丁酸梭菌通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶/核因子E2相關(guān)因子信號(hào)通路減輕豬霍亂沙門氏菌導(dǎo)致的豬小腸上皮細(xì)胞氧化損傷

尚智援 竇彩霞 王克瑋 劉雪姣 李海花 喬家運(yùn)*

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

細(xì)胞和組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生是由于其細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量。氧化應(yīng)激可以破壞腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，是腸損傷發(fā)生的關(guān)鍵因素[1]。應(yīng)激可誘導(dǎo)腸細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS代謝物，影響細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)穩(wěn)定性，增加細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腸黏膜損傷[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，斷奶會(huì)破壞仔豬機(jī)體的氧化平衡，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[3]，致使斷奶仔豬小腸細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[4-5]。氧化應(yīng)激已被證實(shí)參與腸道屏障功能障礙和各種消化道疾病的發(fā)生，其對(duì)腸道形態(tài)的不良影響還伴隨著緊密連接蛋白表達(dá)的下調(diào)[6]。豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis，SC)屬于革蘭氏陰性菌，作為一種人畜共患病原體可以侵入宿主并導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生，并且耐藥性沙門氏菌等在疾病中出現(xiàn)的概率增加[7]。當(dāng)SC侵入腸道黏膜后，通過分泌免疫球蛋白A(IgA)、抗菌肽和消化酶等逃避宿主腸腔防御機(jī)制[8]。沙門氏菌黏附在上皮細(xì)胞的表面后，通過介導(dǎo)內(nèi)吞作用侵入腸上皮的M細(xì)胞、上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等非吞噬性腸細(xì)胞[9]，并且在病原體繁殖時(shí)產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，內(nèi)毒素作用于白細(xì)胞進(jìn)而引起炎癥、氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體高燒和腹瀉。有研究表明，沙門氏菌黏附到腸上皮細(xì)胞后，宿主防御機(jī)制被激活，這種早期促炎狀態(tài)可以通過激活微生物特異性Toll樣受體(TLRs)來啟動(dòng)，TLRs激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依賴性信號(hào)通路[10]。

核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激通路之一，在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞核中Nrf2積聚，Nrf2與ARE結(jié)合后啟動(dòng)下游一系列保護(hù)性基因的表達(dá)，如谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)等[11]。有研究表明，p38 MAPK可以將Nrf2中的3個(gè)絲氨酸殘基(Ser215、Ser408和Ser577)磷酸化，這促進(jìn)了Nrf2核積累的減少[12-13]。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum，CB)是一種革蘭氏陽性菌，存在于人和動(dòng)物胃腸道中[14]。據(jù)報(bào)道，CB能夠改善腸道環(huán)境、促進(jìn)宿主健康[14]，其作用機(jī)制主要包括：1)在腸道內(nèi)通過發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸、B族維生素、多種消化酶等益生物質(zhì)，為腸道上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收[15-16]；2)通過與致病菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及黏膜定植位點(diǎn)，阻止病原菌生長(zhǎng)與定植[17]；3)通過調(diào)節(jié)腸道微生物及其代謝產(chǎn)物(如丁酸、乙酸、丙酸)，降低腸道pH，保護(hù)腸道免受致病菌感染[18-20]；4)通過TLRs介導(dǎo)的免疫信號(hào)通路調(diào)控免疫細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-6)和抑炎細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-10)，提高機(jī)體免疫力[21-22]。此外，有研究表明，CB能促進(jìn)小鼠機(jī)體中Nrf2的表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激[23]。但CB能否緩解SC對(duì)機(jī)體造成的影響尚不清晰，因此，本研究以豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)為模型，以p38 MAPK和Nrf2信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探究CB緩解SC導(dǎo)致氧化損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和細(xì)胞

