貝伐單抗通過抑制mTOR通路對卵巢癌腹水模型裸鼠的改善作用

張竣，周敏，王海雅，劉俊麗

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，西安 710061)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，致死率居各類婦科腫瘤的首位[1]。卵巢癌進(jìn)展至中晚期時可發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移，此時淋巴系統(tǒng)受到癌細(xì)胞的侵犯導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在淋巴管中繁衍、生長，從而阻塞淋巴管回流，造成腹腔內(nèi)大量淋巴組織滲出，形成腹水[2]。因此，腹水是卵巢癌患者直接且重要的臨床表現(xiàn)。貝伐單抗是重組人源化單克隆抗體，能與人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)特異性結(jié)合并阻斷其生物活性，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[3]。目前，臨床已將貝伐單抗應(yīng)用于結(jié)直腸癌、肺癌等惡性腫瘤的輔助治療[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌腹水的形成及腹水量與VEGF水平異常有關(guān)，推測貝伐單抗對卵巢癌腹水有良好的改善作用[6]。但貝伐單抗改善卵巢癌腹水作用機(jī)制的報道較少。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖的蛋白激酶，mTOR信號通路調(diào)控異常與多種腫瘤的形成、增殖及惡化密切相關(guān)，當(dāng)mTOR信號通路被激活時，其直接底物真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E binding protein 1，4E-BP1)發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致磷酸化4E-BP1(phosphorylation-4E-BP1，p-4E-BP1)表達(dá)增加，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[7]。本研究主要分析貝伐單抗通過抑制mTOR通路對卵巢癌腹水模型裸鼠的改善作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 40只無特定病原體級8周齡雌性BALB/c裸鼠，體重19～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證:SCXK2017-0011)。卵巢癌細(xì)胞HO-8910購自上海奧陸生物科技有限公司，mTOR購自上海澤葉生物科技有限公司(批號:20180508)、3-芐基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁內(nèi)酯(3-benzyl-5-(2-nitrophenoxymethyl)-γ-butyrolactone，3BDO)購自美國MedChemExpress LLC公司(批號:20180724)，貝伐單抗購自上海麥克林生化科技有限公司(純度≥95%，批號:20170928)，磷酸鹽緩沖液購自北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司(批號：0111261)，Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween(Tris buffer saline+Tween，TBST)購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司(批號：150418-1)，0.25%胰酶購自上?；鄯f生物科技有限公司(批號：1297729)，胎牛血清購自沃卡威(北京)生物技術(shù)有限公司(批號：10099-141)，杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基購自深圳子科生物科技有限公司(批號：12322-1)，550型全自動酶標(biāo)儀購自上海坤科儀器設(shè)備有限公司，蘇木精-伊紅染液及試劑盒購自上海西格生物科技有限公司(批號：10615-19)，伊文思藍(lán)染色液購自北京索萊寶科技有限公司(批號：1161546)，RNA提取試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司(批號：7490411)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)內(nèi)參購自北京百奧萊博科技有限公司(批號:20180624)，mTOR(批號:201800513)、磷酸化mTOR(phosphorylation-mTOR，p-mTOR)(批號:20170723)及4E-BP1(批號:20170915)、p-4E-BP1(批號:20180525)一抗、二抗購自美國CST公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌細(xì)胞HO-8910置于10%胎牛血清的杜爾貝科改良伊格爾高糖培養(yǎng)基，并于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，3～5 d傳代1次。待細(xì)胞貼壁生長約80%融合度后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行0.25%胰酶消化，以離心半徑12 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖液重懸。

1.3卵巢癌腹水裸鼠模型的構(gòu)建及分組 所有裸鼠均腹腔接種卵巢癌細(xì)胞HO-8910，將200 μL注射于40只裸鼠腹腔內(nèi)(每只3×106個細(xì)胞)，2周后裸鼠出現(xiàn)腹部膨隆、活動減少、厭食等癥狀提示腹水形成[8]。40只裸鼠建模成功36只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，各12只，模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液，3BDO+貝伐單抗組給予0.1 nmol/L 3BDO+5 mg/kg貝伐單抗，貝伐單抗組給予5 mg/kg貝伐單抗，各組均采用腹腔注射給藥，連續(xù)給藥28 d后以頸椎脫臼法處死。

