消瘀泄?jié)犸媽蝹容斈蚬芄Ｗ璐笫竽I小管上皮-間質轉分化及PAR-3表達的影響

夏璁 葉晴晴 楊利利 何靈芝

1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.杭州師范大學附屬醫(yī)院

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是指因各種腎臟內或者腎臟外因素導致的腎臟損傷，并且持續(xù)3個月以上。隨著我國社會和經濟的發(fā)展，人群中高血壓病、糖尿病、動脈硬化等疾病的發(fā)病率不斷升高，CKD的發(fā)生率也在逐年增長[1]。橫斷面研究顯示，我國成年人CKD的患病率高達10.8%[2]。目前CKD已經成為影響人類健康、加重社會經濟負擔的重大疾病，防治任務十分艱巨[3]。

腎小管間質纖維化是各種CKD病程進展的必然結果[4]。目前認為，腎小管上皮細胞發(fā)生上皮-間質轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎小管間質纖維化發(fā)展過程中的一個重要步驟和關鍵機制[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）動物模型中，EMT的重要標志上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達減弱，而間充質細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）表達增強[6]。 同時，細胞連接的破壞和細胞極性的喪失也是EMT的重要特征[7]。 極性蛋白-3（partitioning defective-3，PAR-3）是一種細胞極性蛋白，對維持上皮細胞極性起到關鍵作用[8]。因此，通過調節(jié)上皮細胞極性蛋白表達，阻止或逆轉EMT可能減輕腎臟纖維化，延緩CKD病程進展，但現(xiàn)階段臨床上尚缺乏相應的有效藥物。

消瘀泄?jié)犸嬍菄壹壝嗅t(yī)李學銘教授通過長期臨床實踐而創(chuàng)立的經驗方，在臨床上廣泛用于慢性腎衰竭的治療，具有抗炎、調節(jié)免疫、改善腎功能的作用[9-10]，但其對腎功能的保護作用及機制仍需進一步探討。本研究擬通過觀察消瘀泄?jié)犸媽UO大鼠PAR-3以及E-cadherin、α-SMA表達的影響，探討消瘀泄?jié)犸媽δI間質纖維化防治的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性SD大鼠40只，10周齡，平均體質量（300±20）g，均購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]，大鼠自由飲水和進食，12h交替照明。本研究方案獲浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理與倫理委員會批準（倫理審批號：IACUC-20190715-03）。

1.1.2 主要藥品和試劑 消瘀泄?jié)犸嬘缮S芪30 g、制大黃10 g、川牛膝10 g、地龍10 g、桃仁10 g、車前草20 g、貓爪草10 g組成，所有中藥飲片由浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥房提供，各味中藥煎煮濃縮成濃度為1.04 g·mL-1的消瘀泄?jié)犸嬎幰?，滅菌處理后?℃保存?zhèn)溆?；鹽酸貝那普利片由北京諾華制藥有限公司生產（商品名：洛丁新，規(guī)格：10 mg/片，批號：國藥準字H20030514）；E-cadherin抗體、抗α-SMA抗體、PAR-3抗體均購于英國Abcam公司（批號：ab1416、ab7817、ab64646）； 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG、抗β-actin抗體均購于蘭杰柯科技有限公司 （批號：BL033A、BL003A、BL001A、BL005B）。

1.1.3 主要儀器 7020型全自動生化分析儀為日本日立公司產品；Nikon Eclipse Ti-SR倒置熒光顯微鏡為日本尼康公司產品；JB-P5包埋機為武漢俊杰電子有限公司產品；RM2016病理切片機為上海徠卡儀器有限公司產品；KD-P組織攤片機購于浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；GT1001免疫組化筆購于基因科技（上海）股份有限公司；G:BOX F3凝膠成像系統(tǒng)購于美國Syngene公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組、模型（UUO）組、中藥（消瘀泄?jié)犸嫞┙M、西藥（貝那普利）組，每組均10只。以3%戊巴比妥鈉45 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，模型組和中藥組、西藥組行左輸尿管結扎術，方法按照參考文獻[11]；假手術組僅行左側輸尿管分離，未行結扎。