SC來自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，保存于天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。CB為健康仔豬糞便中分離菌株，已通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色和16S rDNA核苷酸序列確定其為CB。試驗(yàn)前，將活化的SC接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h；將活化的CB接種到液體強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(RCM)，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h；以菌液：甘油(體積比1∶1)保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)試驗(yàn)。分別用營(yíng)養(yǎng)瓊脂和瓊脂RCM對(duì)SC和CB進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

IPEC-J2細(xì)胞購買于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的條件下，用含89% RPMI Medium 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清(BSA)和1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)試劑

RPMI Medium 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)消化液均購于美國(guó)Gibco公司。青鏈霉素和二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶生物公司。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM購自美國(guó)Invitrogen公司。細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)購自東仁化學(xué)科技有限公司。丙二醛(MDA)、GPX和SOD酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒均購自美國(guó)Gene Copoeia公司。抗p38 MAPK抗體購買于美國(guó)Cell Signaling Technology公司?？筃rf2抗體和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自英國(guó)Abcam公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 試驗(yàn)1：SC適宜劑量選擇

將濃度為1×104個(gè)/mL的IPEC-J2細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行以下處理，即分為對(duì)照組(添加100 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、SC1組(添加1×101CFU/mL SC)、SC2組(添加1×102CFU/mL SC)、SC3組(添加1×103CFU/mL SC)和SC4組(添加1×104CFU/mL SC)，每組3個(gè)重復(fù)。分別培養(yǎng)3、6、12、18和24 h后，檢測(cè)細(xì)胞活力及培養(yǎng)上清液中SOD、GPX活性和MDA含量。

1.3.2 試驗(yàn)2：CB對(duì)SC感染IPEC-J2細(xì)胞后p38 MAPK/Nrf2信號(hào)通路活化的影響

將濃度為1×105個(gè)/mL的IPEC-J2細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，做不同處理。CB選用感染復(fù)數(shù)(MOI)為50、孵育時(shí)間為3 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[24]。試驗(yàn)分為3組，即對(duì)照組(添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、SC組(添加1×103CFU/mL SC)和CB+SC組(CB孵育3 h和添加1×103CFU/mL SC)，每組3個(gè)重復(fù)。待SC分別處理3、6、12和24 h后收集細(xì)胞并裂解，檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1、GPX2和GAPDHmRNA相對(duì)表達(dá)量，并在SC處理12 h后檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2和p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 試驗(yàn)3：Nrf2信號(hào)通路在CB影響SC感染IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷中的作用

豬Nrf2的小干擾RNA(siRNA)序列：正向5′-GCCCAUGAUGUCUCUGUTT-3′，反向5′-AUCAGAGAUGAUGGCTT-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。在進(jìn)行試驗(yàn)之前，以Nrf2非特異性siRNA作為陰性對(duì)照(NC)，檢測(cè)了Nrf2特異性siRNA的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)Nrf2非特異性siRNA對(duì)Nrf2的表達(dá)沒有影響，而Nrf2特異性siRNA能夠顯著下調(diào)Nrf2的表達(dá)，因此，可以采用Nrf2特異性siRNA進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。將濃度為1×105個(gè)/mL的IPEC-J2細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，試驗(yàn)分為7組，即對(duì)照組(添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、NC組(Nrf2非特異性siRNA單獨(dú)處理細(xì)胞6 h)、siRNA組(siRNA單獨(dú)處理細(xì)胞6 h)、NC+SC組(先進(jìn)行Nrf2非特異性siRNA處理細(xì)胞6 h，再進(jìn)行1×103CFU/mL SC處理細(xì)胞12 h)、siRNA+SC組(先進(jìn)行siRNA處理細(xì)胞6 h，再進(jìn)行1×103CFU/mL SC處理細(xì)胞12 h)、NC+CB+SC組(先進(jìn)行Nrf2非特異性siRNA處理細(xì)胞6 h，再進(jìn)行CB孵育3 h，最后進(jìn)行1×103CFU/mL SC處理細(xì)胞12 h)和siRNA+CB+SC組(先進(jìn)行siRNA處理細(xì)胞6 h，再進(jìn)行CB孵育3 h，最后進(jìn)行1×103CFU/mL SC處理細(xì)胞12 h)，每組3個(gè)重復(fù)。待SC處理12 h后，收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清液，檢測(cè)上清液中SOD、GPX活性以及細(xì)胞中SOD1、SOD2、GPX1、GPX2和Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 試驗(yàn)4：p38 MAPK信號(hào)通路在CB影響SC感染IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷中的作用

