黃曲霉毒素M1與赭曲霉毒素A對小鼠腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

楊麗婷 高亞男 楊 雪 劉華偉 王加啟 鄭 楠*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109)

霉菌毒素主要是由曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌產(chǎn)生的一系列有毒性的次級代謝產(chǎn)物，常污染食品、飼料等。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織的調(diào)查，全球約25%的農(nóng)作物(堅(jiān)果、谷物、大米等)會受到霉菌毒素的污染，其中黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)是較頻繁檢出的一類，人或動物攝入后會引起不同程度的毒性作用[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)在所有AFs中毒性最強(qiáng)[3]。牛奶中常檢測到黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)是因?yàn)槟膛Ｋ鶖z入的是受AFs污染的飼料，隨后AFB1被機(jī)體肝臟微粒體細(xì)胞色素P450代謝轉(zhuǎn)化為AFM1而分泌到乳汁中[4-5]。赭曲霉毒素(ochratoxin，OT)是曲霉屬中的赭曲霉和青霉屬中的純綠青霉分泌的產(chǎn)物，包含7種結(jié)構(gòu)類似物，OTA是其中之一，它分布最廣且毒性最強(qiáng)，常出現(xiàn)在谷物和谷物衍生產(chǎn)品[6]。目前許多研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AFM1與OTA在食品、飼料中共存的現(xiàn)象[7-10]，這表明人類和動物易同時(shí)暴露于AFM1和OTA中，對健康有著直接或者間接的影響。

物理、化學(xué)、免疫以及微生物屏障共同組成了生物體內(nèi)的腸道屏障，是阻礙霉菌毒素以及其他污染物進(jìn)入機(jī)體的第1道防線[11]。微生物屏障指腸道微生物區(qū)多樣性的相對穩(wěn)態(tài)，腸道中微生物數(shù)量可達(dá)到宿主體細(xì)胞數(shù)量的10倍，總體基因組數(shù)能達(dá)到150倍[12]。研究表明，腸道微生物的多樣性以及豐度從十二指腸到結(jié)腸末端在逐漸增加[13]，專性厭氧菌對維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著至關(guān)重要的作用，如果其穩(wěn)定性遭到破壞，機(jī)體就會產(chǎn)生系列反應(yīng)，引發(fā)腸道疾病[14]。凡納濱對蝦攝入被AFB1污染的飼料后導(dǎo)致蝦腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[15]。不同濃度的AFB1灌胃小鼠后，其腸道內(nèi)細(xì)菌多樣性降低[16-17]。先前研究表明，霉菌毒素OTA的攝入會改變腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，降低有益菌種羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)表達(dá)豐度[18]。這表明霉菌毒素的攝入會影響到人和動物體內(nèi)腸道菌群的結(jié)構(gòu)、多樣性、豐度等，進(jìn)而破壞腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，引發(fā)腸道疾病。近年來，霉菌毒素AFM1與OTA聯(lián)合作用與人們“牛奶+谷物(面包)”的膳食模式息息相關(guān)，AFM1與OTA聯(lián)合攝入對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚，因此研究AFM1與OTA聯(lián)合處理對小鼠腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響具有重要意義。

16S rRNA測序技術(shù)常被用于細(xì)菌的鑒定和分類，此技術(shù)在霉菌毒素對腸道微生物多樣性影響的研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，例如范彩云等[19]利用16S rRNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)AFB1、OTA、玉米赤霉烯酮(ZEN)3種毒素的聯(lián)合作用都能對腸道微生物豐富度帶來不同程度的影響：AFB1+OTA+ZEN>AFB1+OTA>AFB1+ZEN>AFB1。目前國內(nèi)外研究霉菌毒素對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響多集中于AFB1，對AFM1的研究較少，本實(shí)驗(yàn)室前期利用AFB1+AFM1飼喂小鼠研究了其對腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化[20]，但是單獨(dú)AFM1與OTA處理對小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響研究報(bào)道相對較少，另外也未見報(bào)道AFM1與OTA聯(lián)合處理對腸道微生物區(qū)系影響的研究。綜上所述，為了解析AFM1與OTA對小鼠腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)(不同水平表達(dá)豐度與多樣性)的影響，采用AFM1、OTA單獨(dú)及聯(lián)合灌胃小鼠的反復(fù)攻毒試驗(yàn)，采用16S rRNA對ICR小鼠結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行微生物多樣性分析，以明確AFM1和OTA單獨(dú)或聯(lián)合處理對小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

