新型礦化膠原膜的體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)

韓雪 許亦權(quán) 李大偉 趙海丹 劉振

（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心 口腔科，骨科#，北京 100091）

引導(dǎo)骨再生（Guided Bone Regeneration，GBR）技術(shù)是一種有效的增加局部牙槽骨缺損區(qū)域中骨數(shù)量和質(zhì)量的方法，其作用機(jī)理是利用屏障膜形成一定間隙，有利于成骨細(xì)胞占據(jù)牙槽骨缺損區(qū)，防止非成骨細(xì)胞在該區(qū)域增殖，從而改善骨的再生并重建牙周組織。屏障膜在GBR 技術(shù)中起著重要作用，其特性在一定程度上影響成骨效果。GBR 膜根據(jù)能否被吸收分為不可吸收膜和可吸收膜兩種，前者包括聚四氟乙烯（PTFE）膜和鈦膜，后者包括天然聚合物和合成聚合物。

盡管不可吸收的GBR 膜為牙周再生提供了足夠的空間環(huán)境，但是二次手術(shù)去除膜仍然存在明顯的缺陷[1]。此操作增加了新組織受損的風(fēng)險(xiǎn)，也可能會(huì)中斷愈合過程[1]。為了防止這些問題，可吸收膜成為主要研究方向。目前，膠原蛋白膜是應(yīng)用最廣的可吸收膜[2，3]。為了提高膠原膜的生物活性，北京奧精醫(yī)藥科技有限公司采用體外礦化技術(shù)制備了在成分和結(jié)構(gòu)上與人體骨十分接近的礦化膠原膜[4]，該膜為雙層膜，疏松層由Ⅰ型膠原和羥基磷灰石組成的礦化膠原層，能夠?yàn)槌晒羌?xì)胞的活動(dòng)提供良好的微環(huán)境和支架作用，發(fā)揮誘導(dǎo)骨再生作用[5，6]；致密層為Ⅰ型膠原，發(fā)揮有效的屏蔽作用[7]。孫翼等人[7]通過在犬拔牙窩內(nèi)植入人工骨修復(fù)材料并覆蓋該新型礦化膠原膜，觀察愈合 3 個(gè)月后牙槽骨高度和寬度的變化，并評(píng)價(jià)新生骨組織的改建情況，發(fā)現(xiàn)新骨生成速率與礦化膠原膜材料的降解速率能夠?qū)崿F(xiàn)理想的匹配，有膜覆蓋組牙槽嵴輪廓飽滿，對(duì)照組拔牙區(qū)牙槽嵴高度和寬度明顯下降，說明該膜具有理想的機(jī)械強(qiáng)度和降解性能。本研究進(jìn)行一系列檢測(cè)評(píng)估該礦化膠原膜材料與MG63 成骨樣細(xì)胞株的體外細(xì)胞相容性，為臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 MG63 成骨樣細(xì)胞株，購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 礦化膠原膜（購自奧精醫(yī)藥科技有限公司，北京），MEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、雙抗（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（建成，南京），倒置相差顯微鏡（Leica公司，美國(guó)），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO，日本），超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），平底6 孔板（Corning 公司，美國(guó)），掃描電鏡（FEI公司，荷蘭），流式儀（BD Biosciences，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MG63 細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含有10%FBS 的MEM 培養(yǎng)液，置于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～ 85%時(shí)，按1∶3 傳代。

1.3 HE 染色觀察

將無菌礦化膠原膜放置6 孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組以2.0×106個(gè)/mL 密度將MG63 細(xì)胞接種于其表面，每孔100 μL，4 h 待細(xì)胞黏附后加入完全培養(yǎng)液；對(duì)照組只加入無細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)3 d 后取出樣本，用PBS將樣品清洗3 遍，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm 厚連續(xù)切片，行HE 染色觀察。

1.4 掃描電鏡觀察

接種密度及方法同1.3，培養(yǎng)3 d 后取出樣本，4% 戊二醛溶液固定，1% 鋨酸4℃固定4 h，梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥，金屬鍍膜后掃描電鏡下觀察。

1.5 浸提液制備

參照 ISO 10993-5：2009 中的細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法，取礦化膠原膜按 6 cm2/mL 的比例加入含10%FBS 的MEM 培養(yǎng)液，37 ℃浸提24 h，浸提后0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，作為實(shí)驗(yàn)組（礦化膠原膜組），4℃保存?zhèn)溆??？瞻讓?duì)照組：10%FBS 的MEM 培養(yǎng)液。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

將MG63 細(xì)胞以2×105的密度接種在礦化膠原膜組及對(duì)照組2 種培養(yǎng)基（n=4）中，培養(yǎng)3 天后收集細(xì)胞。將細(xì)胞在PBS 中漂洗一次，然后重懸于0.3 mL PBS 中，轉(zhuǎn)移至1.2 mL 乙醇-20℃孵育過夜。第二天離心收集細(xì)胞，吸盡上清，加入PBS洗滌一次，細(xì)胞重懸于100 μL 含RNase A 的PBS 中，并置于37℃水浴中30 min。加入碘化丙錠（PI）進(jìn)行染色，4℃避光30 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將MG63 細(xì)胞以2×105的密度接種在礦化膠原膜組及對(duì)照組2 種培養(yǎng)基（n=4）中，3 天后，收集每個(gè)瓶中的細(xì)胞，用PBS 漂洗兩次，重懸于500 μL binding 緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（PI）混勻，避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀和CellQuest 軟件對(duì)樣品進(jìn)行分析，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色的結(jié)果