用DMSO溶解SB-203580(p38 MAPK抑制劑)，制備終濃度為50 μmol/L的p38 MAPK抑制劑。將IPEC-J2細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，試驗(yàn)分為7組，即對(duì)照組(添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、DMSO組(50 μmol/L DMSO處理細(xì)胞1 h)、p38組(p38 MAPK抑制劑處理細(xì)胞1 h)、DMSO+SC組(50 μmol/L DMSO處理細(xì)胞1 h后再用SC感染細(xì)胞12 h)、p38+SC組(p38 MAPK抑制劑處理細(xì)胞1 h后再用SC感染細(xì)胞12 h)、DMSO+CB+SC組(50 μmol/L DMSO處理細(xì)胞1 h后，CB孵育細(xì)胞3 h，SC感染細(xì)胞12 h)和p38+CB+SC組(p38 MAPK抑制劑處理細(xì)胞1 h后，CB孵育細(xì)胞3 h，SC感染細(xì)胞12 h)，每組3個(gè)重復(fù)。待SC處理12 h后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，檢測(cè)上清液中SOD、GPX活性以及細(xì)胞中p38MAPK、SOD1、SOD2、GPX1、GPX2和Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞活力分析

細(xì)胞在培養(yǎng)特定時(shí)間后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，每孔加入90 μL RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10 μL CCK-8孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的吸光度并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清中GPX、SOD活性和MDA含量檢測(cè)

嚴(yán)格按照制造商說明書要求分別檢測(cè)培養(yǎng)上清液中SOD、GPX活性和MDA含量。

1.6 RT-qPCR

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.7 蛋白印跡法(Western blotting)

將細(xì)胞裂解后，與上樣緩沖液充分混勻，煮沸10 min，獲得蛋白樣品，采用蛋白定量法測(cè)定蛋白總量。運(yùn)用12%變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，參照Qiao等[31]的方法進(jìn)行Western blotting試驗(yàn)。運(yùn)用Image軟件來檢測(cè)相關(guān)蛋白的灰度值(相對(duì)灰度值=相關(guān)蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值)，檢測(cè)Nrf2、p38 MAPK和GAPDH蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果使用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并通過Graphpad Prism 7.0軟件制作柱形圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SC適宜劑量選擇

由圖1可知，同一處理時(shí)間，與對(duì)照組相比，其他各組細(xì)胞活力均顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性。在SC處理3 h后，與SC2組相比，SC1組和SC3組細(xì)胞活力沒有顯著差異(P>0.05)；SC4組細(xì)胞活力顯著低于SC1組和SC2組(P<0.05)。在SC處理12 h后，SC2組和SC3組細(xì)胞活力沒有顯著差異(P>0.05)，且與SC1組和SC4組存在極顯著差異(P<0.01)。在SC處理6、18和24 h后，SC1組、SC2組、SC3組和SC4組之間細(xì)胞活力均存在顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。相同濃度的SC，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)結(jié)果表明，不同濃度的SC在同一處理時(shí)間內(nèi)，與對(duì)照組相比，隨著SC濃度的增加，MDA含量(3 h的SC1組除外)均呈顯著或極顯著上升(P<0.05，P<0.01)，抗氧化酶SOD、GPX活性呈極顯著下降(P<0.01)，并且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)SC4組MDA含量最多，SOD、GPX活性最低。相同濃度的SC在不同處理時(shí)間內(nèi)，MDA含量增加，SOD、GPX活性降低，且均呈時(shí)間依賴性。試驗(yàn)結(jié)果表明，SC3組細(xì)胞活力顯著降低，且在此濃度長(zhǎng)時(shí)間處理細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞損傷較小。因此，選擇1×103CFU/mL作為SC的適宜劑量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.圖1 SC適宜劑量選擇Fig.1 SC Appropriate dose selection