AFM1與OTA粉末均購自中國青島某科技有限公司，純度>99%，1%二甲基亞砜(DMSO)購自中國國藥集團(tuán)，AFM1與OTA粉末均用1% DMSO溶解，用生理鹽水稀釋至目標(biāo)濃度進(jìn)行灌胃。對所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：用341F上游引物和806R下游引物對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)選用48只ICR雄性、4周齡SPF級別健康小鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)于平臺飼養(yǎng)，過程中嚴(yán)格遵循動物飼養(yǎng)管理?xiàng)l例。飼養(yǎng)條件為：常規(guī)鼠用生長飼料自由進(jìn)食、自由飲水，環(huán)境溫度(22±1) ℃，濕度(50±5)%，光照與黑暗環(huán)境每12 h交替1次。

1.3 試驗(yàn)處理及樣品采集

小鼠經(jīng)過1周適應(yīng)期后，正式進(jìn)行毒素灌胃試驗(yàn)。試驗(yàn)分為4組，每組12只，共48只ICR小鼠。毒素灌胃劑量是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期急性毒性經(jīng)口試驗(yàn)確定的[20]，前期研究使用3.5 mg/kg(半數(shù)致死劑量的1/20)AFM1為試驗(yàn)劑量[21-22]。在后期研究中發(fā)現(xiàn)，OTA與AFM1具有相似毒性，所以本試驗(yàn)AFM1與OTA最終采用3.5 mg/kg BW作為試驗(yàn)劑量[23]。對照組灌胃1% DMSO溶液，AFM1組灌胃3.5 mg/kg BW AFM1，OTA組灌胃3.5 mg/kg BW OTA，AFM1+OTA組灌胃3.5 mg/kg BW AFM1+3.5 mg/kg BW OTA，每只小鼠的灌胃體積均為200 μL，灌胃周期為35 d。第35天灌胃結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死小鼠，立即收集12只小鼠結(jié)腸段于液氮中速凍10 min，接著放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4 結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性檢測

采用16S rRNA測序技術(shù)對結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性進(jìn)行檢測。根據(jù)結(jié)腸內(nèi)容物基因組DNA試劑盒HiPure Stool DNA Kits(中國上海信裕生物技術(shù)有限公司)提取樣品中的總DNA，過程參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。DNA濃度和純度的檢測采用NanoDrop1000儀檢測，A260/A280比值在1.8～2.0表示DNA質(zhì)量檢測合格。隨后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用上游引物序列：3′-CCTACGGGNGGCWGCAG-5′；下游引物序列：3′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5′對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：預(yù)變性(95 ℃，3 min)、變性(95 ℃，30 s)、退火(55 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，30 s)，27個循環(huán)后再72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。按照Novaseq 6000系統(tǒng)的PE250平臺模式(中國廣州基迪奧生物科技有限公司)進(jìn)行測序。對低質(zhì)量Reads進(jìn)行過濾，然后將雙端Reads拼接為Tag，再對Tag進(jìn)行低質(zhì)量過濾，得到Clean Tag。接下來基于Clean Tag，使用Usearch軟件進(jìn)行聚類，去除聚類過程中檢測到的嵌合體Tag，獲得操作分類單元(OTU)的豐度和OTU代表序列。將具有高度相似性(97%)的序列歸為1個OTU，對獲得的有效Tag序列進(jìn)行聚類，從而對小鼠結(jié)腸內(nèi)容物OTU進(jìn)行比較分析。運(yùn)用BLAST比對程序在RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類學(xué)分析，估算出樣品6個α多樣性值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用單因素方差分析對各組細(xì)菌群落組成進(jìn)行差異性分析。利用多組組間差異性檢驗(yàn)(Welch’st-test檢驗(yàn))的方法篩選屬水平下不同試驗(yàn)組的差異菌。物種豐度圖和物種堆疊圖用的是R包的GGPLOT2繪制，P<0.05代表顯著差異，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFM1與OTA對小鼠體重的影響