1.2.2 給藥方法 從術后1 d起，中藥組和西藥組每天分別給予消瘀泄?jié)犸嬎幰汉望}酸貝那普利溶液灌胃，給藥劑量根據(jù)人與大鼠體表面積的轉換系數(shù)6.25換算而得，消瘀泄?jié)犸嬘盟幜繛?0.4 g/（kg·d），鹽酸貝那普利用藥量為1 mg/（kg·d），灌胃劑量均為10 mL/kg；假手術組和模型組以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.2.3 標本收集 連續(xù)灌胃4周后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心后-20℃保存待檢。處死所有大鼠，剖取左側腎臟，剝離包膜，部分腎組織以10%中性甲醛溶液固定，其余部分腎組織快速液氮冷凍，-80℃保存待檢。

1.2.4 生化指標檢測 采用全自動生化分析儀檢測血清白蛋白（albumin， ALB）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿酸（uric acid，UA）水平。

1.2.5 組織病理學檢查 中性甲醛固定的腎組織經脫水、透明、包埋、切片后，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及Masson染色，光鏡下觀察腎小管間質的組織病理改變。HE染色后，在200倍光鏡下每張切片隨機選取5個不重復視野，計算腎小管間質損傷指數(shù)。腎小管間質損傷評分標準：0分：正常腎小管，間質無炎性細胞及纖維組織增生；1分：腎小管上皮細胞萎縮，間質少量炎性細胞浸潤，纖維組織增生，病變面積＜25%；2分：間質炎性細胞浸潤與纖維化面積25%～50%；3分：病變面積＞50%。計算每張切片的評分并得出平均值，作為腎小管間質損傷指數(shù)評分。Masson染色后，在200倍光鏡下每張切片隨機選取5個不重復的腎小管間質視野，注意避開腎小球和大血管，以腎間質內藍染區(qū)為目標，采用Image J軟件評估膠原纖維沉積程度，腎間質纖維化相對面積（%）=膠原染色面積/總面積×100%。

1.2.6 免疫熒光及免疫組化檢測

1.2.6.1 免疫熒光檢測 經過烤片、脫蠟、熱修復后，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）洗滌，5%牛血清白蛋白溶液（bovine serum albumin，BSA）封閉后滴加PAR-3一抗（稀釋比例：1∶100），4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加FITC標記的山羊抗兔二抗，室溫下避光孵育2 h，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色后避光室溫孵育10 min，PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.2.6.2 免疫組化檢測 烤片、脫蠟，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑20 min后熱修復，5% BSA封閉20 min，分別滴加抗E-cadherin抗體（稀釋比例：1∶10） 和抗α-SMA抗體（稀釋比例：1∶10），孵育過夜后滴加HRP標記的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育40 min，3，3-二氨基苯聯(lián)胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素染核，脫水，透明，以Image J軟件定量分析陽性面積所占比例。

1.2.7 免疫印跡法檢測 使用裂解液裂解腎組織，提取總蛋白，以二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）法測定蛋白質濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳 （sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。 5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入PAR-3一抗（稀釋比例：1∶1 000），4℃孵育過夜。洗膜后加入HRP標記的二抗，孵育1h后洗滌3次，用化學發(fā)光劑顯影曝光條帶。以β-actin作為內參，以Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。采用GraphPad Prism 7.0軟件進行繪圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 假手術組大鼠實驗期間一般情況無明顯異常；與假手術組比較，模型組大鼠活動量明顯減少，飲食減少，精神萎靡，毛發(fā)干枯、脫落，缺少光澤；中藥組及西藥組大鼠一般情況較模型組有所改善。

2.2 各組大鼠生化指標比較 各組間總體比較，BUN、Scr、UA水平差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；與假手術組比較，模型組、西藥組、中藥組BUN、Scr、UA水平均增高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組BUN、Scr、UA水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組Scr、UA水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。各組間ALB水平比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠生化指標比較（±s）Tab.1 Comparison of biochemical indexes in each group（±s）

表1 各組大鼠生化指標比較（±s）Tab.1 Comparison of biochemical indexes in each group（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。Note:Compared with sham operation group， *P＜0.05;compared with model group， #P＜0.05;compared with western medicine group， △P＜0.05.

組別 ALB（g·L-1） BUN（mmol·L-1） Scr（μmol·L-1） UA（μmol·L-1）假手術組 23.70±1.37 4.33±0.47 32.68±1.06 76.19±9.14模型組 23.06±2.21 6.38±0.39* 45.38±4.40* 199.22±33.84*西藥組 23.64±1.39 6.14±0.42* 43.18±4.99* 173.07±22.05*中藥組 23.43±2.90 5.72±0.81*# 38.26±2.69*#△ 111.46±23.56*#△F值 0.191 27.773 24.171 55.732 P 值 ＞0.05 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 各組大鼠腎組織病理學變化比較 HE染色顯示，假手術組腎小管間質形態(tài)正常；模型組可見腎小管上皮細胞空泡變性、萎縮、脫落，腎間質擴張，腎小管管腔增大，炎性細胞浸潤及纖維化；西藥組和中藥組腎間質病變、腎小管損傷均有不同程度的改善，炎性細胞浸潤相對減少。模型組腎小管間質損傷指數(shù)高于假手術組，而西藥組、中藥組腎小管間質損傷指數(shù)低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1、2。Masson染色可見模型組大鼠腎小管間質內膠原纖維化形成；模型組腎間質纖維化相對面積高于假手術組，而西藥組、中藥組大鼠腎間質纖維化相對面積均低于模型組（P＜0.05）。 見圖3、4。

圖1 大鼠腎組織病理改變（HE染色，200×）Fig.1 Morphological changes of renal tissues in each group （HE staining， 200×）

圖2 大鼠腎組織腎小管間質損傷指數(shù)Fig.2 Renal tubular interstitial injury index of renal tissues in each group

圖3 大鼠腎組織病理改變（Masson染色，200×）Fig.3 Morphological changes of renal tissues in each group（Masson staining， 200×）

圖4 大鼠腎組織腎間質纖維化相對面積Fig.4 Collagen positive area of renal tissues in each group

2.4 各組大鼠腎組織PAR-3表達比較 免疫熒光結果顯示，腎組織PAR-3主要表達于腎小管上皮細胞及腎間質，與假手術組比較，模型組及西藥組、中藥組大鼠腎組織PAR-3表達下降，而中藥組大鼠腎組織PAR-3表達較模型組有所升高。見圖5。免疫印跡法結果顯示，與假手術組比較，其余各組腎組織PAR-3表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組腎組織PAR-3表達升高（P＜0.05）。 見圖6。

圖5 各組大鼠腎臟組織PAR-3表達（200×）Fig.5 Comparison of immunof luorescent PAR-3 expression in renal tissues in each group（200×）

圖6 各組大鼠腎組織PAR-3蛋白表達的比較Fig.6 Comparison of PAR-3 protein expression in renal tissues in each group

2.5 各組大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達比較 免疫組化結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腎組織α-SMA表達增加，E-cadherin表達減少（均P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、中藥組大鼠腎組織α-SMA表達減少，E-cadherin表達增加 （均P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組E-cadherin表達增高（P＜0.05）；α-SMA蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 各組大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin表達的比較（200×）Fig.7 Comparison of immunohistochemical α-SMA， E-cadherin expression in renal tissues in each group（200×）

3 討論

腎小管間質纖維化是導致各種CKD進展至終末期的共同機制[12]。腎小管間質纖維化的最主要特點是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度沉積[4，13]。 ECM主要由活化的肌成纖維細胞產生[14]。目前認為，上皮-間質的動態(tài)平衡是維持腎小管間質微環(huán)境穩(wěn)定的重要影響因素，肌成纖維細胞可來源于上皮細胞的轉分化[15-16]。既往研究證實，腎小管上皮細胞可通過EMT或者部分上皮-間質轉分化（partial EMT，pEMT）發(fā)生表型轉化，表達肌成纖維細胞標志物，如α-SMA和Vimentin等，從而介導炎癥和腎小管間質纖維化的發(fā)生[17-18]。通過抑制腎臟EMT進程，可以改善或者逆轉腎小管間質纖維化[17，19]。

細胞連接的破壞和細胞極性的喪失是EMT的始動環(huán)節(jié)，對EMT起到關鍵性的作用[7]。上皮細胞極性的建立和維持是通過三種極性復合物（PAR復合物、Crumbs復合物和Scribble復合物）之間的相互作用，以及對細胞骨架和細胞間連接的調節(jié)來實現(xiàn)的[20]。緊密連接是上皮細胞之間的一種重要的連接復合體，對維持細胞極性起到重要作用[21]。PAR復合物是緊密連接的重要組成部分，是調節(jié)細胞極性的中心環(huán)節(jié)。作為一種進化高度保守的極性調控復合物，PAR復合物由PAR-3、PAR-6和非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）三種成分組成[22]，通過與跨膜蛋白相互作用，固定于細胞膜的緊密連接處[23]。在上皮細胞極性建立過程中，PAR-3基因突變會導致細胞極性異常[24]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物上皮細胞內PAR-3表達降低可導致緊密連接的破壞[25]。PAR-3基因敲除可導致犬腎（Madin-Darby Canine Kidney，MDCK）細胞間的連接缺失，而野生型PAR-3可有效修復PAR-3敲除細胞中的缺陷[26]。大鼠腎小管上皮細胞實驗證實，轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能夠通過下調PAR-3蛋白表達，促進EMT；而轉染PAR-3則可顯著抑制TGF-β1誘導的EMT[27]?；谏鲜鲅芯拷Y果，筆者推測PAR-3在EMT過程中可起到保護性作用。

現(xiàn)代中醫(yī)理論認為，在CKD的發(fā)展過程中，瘀血起了極為重要的作用[28]。消瘀泄?jié)犸嬘苫钛雒健把a陽還五湯”加減化裁而來，在臨床上廣泛應用于慢性腎衰竭氣虛夾瘀證的治療，具有改善臨床癥狀、延緩腎功能進展的作用[29]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，消瘀泄?jié)犸嬁梢种颇I小管間質纖維化大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA的表達，起到抗腎小管間質纖維化的作用[30-31]。

本研究通過建立UUO模型，證實腎小管間質纖維化大鼠存在EMT，腎小管上皮細胞黏附分子E-cadherin表達下降，并表達間充質細胞標志物α-SMA。經過鹽酸貝那普利及消瘀泄?jié)犸嬛委熀螅I功能指標、腎小管間質纖維化程度均有不同程度改善，與前期研究[30-31]一致。與陽性對照藥物鹽酸貝那普利比較，消瘀泄?jié)犸嬐ㄟ^上調腎組織E-cadherin表達，下調α-SMA表達，從而逆轉EMT的作用相似。為進一步明確消瘀泄?jié)犸嬆孓D腎小管間質纖維化的具體作用機制，本研究進一步檢測了PAR-3在UUO大鼠腎組織內的表達。結果顯示，腎間質纖維化大鼠腎組織PAR-3表達降低，消瘀泄?jié)犸嬁梢欢ǔ潭壬险{PAR-3表達。

綜上所述，本研究表明消瘀泄?jié)犸嬁赏ㄟ^上調腎組織極性蛋白PAR-3表達，逆轉EMT進程，從而發(fā)揮抗腎纖維化、改善腎功能的作用。