細(xì)胞接種后3 天，HE 染色（見圖1），對(duì)照組無細(xì)胞附著（圖1A），實(shí)驗(yàn)組可見大量細(xì)胞附著在礦化膠原膜表面（圖1B），細(xì)胞核清晰可見。該發(fā)現(xiàn)表明礦化膠原膜具有良好的細(xì)胞相容性。

圖1 HE 染色觀察

2.2 掃描電鏡觀察

電鏡下觀察顯示：對(duì)照組的礦化膠原膜表面較粗糙，無細(xì)胞附著（見圖2A）。實(shí)驗(yàn)組可見大量扁平較伸展的細(xì)胞附著，呈多邊形，通過樹突狀突起與粗糙表面緊密嵌合（見圖2B），表明該材料的細(xì)胞親和力較好。

圖2 掃描電鏡觀察（×2000）

2.3 細(xì)胞周期結(jié)果

表1 是在2組培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d 后，通過流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)2組MG63 細(xì)胞的細(xì)胞周期分析結(jié)果，結(jié)果顯示：2組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。礦化膠原膜浸提液對(duì)MG63 成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯影響。

表1 2組細(xì)胞在細(xì)胞周期段含量比較（）

表1 2組細(xì)胞在細(xì)胞周期段含量比較（）

2.4 細(xì)胞凋亡結(jié)果

2組的細(xì)胞凋亡率結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，對(duì)照組和礦化膠原膜組均見大量活細(xì)胞集中于左下象限，2組凋亡細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 2組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用的礦化膠原膜是由致密層和疏松層組成的雙層結(jié)構(gòu)，致密層為I 型膠原，疏松層通過體外仿生礦化過程，以膠原分子為模板，引導(dǎo)鈣離子、磷離子在膠原分子上和分子間的特定位點(diǎn)形成羥基磷灰石晶核，并進(jìn)行調(diào)控使膠原纖維之間和表面形成周期性有序排列的羥基磷灰石晶體，從而形成微觀多孔結(jié)構(gòu)，孔徑 50～ 500 μm，孔隙率＞70%，模擬天然松質(zhì)骨成分和結(jié)構(gòu)[5]，可以交換養(yǎng)分、氧氣和代謝廢物。這種與人體天然骨基質(zhì)相似的化學(xué)組成和微觀結(jié)構(gòu)，為骨細(xì)胞提供良好的微環(huán)境[5，6]。一方面，雙層結(jié)構(gòu)的致密層可作為結(jié)締組織浸潤(rùn)的物理屏障。另一方面，疏松層中礦化的膠原蛋白在誘導(dǎo)骨再生中發(fā)揮有效作用，多孔結(jié)構(gòu)又為細(xì)胞在孔內(nèi)的增殖代謝提供了條件，并充當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)的底物。與傳統(tǒng)的膠原膜相比，新型復(fù)合礦化膠原膜的最大優(yōu)勢(shì)在于它可以通過含有羥基磷灰石成分的疏松層誘導(dǎo)骨再生[7]，使該膜具有較強(qiáng)的生物活性，促進(jìn)形成新的骨組織，有利于引導(dǎo)骨組織再生。

評(píng)價(jià)生物材料的生物相容性是其應(yīng)用于臨床的必需環(huán)節(jié)，生物相容性良好才能確保臨床應(yīng)用的安全性。在大量的研究中，細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種較快速、價(jià)廉且具有高度可重復(fù)性的方法，被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可通過檢測(cè)生物材料或其浸提液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響來評(píng)價(jià)[8，9]，考慮到所檢測(cè)的新型礦化膠原膜應(yīng)用于骨組織的修復(fù)過程中，材料的接觸環(huán)境中存在大量的骨細(xì)胞。因此，選擇MG63 成骨樣細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在本研究中，通過HE 染色（圖1）和掃描電鏡（圖2）觀察，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3 天后礦化膠原膜表面附著大量細(xì)胞，呈多邊形，通過樹突狀突起與粗糙表面緊密接觸，表明該材料的細(xì)胞親和力較好。同時(shí)，通過流式細(xì)胞儀研究了完全培養(yǎng)基和礦化膠原膜浸提液培養(yǎng)的MG63 細(xì)胞的細(xì)胞周期（表1）和凋亡率（圖3），并分析了各相的細(xì)胞百分比，沒有觀察到顯著性差異。表明礦化膠原膜不會(huì)誘導(dǎo)MG63 細(xì)胞的凋亡。Imanieh 等人[10]將犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞（dBMSCs）與雙層礦化膠原膜結(jié)合，體外培養(yǎng)7 天，掃描電鏡結(jié)果表明，dBMSCs 在膜表面活躍生長(zhǎng)，并延伸出許多偽足。同時(shí)，分泌了許多細(xì)胞外基質(zhì)，一些偽足相互融合。這些結(jié)果表明，雙層礦化膠原GBR 膜對(duì)dBMSCs具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)和促進(jìn)分化能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究結(jié)果一致，提示礦化膠原膜具有理想的細(xì)胞相容性。

4 結(jié)論

綜上所述，該礦化膠原膜對(duì)MG63 細(xì)胞生長(zhǎng)無抑制作用，具有良好的細(xì)胞相容性，并為可吸收性膠原蛋白膜的未來開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了新的思路。但該材料對(duì)骨相關(guān)蛋白和基因的影響有待更深入的研究。