小鼠在適應(yīng)期結(jié)束后1 d開始對小鼠進(jìn)行體重稱量，體重變化如表1所示。從表1中可以看出，與對照組相比，初始體重在AFM1組與OTA組中均無顯著性差異(P>0.05)。AFM1組和AFM1+OTA組中小鼠體重顯著下降出現(xiàn)在霉菌毒素處理7 d之后(P<0.05)。灌胃21 d后，相比于對照組，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組小鼠體重均顯著降低(P<0.05)。灌胃35 d時(shí)，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組小鼠體重均顯著低于對照組(P<0.05)。

表1 AFM1和OTA對小鼠體重的影響Table 1 Effects of AFM1 and OTA on body weight of mice (n=12) g

2.2 各組間小鼠腸道內(nèi)容物OTU比較分析

由圖1所示，與對照組相比，AFM1組中有1 032個共有OTU，特有532個OTU；OTA組中有1 095個共有OTU，特有669個OTU；AFM1+OTA組中有1 065個共有OTU，特有967個OTU。這表明AFM1+OTA組比AFM1組、OTA組小鼠腸道微生物變化更加顯著。

圖1 對照組及試驗(yàn)組OTU韋恩圖Fig.1 Venn analysis of OTU in control group and experimental groups

2.3 各組間小鼠結(jié)腸內(nèi)容物α多樣性分析

由表2可知，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組之間Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)，但是OTA組與AFM1+OTA組之間無顯著性差異(P>0.05)，這表明與對照組相比，小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性在霉菌毒素處理之后都發(fā)生了變化。

表2 霉菌毒素處理對小鼠結(jié)腸內(nèi)容物α多樣性指數(shù)的影響Table 2 Effects of mycotoxin treatment on α diversity indexes of colonic contents in mice (n=12)

2.4 各組間小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成分析

由圖2可知，在門水平上，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組與對照組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成無顯著差異(P>0.05)，小鼠腸道細(xì)菌群落90%以上為優(yōu)勢菌群，分別為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門和疣微菌門。與對照組相比，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中的厚壁菌門相對豐度降低，所占比例從50.58%(對照組)下降到36.87%(AFM1組)、45.93%(OTA組)及39.67%(AFM1+OTA組)；而擬桿菌門相對豐度增加，所占比例從23.81%(對照組)上升到41.98%(AFM1組)、29.23%(OTA組)及31.05%(AFM1+OTA組)；變形菌門相對豐度略有上升，所占比例從7.89%(對照組)上升到9.09%(AFM1組)、9.79%(OTA組)及11.36%(AFM1+OTA組)。相比于對照組，AFM1組和OTA組中有2種細(xì)菌相對豐度降低，分別是藍(lán)細(xì)菌門和疣微菌門，而在AFM1+OTA組中這2種細(xì)菌相對豐度升高。為進(jìn)一步探究，采用霉菌毒素處理后影響腸道菌群的前20個門水平上的相對豐度來制作門水平物種豐度圖，得到圖3。從圖中可以看出，變形菌門在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中相對豐度增加，而厚壁菌門在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中相對豐度降低。

Unclassified：未分類的；Other：其他；Chloroflexi：綠屈撓菌門；Patescibacteria：髕骨細(xì)菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Deferribacteres： 脫鐵桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門。圖2 各組小鼠腸道細(xì)菌門水平相對豐度Fig.2 Relative abundance of intestinal bacteria of mice at phylum level in each group

Bacteroidetes：擬桿菌門；Patescibacteria：髕骨細(xì)菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Kiritimatiellaeota：赤鐵礦菌門；Actinobacteria：放線菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Chlamydiae：衣原體；Firmicutes：厚壁菌門；Chloroflexi：綠屈撓菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Deinococcus-Thermus：異常球菌-棲熱菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌門圖3 各組小鼠腸道細(xì)菌門水平豐度圖Fig.3 Abundance map of intestinal bacteria of mice at phylum level in each group

在科水平上，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組與對照組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成也無較大差異，由圖4可知，與對照組相比，Muribaculaceae在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中相對豐度均增加，AFM1組顯示相對豐度最高(33.09%)，高于OTA組(21.88%)和AFM1+OTA組(21.79%)，而乳桿菌科和普雷沃氏菌科相對豐度在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中均降低。毛螺旋菌科相對豐度占比無明顯變化。疣微菌科相對豐度在對照組、AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中變化不一致，前2組中相對豐度無變化，后2組中相對豐度增加。為進(jìn)一步探究，采用霉菌毒素處理后影響腸道菌群的前20個科水平上的相對豐度來制作門水平物種豐度圖，得到圖5。從圖中可以看出，AFM1+OTA組中相對豐度增加的細(xì)菌分別是疣微菌科和腸桿菌科。

