小黃魚figlα 基因的克隆及其在性腺中的表達分析

李冰冰，謝慶平，樓 寶，魏福亮，蔚 敏，詹 煒，劉 峰

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究所，浙江杭州 310021）

figlα（figlalpha）基因是卵母細胞特異性基因，它是堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）家族中的一員，最初是通過參與編碼糖蛋白（Zp1，Zp2 和Zp3）基因的協(xié)調(diào)表達而被發(fā)現(xiàn)的，其對動物的生殖發(fā)育調(diào)控起著重要的作用[1]。bHLH 結(jié)構(gòu)域是一種特殊的DNA 結(jié)構(gòu)蛋白，通常以二聚體的形式與DNA 上E-box 序列結(jié)合，進而參與發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄功能[2]。bHLH 家族成員可調(diào)控許多發(fā)育和代謝過程，包括性別決定、細胞分化等[3-4]。目前，figlα 基因已在許多動物中得到研究，如智人Homo sapiens、小鼠、牛、魚、中華鱉Trionyx sinensis 等[5-10]。figlα 基因是第一個被發(fā)現(xiàn)能夠影響原始生殖細胞卵泡形成的轉(zhuǎn)錄因子之一，其在大多數(shù)脊椎動物的卵泡形成及卵巢的發(fā)育和分化中起著重要作用[5-6,11]。卵巢組織最基本的組成單位是原始卵泡，原始卵泡的正常發(fā)育將直接影響卵巢的繁育功能，figlα 基因的缺失會導(dǎo)致原始卵泡的殘缺和卵母細胞的大量損失[6]。在小鼠中，figlα 基因突變破壞了雌性小鼠的卵泡發(fā)育，并導(dǎo)致不育[6,11]，figlα 基因的敲除使其不能形成原始卵泡，且出生后卵母細胞迅速消失，但雄性性腺則不受影響[6]。在人類中，figlα 基因突變導(dǎo)致卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）[12-13]、不孕等[2,14]。因此，figlα 基因在動物的卵巢發(fā)育及卵子發(fā)生過程及性別分化中起著重要的調(diào)控作用。

在硬骨魚類中，figlα 基因?qū)β殉?卵母細胞的分化也起到至關(guān)重要的作用，如黑鯛Acanthopagrus schlegeli、斑馬魚Danio rerio、青鳉Oryzias latipes、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus 等[9,15-17]。其中，斑馬魚時空表達結(jié)果顯示，在10～20 dph（days post-hatching，dph）時，figlα 在卵巢和精巢中均無表達，但在成年斑馬魚中，figlα 在卵巢和精巢中特異性表達，而在其他組織中不表達。同時，原位雜交結(jié)果顯示，figlα 在斑馬魚26、60 和110 dph 時均檢測到信號，26 dph 時figlα 集中表達于分離良好的PN 卵母細胞的胞漿中，在60和110 dph 時，figlα 在初級生長期和卵黃發(fā)生前期的PN 卵母細胞表達量最多，尤其是在PG 期，但使用正義探針的對照組未觀察到任何信號[15]。然而，在羅非魚中，Real-time PCR 技術(shù)結(jié)果顯示，figlα 在羅非魚30 dph 時開始表達[17]。同時，與黑鯛和青鳉研究結(jié)果一致[9,16]，figlα 主要在羅非魚成魚的卵巢中表達，而在其他組織中幾乎不表達，免疫組化結(jié)果也與此一致，figlα 在90 和150 dph 羅非魚的卵巢早期初級卵母細胞中特異表達。此外，在尼羅羅非魚中，figlα 基因的過度表達導(dǎo)致精子發(fā)生受阻，進而促進卵巢發(fā)育[17]。因此，figlα 可能在卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