2.2 CB對(duì)SC感染IPEC-J2細(xì)胞后p38 MAPK/Nrf2信號(hào)通路活化的影響

由圖2可知，SC處理細(xì)胞3 h后，與對(duì)照組相比，SC組Nrf2和GPX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，然而SOD1和SOD2的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著變化(P>0.05)；與SC組相比，CB+SC組的SOD1和SOD2的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著變化(P>0.05)，Nrf2和GPX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。SC處理細(xì)胞6 h后，與對(duì)照組相比，SC組除SOD1的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著變化(P>0.05)，其他基因的相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)；與SC組相比，CB+SC組Nrf2、SOD2和GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，SOD1和GPX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有顯著變化(P>0.05)。SC處理細(xì)胞12和24 h后，與對(duì)照組相比，SC組Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與SC組相比，CB+SC組Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)。此外，Western blotting結(jié)果顯示，SC處理細(xì)胞12 h后，與對(duì)照組相比，SC組Nrf2和p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與SC組相比，CB+SC組Nrf2和p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果表明，與SC組相比，CB+SC組Nrf2及其下游基因在12 h后的mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高，CB預(yù)處理能緩解SC誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶mRNA相對(duì)表達(dá)量的降低。因此，選用12 h作為SC處理細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

Nrf2：核因子E2相關(guān)因子 NF-E2-related factor 2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；p38 MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶 p38 mitogen activated protein kinase。圖2 CB對(duì)SC感染IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK/Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of CB on expression of genes related to p38 MAPK/Nrf2 signaling pathway in SC-infected IPEC-J2 cells

2.3 驗(yàn)證Nrf2信號(hào)通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷中的積極作用

用siRNA沉默IPEC-J2細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性，RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2及其下游基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以此確定CB調(diào)控致病菌感染引起的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷是否與Nrf2信號(hào)通路的活化有關(guān)。由表2和圖3可知，與對(duì)照組相比，NC組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2、SOD1、SOD2和GPX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均無顯著變化(P>0.05)，NC+SC組和siRNA+SC組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與NC+SC組相比，siRNA+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2、SOD1、GPX1和GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；NC+CB+SC組培養(yǎng)上清液中SOD活性極顯著降低(P<0.01)，GPX活性極顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；siRNA+CB+SC組僅GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與siRNA+SC組相比，NC+CB+SC和siRNA+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，并且與siRNA+CB+SC組相比，NC+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2、SOD1、GPX1和GPX2均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果表明，Nrf2信號(hào)通路的下調(diào)在一定程度上加重了SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷，CB可通過上調(diào)Nrf2信號(hào)通路緩解這種損傷，且用siRNA沉默Nrf2表達(dá)后CB的益生作用會(huì)有所降低。

表2 Nrf2信號(hào)通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷中的積極作用Table 2 Positive role of Nrf2 signaling pathway in CB alleviating SC-induced oxidative damage in IPEC-J2 cells U/mL

圖3 Nrf2信號(hào)通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷中的積極作用Fig.3 Positive role of Nrf2 signaling pathway in CB alleviating SC-induced oxidative damage in IPEC-J2 cells