Unclassified：未分類的；Other：其他；Bacteroidaceae：擬桿菌科；Enterobacteriaceae：腸桿菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Rhizobiaceae：根瘤菌科；Akkermansiaceae：艾克曼菌科；Prevotellaceae：普雷沃菌科；Lactobacillaceae：乳桿菌科；Ruminococcaceae：瘤胃菌科；Lachnospiraceae：毛螺旋菌科。圖4 各組小鼠腸道細(xì)菌科水平相對豐度Fig.4 Relative abundance of intestinal bacteria of mice at famliy level in each group

Rhizobiaceae：根瘤菌科；Erysipelotrichaceae：韋榮球菌科；Bifidobacteriaceae：雙歧桿菌科；Ruminococcaceae：瘤胃菌科；Enterobacteriaceae：腸桿菌科；Akkermansiaceae：艾曼菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Rhodanobacteraceae：羅丹諾桿菌科；Lachnospiraceae：毛螺旋菌科；Burkholderiaceae：伯克氏菌科；Clostridiaceae_1：梭菌科_1；Prevotellaceae：普雷沃氏菌科；Bacteroidaceae：擬桿菌科；Micrococcaceae：微球菌科；Dermabacteraceae：皮桿菌科。圖5 各組小鼠腸道細(xì)菌科水平豐度圖Fig.5 Abundance map of intestinal bacteria of mice at famliy level in each group

由圖6可知，在屬水平上，40～60%為未知菌。與對照組相比，毛螺菌屬相對豐度在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中均下降，所占比例從9.13%(對照組)降至8.07%(AFM1組)、7.88%(OTA組)及7.61%(AFM1+OTA組)，同時(shí)，乳酸菌屬相對豐度在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中也下降，所占比例從14.08%(對照組)降至7.37%(AFM1組)、7.48%(OTA組)及3.03%(AFM1+OTA組)。艾克曼菌屬相對豐度在AFM1組和OTA組中下降，但在AFM1+OTA組中上升。為進(jìn)一步探究，采用霉菌毒素處理后影響腸道菌群的前20個門水平上的相對豐度來制作門水平物種豐度圖，得到圖7。從圖中可以看出，AFM1+OTA組中，相對豐度降低的細(xì)菌分別是乳酸菌屬和擬普雷沃菌屬。

Unclassified：未分類的；Other：其他；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌屬_UCG-001；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃氏菌屬；Akkermansia：艾克曼菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌屬NK4A136群。圖6 各組小鼠腸道細(xì)菌屬水平相對豐度Fig.6 Relative abundance of intestinal bacteria of mice at genus level in each group

Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌屬NK4A136群；Lactobacillus：乳桿菌屬；Anaerotruncus：厭氧棍狀菌屬；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌屬_UCG-001；Alloprevotella：擬普雷沃氏菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Brachybacterium：短狀桿菌屬；Akkermansia：艾克曼菌屬；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃菌科屬_UCG-014；Blautia：勞特氏菌；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬_1；Oscillibacter：顫桿菌克屬。圖7 各組小鼠腸道細(xì)菌屬水平豐度圖Fig.7 Abundance map of intestinal bacteria of mice at genus level in each group

2.5 各組間小鼠結(jié)腸內(nèi)容物差異菌群篩選結(jié)果分析

采用Welch’st-檢驗(yàn)篩選得到了門、科和屬水平下不同組的差異菌群并對其進(jìn)行分析(圖8～圖10)，結(jié)果以P<0.05為閾值。

Chloroflexi：綠屈撓菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；BRC1：BRC1門；95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Mean abundance：物種豐度均值；Diff in mean proportions：組間豐度差值。圖8 各組小鼠腸道細(xì)菌門水平差異菌群Fig.8 Difference flora of intestinal bacteria of mice at phyla level in each group

Propionibacteriaceae：丙酸桿菌科；Sphingobacteriaceae：鞘脂桿菌科；Erysipelotrichaceae：韋榮球菌科；95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Mean abundance：物種豐度均值；Diff in mean proportions：組間豐度差值。圖9 各組小鼠腸道細(xì)菌科水平差異菌群Fig.9 Difference flora of intestinal bacteria of mice at family level in each group

Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃菌科屬_UCG-014；Methylobacterium：甲基桿菌屬；Eubacterium_brachy_group：短優(yōu)桿菌屬群；Clostridium_sensu_stricto_1：梭狀芽胞桿菌屬；Candidatus_Saccharimonas：候選單胞生糖菌屬；Brevundimonas：短波單胞菌屬；Eubacterium_coprostanoligenes_group：真桿菌屬群；Vibrio：弧菌屬；Veillonella：韋榮氏球菌屬；Intestinibacter：腸桿菌屬；95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Mean abundance：物種豐度均值；Diff in mean proportions：組間豐度差值。圖10 各組小鼠腸道細(xì)菌屬水平差異菌群Fig.10 Difference flora of intestinal bacteria of mice at genus level in each group

由圖8可知，在門水平，與對照組相比，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組相對豐度顯著降低(P<0.05)的細(xì)菌分別為：綠屈撓菌門、酸桿菌門、BRC1門、綠屈撓菌門細(xì)菌。

由圖9可知，在科水平，與對照組相比，Muribaculaceae和Saccharimonadaceae、韋榮球菌科3種細(xì)菌相對豐度均顯著增加(P< 0.05)，前2種細(xì)菌相對豐度的變化出現(xiàn)在AFM1組中，而后1種細(xì)菌相對豐度的變化出現(xiàn)在OTA組中；丙酸桿菌科、柄桿菌科、鞘脂桿菌科、丙酸桿菌科這4種細(xì)菌相對表達(dá)豐度均顯著下降(P<0.05)，同樣，前2種細(xì)菌相對豐度的變化出現(xiàn)在AFM1組中，而后2種細(xì)菌相對豐度的變化出現(xiàn)在OTA組中；AFM1+OTA組中無顯著差異細(xì)菌。

由圖10可知，在屬水平，與對照組相比，AFM1(灌胃3.5 mg/kg BW AFM1)處理后，表達(dá)豐度顯著升高(P<0.05)的細(xì)菌為瘤胃菌科屬_UCG-014、候選單胞生糖菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、和短優(yōu)桿菌屬；表達(dá)豐度顯著降低(P<0.05)的細(xì)菌為甲基桿菌屬和短波單胞菌屬。在OTA組(灌胃3.5 mg/kg BW OTA)中，相對豐度顯著升高(P<0.05)的細(xì)菌為瘤胃菌科屬、真桿菌屬、短優(yōu)桿菌屬、Family_XIII_AD3011_group。AFM1+OTA(混合灌胃3.5 mg/kg BW AFM1+3.5 mg/kg BWOTA)處理后，相對豐度顯著升高(P<0.05)的細(xì)菌為梭狀芽胞桿菌屬、腸桿菌屬、短優(yōu)桿菌屬和韋榮氏球菌屬；相對豐度顯著下降(P<0.05)的細(xì)菌只有弧菌屬。

3 討 論

近年來隨著研究的不斷深入，腸道菌群與人類健康之間的關(guān)系備受關(guān)注。腸道菌群被證明能夠結(jié)合、轉(zhuǎn)化、降解和轉(zhuǎn)移霉菌毒素[24-26]，許多外部環(huán)境因素影響著其多樣性、形態(tài)結(jié)構(gòu)和豐度[27]，并且在調(diào)節(jié)機(jī)體生理和病理生理的變化中有著不可或缺的作用[28]。健康的腸道微生物可以調(diào)節(jié)腸道感染，維持免疫系統(tǒng)活躍度，在腸道中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[29]。腸道菌群失衡可導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)過度活躍，從而引發(fā)宿主炎癥和自身免疫性疾病[30-31]。目前的研究報(bào)道表明，腸道微生物的變化從某種角度上反映著動物是否健康，微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化可能誘發(fā)某些疾病[32-33]。

