異甜菊醇與GID1蛋白受體活性中心點(diǎn)ILE-24，PHE-27，LYS-28，TYR-31，ARG-35，GLY-114，GLY-115，SER-116，TYR-127，SER-191，PHE-238，VAL-239，THR-240，ASP-243，ARG-244，TYR-247，VAL-319，GLY-320，TYR-322和LEU-323氨基酸殘基相互作用，其中與蛋白受體ARG-35，GLY-115，TYR-127和SER-191形成氫鍵，這些氨基酸殘基均與異甜菊醇相互作用，形成氫鍵、范德華力等作用力，對(duì)接結(jié)合能最小為 -11.26 kcal/mol。在分子對(duì)接中，配體構(gòu)象的結(jié)合自由能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)受體結(jié)合的親和力就越強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)受體可能具有的抑制活性越強(qiáng)[23]。說(shuō)明異甜菊醇對(duì)GID1蛋白的活性抑制超過(guò)了GA3的活性，與劉秀芳等[13]研究結(jié)果一致。

(C1)Isosteviol與GID1蛋白結(jié)合區(qū) ，(C2)Isosteviol與GID1蛋白口袋 ，(C3)Isosteviol與GID1蛋白相互作用圖6 異甜菊醇與GID1的分子對(duì)接效果圖

3 結(jié)論

植物化學(xué)“生源的異戊二烯法則”研究表明，赤霉素和甜菊糖都來(lái)自于同一代謝通路[24]，二者結(jié)構(gòu)相似，都屬于萜類。甜菊醇與異甜菊醇是也是甜葉菊糖在動(dòng)物腸道中自然代謝產(chǎn)物[25]，其安全性已被人們廣泛接受和了解，但其在植物赤霉素作用靶點(diǎn)GID1蛋白的作用機(jī)理方面目前尚不明確。本研究以GA3為對(duì)照物，以甜菊醇、異甜菊醇與GID1的相互作用為研究對(duì)象，分析其作為安全的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的可能性。

AutoDock Vina分子對(duì)接結(jié)果表明，赤霉素、甜菊醇和異甜菊醇與赤霉素受體GID1蛋白的相互作用主要是形成氫鍵作用、范德華力等，主要作用基團(tuán)為羥基，結(jié)合自由能分別為-11.10 kcal/mol，-10.81 kcal/mol和-11.26 kcal/mol，說(shuō)明甜菊醇和異甜菊醇兩種小分子都能與赤霉素受體GID1蛋白形成穩(wěn)定結(jié)合，且異甜菊醇的作用效果強(qiáng)于赤霉素GA3。分子對(duì)接技術(shù)依賴于信息科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)接結(jié)果可能有偏差或者假陽(yáng)性[26]，結(jié)果僅作為參考，是否真正有效還需通過(guò)后續(xù)實(shí)際驗(yàn)證。