小黃魚Larimichthys polyactis，又名小鮮、黃花魚等。屬硬骨魚綱Osteichthyes、鱸形目Perciformes、石首魚科Sciaenidae、黃魚屬Larimichthys[18]。它不僅是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類，而且肉質(zhì)細嫩鮮美，營養(yǎng)價值很高，深受消費者喜愛，具有廣泛的養(yǎng)殖前景和市場開發(fā)潛力[19-20]。因此，國內(nèi)外學(xué)者對其開展了許多研究，研究領(lǐng)域主要涉及小黃魚種群劃分、生長繁殖、攝食習(xí)性等諸多方面[21-24]，但有關(guān)生殖發(fā)育的研究甚少。小黃魚已于2016 年成功實現(xiàn)了全人工繁育養(yǎng)殖[25-26]，最近的研究表明，小黃魚精巢在性別分化過程中經(jīng)歷了一個特殊的階段，即精巢在性腺發(fā)育早期（43～80 dph）出現(xiàn)了一個短暫的雌雄同體階段，出現(xiàn)卵母細胞，隨即便完全凋亡退化，而卵巢發(fā)育較為連續(xù)[27]。但卵母細胞在精巢中產(chǎn)生與凋亡的分子機制還不清楚，推測該階段的產(chǎn)生與卵母細胞分化因子figlα 有關(guān)。因此，本研究對小黃魚figlα 基因CDS 區(qū)進行克隆和序列分析，通過RT-PCR 方法檢測figlα 基因在小黃魚不同組織中的分布，并利用原位雜交探明小黃魚figlα在小黃魚卵巢、精巢及雌雄同體階段中的細胞定位。本研究既為figlα 基因在小黃魚卵巢卵母細胞發(fā)育和分化的調(diào)控機制及精巢特殊的雌雄同體階段產(chǎn)生的分子機制提供實驗數(shù)據(jù)，也豐富了硬骨魚類雌雄同體和雌雄異體進化方向及性別分化的理論。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究實驗用小黃魚于2020 年6 月至2020 年9 月取自浙江省寧波市象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司的養(yǎng)殖車間，隨機將約300 尾30 dph（平均體質(zhì)量0.17 g、體長2.01 cm）的小黃魚魚苗，飼養(yǎng)于容積為1 t 的深藍色、桶壁光滑的水桶中，每日2 次，定時、飽食。本實驗的水溫使用自然水溫，水溫的范圍為20.2～28.5 ℃，鹽度為22.4～25.2，供氧充足。為保持水桶的水質(zhì)，實驗中每天更換2 次60%～70%的水量，并每日觀察魚的狀況。分別對60 dph（平均體質(zhì)量3.08 g、體長5.5 cm）、90 dph（平均體質(zhì)量10.56 g、體長8.81 cm）和150 dph（平均體質(zhì)量15.15 g、體長10.35 cm）體質(zhì)良好的小黃魚隨機取樣，其中實驗用雌魚和雄魚分別為15 尾。

對隨機采集的小黃魚活體進行形態(tài)學(xué)指標的測量，隨后立即解剖，取出性腺，鑒定其性別，將同一尾魚的兩葉性腺分開保存，其中一葉性腺迅速放至液氮保存?zhèn)溆?，另外一葉性腺放入4%多聚甲醛（PFA）中固定過夜后，轉(zhuǎn)入焦碳酸二乙酯（DEPC）配制的70%乙醇中，用于石蠟切片原位雜交的實驗。此外，選取240 dph的小黃魚雌雄各6 尾分別進行卵巢、精巢、心臟、肝臟、肌肉、腎、皮膚、腦、眼、腸、鰓和脾組織的取樣，并迅速放至液氮用于總RNA 提取。隨機選取其中雌雄各1 尾進行組織分布檢驗，剩余樣品進行驗證。

1.2 總RNA 的提取及第一鏈cDNA 的合成

使用RNAiso Plus（TaKaRa，日本）試劑，按照說明書提取小黃魚卵巢、精巢、心臟、肝臟、肌肉、腎、皮膚、腦、眼、腸、鰓和脾組織的總RNA。并用超微量紫外可見分光光度計（NanoDrop2000，Thermo）檢測RNA 的濃度和質(zhì)量，使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測樣品總RNA 的純度及完整性，電泳條件為180V，15 min。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）說明書合成相應(yīng)的第一鏈cDNA，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小黃魚figlα CDS 擴增及克隆

小黃魚全基因組序列由北京諾禾致源科技股份有限公司測序獲得，根據(jù)小黃魚全基因組序列使用Snap Gene v4.1.9 軟件設(shè)計擴增引物Figlα-F 及Figlα-R（表1）。以反轉(zhuǎn)錄得到的小黃魚卵巢cDNA 樣本為模板，采用RT-PCR 方法擴增小黃魚figlα 基因全長CDS 區(qū)。PCR 擴增反應(yīng)體系（20 μL）為：ddH2O 8 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32 個循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，電泳條件為120 V，30 min。出現(xiàn)單一且明亮條帶，確定產(chǎn)物后，在切膠儀的紫外燈下切割目的產(chǎn)物，之后用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒（擎科，杭州）回收目的產(chǎn)物，并克隆至pMD19-T載體，由杭州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 序列分析

根據(jù)克隆測序所得到的小黃魚figlα 基因CDS 序列，使用軟件Snap Gene v4.1.9 進行拼接和對比，得到小黃魚figlα 基因完整的CDS 序列。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在不同物種間進行同源性檢測。用Expasy 在線軟件對小黃魚figlα 基因編碼的蛋白特性進行分析（https://web.expasy.org/protparam/），用Net NGlyc 1.0 在線預(yù)測小黃魚figlα 潛在的糖基化位點（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），用在線軟件預(yù)測小黃魚figlα 基因跨膜區(qū)（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和信號肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/），用Motif Scan 在線預(yù)測figlα 基因特征序列（https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan/），用Clustalw 在線進行小黃魚與其他物種氨基酸多序列比對（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）。Max（Mycassociated factor X,max）基因同樣屬于bHLH 家族中一員，它是figlα 的旁系同源基因[17,28]，為從進化樹上更清楚的看到figlα 類群演化的先后順序，選擇小黃魚max 基因為進化樹外類群，利用MEGA 7.0 軟件采用鄰近法（Neighbor-Joining），對不同物種figlα 氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及分析，針對進化樹各分支結(jié)點均進行1 000 次重復(fù)計算檢驗。不同物種figlα 建樹所用的基因序列號為：大黃魚Larimichthys crocea（XP_019121559.1）、斑馬魚（NP_944601.2）、尼羅羅非魚（NP_001298259.1）、青鳉（XP_011477803.1）、紅鰭東方鲀Takifugurubripes（NP_001177290.1）、條紋鱸Moronesaxatilis（XP_035514638.1）、金頭鯛Sparus aurata（XP_030271533.1）、點帶石斑魚Epinephelus coioides（AKC92803.1）、智人（NP_001004311.2）、家鼠Mus musculus（NP_036143.1）、家燕Hirundo rustica（XP_039943835.1）、熱帶爪蟾Xenopus tropicalis（NP_001016342.1）、安樂蜥Anolis carolinensis（XP_008120436.1）。

1.5 RT-PCR

為檢測figlα 基因在240 dph 的小黃魚不同組織中的分布，根據(jù)小黃魚figlα 基因CDS 序列設(shè)計特異性引物（表1），進行RT-PCR 擴增，以βactin 基因作為對照（表1）。PCR 擴增反應(yīng)體系同上，PCR 反應(yīng)條件除βactin 基因退火溫度為59 ℃外，其他條件同上。

表1 引物序列Tab.1 Primers list

1.6 石蠟切片制備及原位雜交

分別取60、90 和150 dph 的小黃魚卵巢和精巢組織，立即放入4%多聚甲醛（PFA）中4 ℃過夜固定，固定完成后轉(zhuǎn)入75%甲醇中，經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟、包埋、切片；切片經(jīng)脫蠟、風(fēng)干、消化及蛋白酶K 處理；滴預(yù)雜交液，37 ℃孵育1 h；傾去預(yù)雜交液，滴加濃度1 μmol·L-1含探針FIGLα probe 雜交液，恒溫箱42 ℃雜交過夜；洗去雜交液，滴加正常兔血清封閉液，室溫30 min；傾去封閉液，滴加鼠抗地高辛標記堿性磷酸酶（anti-DIG-AP），37 ℃孵育40 min；后TBS 洗4 次，各5 min；滴加BCIP/NBT 顯色液，顯微鏡觀察陽性，后純水沖洗；滴加核固紅染液，染核至合適程度后純水沖洗；自然風(fēng)干后，中性樹膠封片；顯微鏡拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 figlα 基因CDS 序列和結(jié)構(gòu)分析

將小黃魚figlα 基因的CDS 區(qū)按表1 中所列的引物擴增，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)單一且明亮的條帶，電泳片段大小與預(yù)期估計的片段大小相符。將擴增產(chǎn)物測序拼接后得出，小黃魚figlα 基因的CDS 序列長度為594 bp，編碼197 個氨基酸（圖1），包含一個高度保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域。其蛋白的理論分子量（MW）為22.6 kD，理論等電點為5.03，帶有負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）33 個，帶有正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）27 個，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，未檢測到明顯的信號肽。Net NGlyc 1.0 Server 預(yù)測到有2 個N 連接的糖基化位點。小黃魚與其它物種的figlα 蛋白同源性分析發(fā)現(xiàn)，小黃魚的figlα 氨基酸序列與大黃魚的同源性高達99.5%，與尼羅羅非魚、青鳉、紅鰭東方鲀、斑馬魚、熱帶爪蟾、家燕、安樂蜥、智人、家鼠的同源性分別為85.3%、79.1%、76.5%、41.1%、30.5%、28.9%、27.4%、24.4%、24.2%（圖2）。采用NJ 法構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，小黃魚figlα 與大黃魚的親緣關(guān)系最近，與大黃魚共同構(gòu)成了一個分支（圖3）。

圖1 小黃魚figlα 基因的CDS 序列及其預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 The CDS sequence and predicted amino acid sequence of the L.polyactis figlα gene

圖2 小黃魚figlα 基因與其他物種的氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of figlα gene among L.polyactis and other species

圖3 NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹采用（bootstraps=1 000 次）Fig.3 Phylogenetic tree established by 1 000 times N-J Bootstraps

2.2 figlα 基因組織表達

本研究以小黃魚figlα 基因特異性引物作為擴增引物，以βactin 基因作為對照，利用RT-PCR 技術(shù)對figlα 基因在小黃魚中的組織分布表達進行檢測。結(jié)果表明，figlα 在小黃魚卵巢組織中特異性表達，但在精巢、心臟、肝臟、肌肉、腎、皮膚、腦、眼、腸、鰓和脾組織中卻不表達（圖4）。由此可得，figlα 是小黃魚卵巢特異基因，參與小黃魚卵巢的發(fā)育。

圖4 figlα 基因在小黃魚不同組織中的表達Fig.4 The expression of figlα mRNA in various tissues of L.polyactis

2.3 figlα 在性腺組織中的細胞定位

為了定位figlα 在卵巢中的表達，通過對小黃魚不同發(fā)育時期60、90 及150 dph 性腺組織的石蠟切片進行原位雜交細胞定位，結(jié)果表明，figlα 在小黃魚60、90 和150 dph 的卵巢初級卵母細胞及60 dph 精巢雌雄同體兼性階段的初級卵母細胞中均有表達（圖5，a、a’、c、c’、e、e’、i、i’），然而，在其他時期的精巢中均未檢測到信號（圖5，f、f’、j、j’）。同時，在使用正義探針的陰性對照組中也均未檢測到任何信號（圖5，b、b’、d、d’、g、g’、h、h’、k、k’、l、l’）。

圖5 小黃魚性腺中figlα 的細胞定位Fig.5 figlα cell localization in gonads of L.polyactis

3 討論

3.1 figlα 基因在脊椎動物中高度保守

figlα 是第一個被鑒定為生殖細胞特異性的基本螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在絕大多數(shù)物種的性腺組織中表達。本實驗克隆了小黃魚figla 基因CDS 全長序列，并對序列進行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小黃魚figlα 基因的CDS 序列全長為594 bp，可編碼197 個氨基酸，同時包含一個物種間高度保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域。高度保守的bHLH 區(qū)域被認為是figlα 與靶蛋白E-box 基序結(jié)合所必需的[1,6]，小黃魚的figlα 序列與其他脊椎動物具有高度同源性，同樣包含一個物種間高度保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域，即特殊的螺旋-環(huán)-螺旋模體（HLHM）及其堿性氨基酸區(qū)域（Basic region）[10]。此外，通過對小黃魚figlα 基因核苷酸序列和蛋白序列與其他物種相關(guān)序列進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，figlα 基因與大黃魚同源性最高，系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，小黃魚與其他魚類聚為一大支，鳥類與爬行類聚為一大支，其中與大黃魚親緣關(guān)系最近，符合進化規(guī)律。

3.2 figlα 基因的表達與小黃魚精巢雌雄同體階段的產(chǎn)生高度相關(guān)

最近的研究表明，小黃魚卵巢發(fā)育較為連續(xù)，但精巢在43～80 dph 期間出現(xiàn)一個37 d 的短暫的雌雄同體兼性階段，其特征是精巢出現(xiàn)初級卵母細胞，并隨后凋亡退化。這種模式在任何其他魚類，包括近緣物種大黃魚中都從未報道[27]。小黃魚的figlα 基因具有特異性，它只在小黃魚卵巢的初級卵母細胞與雌雄同體兼性階段的精巢初級卵母細胞中表達。與此相似，羅非魚、黑鯛和青鳉的figlα 同樣也具有卵巢特異性，它們也只在卵巢的早期初級卵母細胞中表達，然而在精巢中不表達[9,16-17]。說明小黃魚精巢雌雄同體階段是特殊的，figlα 基因的表達與小黃魚精巢雌雄同體階段的產(chǎn)生高度相關(guān)。此外，在哺乳動物中，figlα 在精巢中的表達較弱，而在卵巢中表達較強[28-29]。這些結(jié)果進一步表明，figlα 是一種功能保守的卵母細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，它可能在從魚類到哺乳動物的脊椎動物的早期卵泡發(fā)生中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用。

3.3 figlα 基因在小黃魚中展現(xiàn)出性別二態(tài)性

本研究利用RT-PCR 及原位雜交技術(shù)研究了卵母細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子figlα 在小黃魚性腺發(fā)育中的作用。RT-PCR 結(jié)果表明，figlα 基因只在卵巢組織中高表達，但在精巢及其他組織中不表達；原位雜交結(jié)果顯示，figlα 表達于60、90 和150 dph 卵巢的初級卵母細胞和60 dph 雌雄同體兼性階段的精巢初級卵母細胞中，但在90 和150 dph 的精巢中均未檢測到信號。與本研究結(jié)果一致的是，在羅非魚中，figlα 主要在90和150 dph 卵巢的早期初級卵母細胞中表達[17]，在青鳉中，figlα 早在1 dph 的卵巢中特異性表達，且在5 dph 卵巢相對較大的卵母細胞中表達[16]。然而，小黃魚figlα 基因的表達模式與哺乳動物和爬行動物存在明顯差異，如在小鼠、牛和中華鱉中，figlα 在他們的卵巢及精巢中均表達[1,7,10]。特殊的是，在一些魚類中，figlα不但在他們的卵巢中表達，也在精巢中表達，如大西洋鮭Salmo salar[30]和斑馬魚[15]，說明figlα 在生殖細胞發(fā)育中起到重要作用。此外，在半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis 中發(fā)現(xiàn)了figlα 的2 種轉(zhuǎn)錄形式，其中figlα_tv1 首先在120 dph 卵巢中檢測到，在孵化1 年后表達水平達到最大值，在孵化2 年后表達水平急劇下降，而figlα_tv2 只在假雄性睪丸中表達[31]。因此，figlα 在小黃魚中展現(xiàn)出的性別二態(tài)性強烈的表明，figlα可能在促進小黃魚的卵巢發(fā)育和分化中起重要作用，但figlα 基因的分子調(diào)控機制還需進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，figlα 基因在小黃魚中展現(xiàn)出性別二態(tài)性，其在小黃魚卵巢的初級卵母細胞與雌雄同體兼性階段的精巢初級卵母細胞中表達，而在其他組織中不表達，說明figlα 基因的表達與小黃魚精巢雌雄同體階段的產(chǎn)生高度相關(guān)，可能在促進小黃魚的卵巢發(fā)育和分化中起重要作用，但figlα 基因的分子調(diào)控機制還需進一步研究。