霉菌毒素?cái)z入機(jī)體后最終會影響腸道原有的微生物屏障功能。本研究從門、科、屬水平對各組間小鼠腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成分析可知，AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理并未使小鼠腸道菌群多樣性發(fā)生明顯變化。霉菌毒素組與對照組相比優(yōu)勢菌群無明顯差異，但是霉菌毒素組造成了菌種相對表達(dá)豐度的變化。門水平上，與對照組相比，厚壁菌門細(xì)菌在單獨(dú)或聯(lián)合霉菌毒素處理組中相對表達(dá)豐度均下降，這與小鼠體重下降趨勢一致。先前研究表明，厚壁菌門相對豐度的下降與體重有關(guān)[34]，但另外一項(xiàng)研究中，厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度在高體重生長豬和低體重生長豬之間無顯著差異[35]。這表明霉菌毒素處理與體重之間存在聯(lián)系，而本研究結(jié)果顯示霉菌毒素處理之后小鼠體重明顯下降。研究報(bào)道短時(shí)間暴露在ZEN中并未引起腸道菌群結(jié)構(gòu)(多樣性)發(fā)生顯著變化[36]，這與本研究結(jié)果一致。研究報(bào)道，肉雞攝入脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)污染的飼料或用ZEN、DON處理小鼠等，腸道中3種細(xì)菌，如厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門相對豐度均會發(fā)生變化，但變化情況不同[37-39]。這些不一致性可能是由于動物類型和年齡、霉菌濃度、毒素條件(自然污染或純化粉末)、處理時(shí)間、天氣條件和膳食組成的變化所造成的。在科水平，先前研究報(bào)道短期ZEN暴露明顯引起腸道乳桿菌相對豐度減少[36]，這與本研究霉菌毒素處理導(dǎo)致乳桿菌科的相對豐度降低結(jié)果一致。另一研究中表明，小鼠在經(jīng)過DON處理后毛螺旋菌科相對豐度增加[40]。而本研究中3個霉菌毒素處理組中毛螺旋菌科相對豐度未發(fā)生變化，瘤胃球菌科以及腸桿菌科這2種細(xì)菌在小鼠腸道內(nèi)相對豐度增加。所以，AFM1和OTA這2種霉菌毒素可能會通過增加致病菌數(shù)量來損傷小鼠微生物屏障。在屬水平，霉菌毒素處理后會降低有益菌種相對豐度，這與前人研究OTA進(jìn)入腸道后會改變腸道穩(wěn)態(tài)，還會降低有益菌種相對豐度[18]結(jié)果一致。但研究報(bào)道OTA在對大鼠進(jìn)行28 d灌胃后，其腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，乳酸菌屬相對豐度增加[41]，這與本研究結(jié)果相反。這表明AFM1和OTA這2種霉菌毒素可能會通過降低益生菌相對豐度來損傷小鼠微生物屏障。通過對各組小鼠腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)的分析可知，無論是門水平、科水平還是屬水平，與對照組相比，霉菌毒素處理組并未使腸道微生物多樣性發(fā)生顯著變化，但不同的霉菌毒素處理造成了不同門、科及屬水平菌群相對豐度的差異變化。

α多樣性指數(shù)常用來反映腸道菌群的多樣性和豐富度。Chao1、Sobs、Ace指數(shù)越大說明腸道菌群的豐富度越高，物種越豐富，而Simpson指數(shù)則反映的是多樣性，其值越大說明群落多樣性越低，Shannon指數(shù)剛好相反。對本試驗(yàn)中48個樣本的α多樣性分析結(jié)果表明，雖然AFM1與OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理未顯著影響小鼠腸道微生物群落豐富度和多樣性，但與對照組相比，小鼠腸道細(xì)菌相對豐度有增加趨勢。研究表明，黃曲霉毒素會導(dǎo)致原生動物瘤胃菌群失調(diào)，從而對纖維素利用率、揮發(fā)性脂肪酸含量、酶活性等產(chǎn)生影響，最終會影響奶牛的產(chǎn)奶量和進(jìn)食量[42]，因此，推測AFM1與OTA聯(lián)合處理可能是通過腸道微生物來影響動物健康的。在本試驗(yàn)中，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在不同組間差異性均不顯著，這可能與本試驗(yàn)采用霉菌毒素處理時(shí)間相關(guān)，因?yàn)槟c道菌群在腸道中的定植需要較長一段時(shí)間。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，利用16S rRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，雖然AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理并未使小鼠腸道菌群總體豐度和多樣性明顯發(fā)生變化，但在菌群總體相對豐度上，AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理在門、科、屬水平上存在差異。AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理增加了影響小鼠腸道健康的致病菌相對豐度，降低了保護(hù)小鼠腸道健康的益生菌相對豐度，從而改變了腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步損傷腸道微生物屏障，這表明AFM1和OTA這2種霉菌毒素可能破壞了小鼠腸道微生物屏障。