2.4 p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)SC誘導(dǎo)氧化損傷后Nrf2及其下游基因表達(dá)的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，DMSO組p38MAPK的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)；p38組p38MAPK的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，DMSO+SC組和p38+SC組p38MAPK的mRNA相對(duì)表達(dá)量亦顯著下降(P<0.05)。與DMSO+SC和p38+SC組分別相比，DMSO+CB+SC組和p38+CB+SC組p38MAPK的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，CB能上調(diào)SC造成的p38MAPKmRNA相對(duì)表達(dá)量的下降，并對(duì)Nrf2信號(hào)通路起到激活作用。

用抑制劑抑制IPEC-J2細(xì)胞中p38 MAPK的活化后，采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性，RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2及其下游抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)量來檢測(cè)p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)Nrf2信號(hào)通路的積極作用。由表3和圖4可知，與對(duì)照組相比，DMSO組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)；p38組、DMSO+SC組和p38+SC組培養(yǎng)上清液中SOD和GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01)。與DMSO+SC組相比，DMSO+CB+SC組和p38+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細(xì)胞中SOD1、GPX1、GPX2和Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，僅DMSO+CB+SC組細(xì)胞中SOD2的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與p38+SC組相比，DMSO+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細(xì)胞中SOD2和GPX1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；p38+CB+SC組培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果表明，p38 MAPK信號(hào)通路的下調(diào)會(huì)造成Nrf2及其下游基因的相對(duì)表達(dá)量降低，CB可通過上調(diào)p38 MAPK通路緩減SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷。

表3 p38 MAPK信號(hào)通路在CB緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷中的積極作用Table 3 Positive role of p38 MAPK signaling pathway in CB alleviating SC-induced oxidative damage in IPEC-J2 cells U/mL

3 討 論

活性氧(ROS)包括超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)，這些分子主要來源于在線粒體、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中發(fā)生的各種代謝反應(yīng)中消耗的氧氣[32]。細(xì)胞內(nèi)ROS水平的調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，過量的ROS會(huì)損害細(xì)胞成分，如導(dǎo)致DNA損傷、脂類過氧化水平升高、蛋白質(zhì)損傷等[33]，因此這些損傷的生物大分子可作為氧化應(yīng)激的評(píng)估指標(biāo)，例如MDA就是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是反映氧化損傷的典型參數(shù)[34]。

CB對(duì)動(dòng)物具有多種有益作用，包括緩解氧化應(yīng)激[35]、平衡腸道菌群[36]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[37]、改善神經(jīng)功能缺損[38]等。有研究表明，濃度為5×108CFU/mL的CB預(yù)處理可降低不同胃潰瘍模型小鼠血清中MDA含量，提高胃組織中SOD和過氧化氫酶(CAT)活性[39]。四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷后，小鼠肝臟中MDA含量增加，CB預(yù)處理后增加了肝臟中SOD和CAT活性，并降低了MDA含量，另外還增加了Nrf2含量[23,35]。本試驗(yàn)通過檢測(cè)p38MAPK、Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1、GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量來說明CB對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)，在SC處理12 h后，CB預(yù)處理能夠顯著提高IPEC-J2細(xì)胞p38MAPK、Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因敲除的小鼠更容易受到氧化應(yīng)激導(dǎo)致腫瘤發(fā)生以及加重肥胖帶來的有害影響[40-41]。目前，有關(guān)沉默Nrf2的表達(dá)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞影響的研究尚未見報(bào)道。本研究用siRNA干擾細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)上清液中GPX活性以及細(xì)胞中Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，加入SC處理細(xì)胞后，上清液中抗氧化酶活性和細(xì)胞中各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，而添加CB后能顯著增加細(xì)胞中Nrf2、SOD1、SOD2、GPX1和GPX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量，表明CB可通過Nrf2信號(hào)通路減輕致病菌造成的IPEC-J2細(xì)胞損傷。