1.4腹水平均體積及腹膜滲透性的檢測 給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6只裸鼠處死，采用無菌注射器收集腹水，計算各組腹水平均體積。每組剩余6只裸鼠用于腹膜滲透性的檢測：0.25 mL 5%伊文思藍(lán)染色液緩慢注射于裸鼠尾靜脈，2 h后處死裸鼠并將收集的腹水離心，以酶標(biāo)儀540 nm檢測上清液伊文思藍(lán)的吸光度，分析腹膜滲透性的D(λ)值。

1.5觀察腫瘤組織病理改變 切取腹膜腔內(nèi)部分腫瘤組織置于10%甲醛溶液固定，經(jīng)洗滌、脫水、透明后的組織塊用石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，封存。觀察各組腫瘤組織病理改變情況，并使用顯微相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.6mTOR、4E-BP1 信使RNA(messenger RNA，mRNA)表達(dá)檢測 采用Trizol法提取腫瘤組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA，再以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的基因，設(shè)計GAPDH為內(nèi)參基因。mTOR基因上游引物序列：5′-GGCTACTTGACTCGTTAGAGTC-3′，下游引物：5′-CCTAGGTCACACGTGTCACTTGAG-3′，長度317 bp。4E-BP1基因上游引物序列：5′-ACCAGGTACTTACGGTCGTC-3′，下游引物：5′-TACACTTCACAGGCTAAC-3′，長度289 bp。GAPDH內(nèi)參基因上游引物序列：5′-AGCCTTAACGGTCATCACTGTA-3′，下游引物：5′-GCAATCGCTTGCCACAGTGACCTG-3′，長度265 bp。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，重復(fù)40個循環(huán)。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物以90 V電泳30 min，凝膠成像儀拍照記錄，mTOR/GAPDH、4E-BP1/GAPDH表示mRNA相對表達(dá)量。

1.7蛋白免疫印跡法檢測mTOR、p-mTOR和4E-BP1、p-4E-BP1的表達(dá) 收集各組腫瘤組織，裂解后提取總蛋白，蛋白質(zhì)定量法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，膜置于5%脫脂奶粉配制的TBST液中室溫封閉1 h后，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜。取出膜并用TBST緩沖液洗膜3次后加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，再次用TBST緩沖液洗膜3次，以化學(xué)發(fā)光法檢測。顯色后曝光顯影，拍照，Image J分析灰度值，目的蛋白與GAPDH灰度值的比值為相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.13組腹水平均體積及腹膜滲透性比較 28 d給藥后36只裸鼠均存活。3組腹水平均體積及腹膜滲透性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，3BDO+貝伐單抗組和貝伐單抗組腹水平均體積減小、腹膜滲透性降低(P<0.05)；與3BDO+貝伐單抗組比較，貝伐單抗組腹水平均體積減小、腹膜滲透性降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組雌性卵巢癌腹水模型裸鼠腹水平均體積及腹膜滲透性比較

2.23組腫瘤組織病理改變情況 蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察，模型組可見腫瘤細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞核明顯增大，核仁深染；3BDO+貝伐單抗組可見部分腫瘤細(xì)胞皺縮減小，核分裂象減少，且有小片狀壞死區(qū)；貝伐單抗組腫瘤組織內(nèi)可見凋亡小體以及片狀壞死區(qū)，腫瘤細(xì)胞殘存小巢狀腫瘤細(xì)胞。見圖1。

圖1 3組雌性卵巢癌腹水模型裸鼠腫瘤組織病理改變情況(蘇木精-伊紅染色，×400)

2.33組雌性大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 3組p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，3BDO+貝伐單抗組和貝伐單抗組p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1均降低(P<0.05)；與3BDO+貝伐單抗組比較，貝伐單抗組p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1均降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 3組雌性卵巢癌腹水模型裸鼠p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1比較

4E結(jié)合蛋白1；p-4E-BP1：磷酸化4E-BP1；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；p-mTOR：磷酸化mTOR；4E-BP1：GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶；3BDO：3-芐基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁內(nèi)酯

2.43組雌性大鼠mTOR、4E-BP1 mRNA表達(dá)情況比較 3組mTOR、4E-BP1 mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，3BDO+貝伐單抗組和貝伐單抗組mTOR mRNA、4E-BP1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與3BDO+貝伐單抗組比較，貝伐單抗組mTOR mRNA、4E-BP1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組雌性卵巢癌腹水模型裸鼠mTOR、4E-BP1 mRNA表達(dá)情況比較

3 討 論

腹膜內(nèi)擴(kuò)散和腹水是中晚期卵巢癌的主要特征，且腹水常伴有腹部壓力升高，進(jìn)而出現(xiàn)腹脹、消化不良、厭食等，若腹水量多向上擠壓橫膈肌則可出現(xiàn)胸悶、呼吸困難、心慌等，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和生存時間[9-10]。腹水的產(chǎn)生與VEGF關(guān)系密切，VEGF與其受體VEGF1/2相互作用后可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤組織中新生血管生成，增加血管通透性，形成惡性積液[11-12]。目前針對卵巢癌的輔助治療仍以化療為首選，但卵巢癌的高復(fù)發(fā)率以及對鉑類藥物產(chǎn)生的耐藥性成為治療難點(diǎn)[13]。貝伐單抗是臨床阻斷VEGF及其受體作用的常用靶向藥物之一，其在多種癌癥的一線治療、鉑敏感復(fù)發(fā)及鉑耐藥復(fù)發(fā)治療中均有較高的臨床價值[14]。

劉端等[15]通過檢測卵巢癌組織中VEGF及其下游信號通路蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)中貝伐單抗可抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖，并具有劑量依賴性，同時貝伐單抗可通過調(diào)控VEGF的下游信號通路以及基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)水平發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，貝伐單抗組和3BDO+貝伐單抗組腹水平均體積均較模型組減少、腹膜滲透性均較模型組降低，且貝伐單抗組腹水平均體積最少、腹膜滲透性最低，表明貝伐單抗能減少裸鼠腹水量，調(diào)節(jié)腹膜滲透性，有效改善裸鼠腹水情況。本研究對腫瘤組織蘇木精-伊紅染色觀察發(fā)現(xiàn)，模型組腫瘤細(xì)胞核大深染，3BDO+貝伐單抗組部分腫瘤細(xì)胞皺縮且有小片狀壞死區(qū)，貝伐單抗組腫瘤組織內(nèi)則可見凋亡小體以及片狀壞死區(qū)，表明貝伐單抗能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡。以上研究結(jié)果提示，貝伐單抗改善裸鼠腹水、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用可能與抑制mTOR通路有關(guān)。

mTOR是一類進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、能量代謝等[16]。mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路的下游靶基因，當(dāng)促腫瘤形成蛋白PI3K和Akt表達(dá)增加時，mTOR信號通路不斷被激活，同時mTOR的直接底物4E-BP1不斷被上游信號通路磷酸化，p-4E-BP1表達(dá)增加可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[17-18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，約12%的卵巢癌患者顯示出有PI3K/Akt/mTOR信號通路失控的現(xiàn)象，其中大部分患者為mTOR通路異常激活[19]。Zhou等[20]通過給予卵巢癌細(xì)胞不同濃度的丹參酮處理，并測定PI3K/Akt/mTOR通路蛋白水平發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR通路失活可誘導(dǎo)卵巢癌凋亡、自噬，進(jìn)一步抑制腫瘤生長。在本研究結(jié)果中，模型組、3BDO+貝伐單抗組和貝伐單抗組的mTOR mRNA、4E-BP1 mRNA表達(dá)、p-mTOR/mTOR、p-4E-BP1/4E-BP1依次降低，說明mTOR激活劑可弱化貝伐單抗對卵巢癌細(xì)胞的抑制作用，提示貝伐單抗可抑制mTOR信號通路產(chǎn)生，同時上調(diào)4E-BP1表達(dá)，減少p-4E-BP1。此外，mTOR信號通路可能參與PI3K/Akt調(diào)節(jié)VEGF的過程，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中抑制PI3K可減少p-Akt和p-mTOR，降低VEGF水平[21-22]。因此，貝伐單抗可能通過抑制mTOR信號通路對卵巢癌腹水模型裸鼠發(fā)揮作用。

綜上所述，貝伐單抗能有效減少卵巢癌腹水模型裸鼠的腹水量，調(diào)節(jié)腹膜滲透性，其作用機(jī)制可能與抑制mTOR信號通路、減少腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲有關(guān)。