MAPK在細(xì)胞分化、有絲分裂和凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮一定作用而受到了廣泛關(guān)注[42]。MAPK信號(hào)通路還參與很多生物學(xué)過程，如調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和細(xì)胞增殖等，與腸上皮屏障功能密切相關(guān)[43]。MAPK信號(hào)通路由三級(jí)激酶組成，包括絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)、絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)和MAPK，依次被激活，實(shí)現(xiàn)信號(hào)從細(xì)胞表面向細(xì)胞核傳遞，誘導(dǎo)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖和炎癥反應(yīng)[44-45]。MAPK通路由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1和ERK2，p38 MAPK，C-Jun氨基末端激酶(JNK)1、JNK2和JNK3，以及ERK5共4種分支組成[45-46]。其中，p38 MAPK信號(hào)通路與炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)，是促炎性細(xì)胞因子合成的關(guān)鍵調(diào)控路徑[47]。ERK1和ERK2、p38 MAPKs以及JNK1、JNK2和JNK3是研究最廣泛的MAPK[47]。在MAPK中，p38 MAPK參與了一系列的信號(hào)通路，這些通路刺激了多種不同的生物功能[48]。p38 MAPK對(duì)炎癥細(xì)胞因子和ROS等應(yīng)激刺激有反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)磷酸化p38 MAPK蛋白水平在致病菌誘導(dǎo)的斷奶仔豬腹瀉中顯著升高，表明p38 MAPK對(duì)致病菌誘導(dǎo)的仔豬腹瀉有重要貢獻(xiàn)[49]。Nrf2啟動(dòng)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的活性也受到p38 MAPK的正調(diào)控[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，CB能上調(diào)SC造成的p38MAPK的mRNA相對(duì)表達(dá)量的下降，并對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路起到激活作用。另外，本研究通過抑制p38MAPK的表達(dá)后，檢測(cè)p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)Nrf2信號(hào)通路的積極作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，p38 MAPK抑制劑單獨(dú)處理、DMSO與SC處理和p38 MAPK抑制劑與SC處理均會(huì)降低上清液中抗氧化酶的活性以及細(xì)胞中Nrf2及其下游基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，而CB預(yù)處理后上調(diào)致病菌造成的抗氧化基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低。這表明p38 MAPK信號(hào)通路下調(diào)會(huì)造成Nrf2及其下游基因的相對(duì)表達(dá)量降低，加重SC造成的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷，CB可通過上調(diào)p38 MAPK通路緩解這種損傷。

微生物在消化道中定植離不開其細(xì)胞壁成分與腸道黏膜之間的相互作用[51]。據(jù)報(bào)道，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁成分(脂磷壁酸)能夠誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡，而CB的脂磷壁酸可以緩解這一現(xiàn)象[52]。Zhao等[53]研究證實(shí)了CB可以通過其細(xì)胞壁成分和丁酸等代謝物降低Caco-2細(xì)胞脂肪的生成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CB能夠通過激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPRs)抑制腸道腫瘤細(xì)胞增殖[54]。值得注意的是，丁酸可以通過與其受體(如GPR41、GPR43、GPR109A)結(jié)合來影響腸道內(nèi)多種信號(hào)通路[55]。例如，丁酸能夠激活GPR109A，抑制NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[56]，并且丁酸在進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)分解產(chǎn)生氫離子[57]，激活鈉離子(Na+)/氫離子(H+)交換系統(tǒng)，維持細(xì)胞內(nèi)外pH穩(wěn)定，抑制病原體增殖，維持腸道微生物平衡[58]；同時(shí)H+可以通過與自由基的結(jié)合，增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化酶的活性，減輕氧化應(yīng)激，提高機(jī)體抗氧化能力[59]。以上研究表明，CB發(fā)揮益生作用可能依賴于其細(xì)胞壁成分及代謝產(chǎn)物。然而，具體的某種細(xì)胞壁成分或代謝產(chǎn)物所具有的益生作用及其機(jī)制仍然需要進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，CB能夠通過上調(diào)p38MAPK的表達(dá)，激活Nrf2信號(hào)通路，進(jìn)而介導(dǎo)下游抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，緩解SC誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷。