飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能、血清免疫指標(biāo)、轉(zhuǎn)錄組及腸道菌群的影響

王紅明 丁雪婧 陳 儉 宋守鋼 譚北平,2 章 雙,2*

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；2.農(nóng)業(yè)部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088)

寡糖，又稱低聚糖，是一種具有2～20個(gè)糖單位的碳水化合物，糖單位間通過糖苷鍵連接而成。孫青云等[5]研究表明，寡糖能降低動物腸道pH、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、促進(jìn)動物腸道內(nèi)健康微生物菌群形成和提高動物機(jī)體免疫力。而甘露寡糖(mannan-oligosaccharides，MOS)作為一類從酵母細(xì)胞壁提取出來的葡萄糖-甘露寡糖蛋白復(fù)合物，能參與多種生物功能和多種生理過程，具有吸附病原菌的功能[6]。在家禽[7]和仔豬[8]等動物中已發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖可通過提高機(jī)體腸道的微生態(tài)狀況，減少胃腸道疾病，從而提高動物免疫功能。甘露寡糖作為綠色添加劑在水產(chǎn)動物研究較為廣泛，可以提高水產(chǎn)動物生長性能，優(yōu)化腸道菌群，促進(jìn)腸道發(fā)育，提高水產(chǎn)動物免疫功能，在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[9]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[10]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus)[11]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[12]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[13]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[14]等物種的養(yǎng)殖中均有應(yīng)用。甘露寡糖在水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖中的積極作用已被廣泛證實(shí)，但是大多從動物生長性能、生理生化和組織形態(tài)改變等宏觀層面進(jìn)行考察，利用高通量測序技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組和腸道菌群方面對甘露寡糖功能進(jìn)行的研究還不多見。

高通量測序已經(jīng)成為一種常規(guī)的試驗(yàn)技術(shù)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)錄水平和腸道菌群分析等。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)利用高通量測序來全面快速地獲得特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息和表達(dá)信息，準(zhǔn)確地分析基因表達(dá)差異、結(jié)構(gòu)變異和分子標(biāo)記等生命科學(xué)的重要問題[15]?；?6S rRNA基因高通量測序已成為動物腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成及多樣性分析的常用技術(shù)[16]。在水產(chǎn)動物中，高通量測序也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組和腸道菌群分析，用以研究生長、發(fā)育、免疫等相關(guān)生命活動的作用機(jī)制[17-18]。目前，轉(zhuǎn)錄組測序和腸道菌群分析已被用于石斑魚生長調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)的作用機(jī)制研究。王登東等[19]和張海艷等[20]采用轉(zhuǎn)錄組測序分別分析了云龍石斑魚雜交生長優(yōu)勢形成的機(jī)制和β-葡聚糖調(diào)節(jié)魚類免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制。Ye等[21-22]采用16S rRNA高通量測序發(fā)現(xiàn)了花生粕和脫酚棉籽蛋白對珍珠龍膽石斑魚生長和腸道健康的影響作用。

甘露寡糖已被用于石斑魚養(yǎng)殖中。Ren等[23]從免疫相關(guān)酶活性、免疫相關(guān)基因表達(dá)、腸道切片以及生長性能等方面研究珍珠龍膽石斑魚幼魚，結(jié)果表明飼料中添加甘露寡糖料不能改善珍珠龍膽石斑魚幼魚的生長性能和飼料利用率，但可以通過改善腸道形態(tài)完整性、增強(qiáng)抗氧化能力和非特異性免疫、增加免疫相關(guān)基因表達(dá)、降低腸道和肝臟中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)腸道健康和維持免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，多種魚類消化道內(nèi)某些細(xì)菌能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白質(zhì)水解酶、脂肪分解酶等胞外酶，用以促進(jìn)魚類消化脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的能力，進(jìn)而提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[18]。目前為止，利用高通量測序分析甘露寡糖對石斑魚影響的研究暫未有報(bào)道?；诖?，本研究選取珍珠龍膽石斑魚為研究對象，研究飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能、血清免疫指標(biāo)、轉(zhuǎn)錄組及腸道菌群的影響，以探究甘露寡糖調(diào)控珍珠龍膽石斑魚免疫的作用機(jī)理，為水產(chǎn)飼料行業(yè)尋求替代抗生素的物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料

以魚粉、豆粕、玉米蛋白粉為主要蛋白質(zhì)源，以魚油、玉米油為主要脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，甘露寡糖組在基礎(chǔ)飼料中添加100 mg/kg甘露寡糖。甘露寡糖購自青島某生物技術(shù)有限公司，甘露寡糖添加量參照于朝磊等[9]、Ren等[23]、徐磊等[24]的研究。試驗(yàn)飼料具體制作及營養(yǎng)成分分析方法參照本實(shí)驗(yàn)室Ye等[22]、Liu等[25]的研究。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content預(yù)混料 Premix1.00誘食劑 Attractant0.15磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.50維生素C Vitamin C0.20氯化膽堿 Choline chloride0.50抗氧化劑 Antioxidant0.05合計(jì) Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels粗蛋白質(zhì) Crude protein50.18粗脂肪 Crude lipid 11.63

每千克預(yù)混料含 One kg premix contained the following: VA 675 000 IU，VD3180 000 IU，VE 6 000 mg，VK31 200 mg，VB1900 mg，VB21 350 mg，VB61 050 mg，VB127.5 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 4 500 mg，煙酸 nicotinic acid 6 750 mg，葉酸 folic acid 375 mg，生物素 biotin 15 mg，維生素C磷酸酯 vitamin C phosphate 42 860 mg，肌醇 inositol 10 000 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 64 286 mg，ZnSO4·H2O 26 283 mg，MnSO4·H2O 19 688 mg，Ca(IO3)2·H2O 128.6 mg，CoCl2·6H2O 323 mg，CuSO4·5H2O 2,357 mg，Na2SeO387.6 mg。

1.2 試驗(yàn)用魚與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用魚來源于湛江市南三島商業(yè)養(yǎng)殖基地，購回后于4.5 m×4.9 m×1.8 m的室外水泥池暫養(yǎng)2周，以適應(yīng)試驗(yàn)條件。試驗(yàn)在玻璃鋼桶(0.5 m3)中進(jìn)行，挑選240尾初始平均體重為(6.00±0.32) g的體質(zhì)健壯無病的幼魚，隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾魚，養(yǎng)殖8周。養(yǎng)殖過程中，每天分別于08:00和17:00按照魚體重的3%～5%進(jìn)行飽食投喂2次(第1顆飼料沉入桶底未被攝食視為飽食)，投喂量依據(jù)攝食情況和天氣變化調(diào)整。具體養(yǎng)殖條件為：水體溫度28～30 ℃，鹽度21%～24%，溶氧量≥6.8 mg/L。每天按照換養(yǎng)殖水體1/3的水量換水1次。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)用魚在養(yǎng)殖期結(jié)束后禁食24 h。記錄存活尾數(shù)、體重和體長，以進(jìn)行生長性能分析。從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取8尾魚，丁香酚麻醉后采用尾靜脈取血法抽取全血，每尾魚抽取1 mL后混合。按照海水魚淋巴細(xì)胞分離液試劑盒(產(chǎn)品編號：P9980，北京索萊寶科技有限公司始)說明書進(jìn)行操作，得到血細(xì)胞和血清樣品，于-80 ℃保存待測。其中，對照組和甘露寡糖組中3個(gè)重復(fù)的血細(xì)胞樣品分別混合后用于轉(zhuǎn)錄組測序，每組中每個(gè)重復(fù)的血清樣品分別用于免疫指標(biāo)測定。另外，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4尾魚，取剝離腸道外脂肪組織的后腸混合成為1個(gè)樣品，置于液氮后于-80 ℃保存待測，用于腸道菌群測定。

1.4 生長性能分析

選用存活率(survival rate，SR)、增重率(weight gain rate，WGR)、特定生長率(specific growth rate，SGR)、肥滿度(condition factor，CF)、飼料系數(shù)(feed coefficient rate，F(xiàn)CR)作為生長性能指標(biāo)，參照Ye等[22]和Liu等[25]的研究，分別按以下公式計(jì)算：

SR(%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；
WGR(%)=100×(終末總重-
初始總重)/初始總重；
SGR(%/d)=100×(ln終末總重-
ln初始總重)/飼喂天數(shù)；
CF(g/cm3)=100×魚體重/魚體長度3;
FCR=攝入飼料干重/(終末總重+
死亡個(gè)體總重-初始總重)。

1.5 血清免疫指標(biāo)分析

選用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、溶菌酶(lysozyme，LZM)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)作為血清免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測。血清SOD、CAT、ACP、AKP、LZM活性和MDA含量分別采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的SOD(產(chǎn)品編號：A001-3-2)、CAT(產(chǎn)品編號：A007-1-1)、ACP(產(chǎn)品編號：A060-2-1)、AKP(產(chǎn)品編號：A059-2-2)、LZM(產(chǎn)品編號：A050-1-1)、MDA(產(chǎn)品編號：A003-1-2)試劑盒進(jìn)行測定。

1.6 血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

采用TRIzol試劑盒(Invitrogen公司，美國)提取樣品總RNA后，委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成文庫的構(gòu)建和測序工作，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM進(jìn)行測序。去除測序接頭和低質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)過濾原始數(shù)據(jù)后，采用Trinity Assembly Software軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接并聚類，取最長轉(zhuǎn)錄本為非重復(fù)序列基因(Unigene)進(jìn)行質(zhì)量評估和統(tǒng)計(jì)。所有Unigene分別在6個(gè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，其中包括Nr、KEGG、Swissprot和KOG數(shù)據(jù)庫。利用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)和log2差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)來進(jìn)行篩選，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。對基因進(jìn)行定量和差異分析，取差異顯著的基因用于KEGG和GO富集分析。

1.7 腸道菌群分析

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行非配對樣本t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能的影響

如表2所示，甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚的終末體重、WGR、SGR和CF均顯著高于對照組(P<0.05)。甘露寡糖組和對照組之間珍珠龍膽石斑魚的FCR和SR無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能的影響Table 2 Effects of dietary MOS on growth performance of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus (n=3)

2.2 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚血清免疫指標(biāo)的影響

如表3所示，與對照組相比，甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚的血清SOD、CAT、LZM和AKP活性均顯著升高(P<0.05)，血清MDA含量顯著降低(P<0.05)。甘露寡糖組和對照組之間珍珠龍膽石斑魚的血清ACP活性無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚血清免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary MOS on serum immune indices of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus (n=3)

2.3 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

2.3.1 血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和序列組裝

利用Illumina平臺進(jìn)行測序，如表4所示，除去銜接子并過濾了低質(zhì)量序列后留下了高質(zhì)量堿基(clean bases)合計(jì)為14 462 786 068 nt。從原始讀長(raw reads)濾過后得到97 715 428個(gè)高質(zhì)量讀長(clean reads)。其中，對照組從47 953 578個(gè)原始讀長中產(chǎn)生了46 493 708個(gè)高質(zhì)量讀長，甘露寡糖組從52 713 580個(gè)原始讀長中產(chǎn)生了51 221 720個(gè)高質(zhì)量讀長。

表4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 4 Transcriptome sequencing data statistics

如表5所示，通過Trinity軟件組裝獲得總長度為74 614 602 nt，Unigene總數(shù)為79 291個(gè)，Unigene平均長度為941 bp，N50長度為2 141 bp，N90長度為318 bp。

表5 轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of transcriptome assembly data

進(jìn)一步對Unigene做質(zhì)量評估，作長度分布統(tǒng)計(jì)圖，如圖1所示，長度小于1 000 bp的Unigene較集中分布在2 700～2 999 nt區(qū)間；長度大于1 000 bp的Unigene有63 455個(gè)，占總數(shù)80.03%。組裝結(jié)果表明測序質(zhì)量良好。

圖1 Unigene序列長度統(tǒng)計(jì)Fig.1 Unigene sequence length statistics

2.3.2 Unigene功能注釋

如圖2所示，通過對組裝的測序結(jié)果分析，一共注釋到28 811個(gè)Unigene，占比36.34%。其中，在Nr、KEGG、Swissprot和KOG數(shù)據(jù)庫中分別注釋到28 664、14 866、19 668和16 506個(gè)Unigene。將組裝獲得的Unigene在Nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示注釋最多的5個(gè)物種分別為大黃魚(Larimichthyscrocea)(6 381個(gè)，22.26%)、盲曹魚(Latescalcarifer)(6 335個(gè)，22.10%)、斑馬魚(Stegastespartitus)(2 493個(gè)，8.70%)、革首南極魚(Nototheniacoriiceps)(1 578個(gè)，5.51%)和尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(1 128個(gè)，3.94%)。

圖2 轉(zhuǎn)錄組中Unigene的注釋 Fig.2 Annotation of Unigene from transcriptome

如圖3所示，KOG注釋結(jié)果顯示，32 518個(gè)Unigene聚類被分為25個(gè)功能類別。Unigene在一般功能預(yù)測(general function prediction only)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(singnal transduction)和翻譯后藥物、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶(posttranslational medication, protein turnover, chaperones)3個(gè)功能類別中富集最多，含有Unigene數(shù)目分別為6 347、6 108和3 129個(gè)，分別占比19.52%、18.78%和9.62%。其中，富集于細(xì)胞運(yùn)動(cell motility)功能上的Unigene最少，只有88個(gè)。

圖3 KOG聚類分析圖Fig.3 KOG cluster analysis diagram

如圖4所示，通過Blast2GO軟件得到Unigene的GO注釋信息，分別有17 795、7 625和9 745個(gè)Unigene注釋到參與到生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組成(cell component)中。在生物過程一類中，Unigene主要注釋到細(xì)胞過程(cell process)和新陳代謝過程(metabolic process)，分別有4 026和3 557個(gè)Unigene。在分子功能一類中，Unigene主要注釋到催化活性(catalytic activity)(2 988個(gè)Unigene)和結(jié)合(binding)，分別有2988和3 499個(gè)Unigene。在細(xì)胞組成一類中，Unigene主要注釋到細(xì)胞(cell)和細(xì)胞部分(cell part)，均有2 130個(gè)Unigene。

圖4 Unigene的GO分類Fig.4 GO classification of Unigene

根據(jù)KEGG注釋信息可知，總共6 912個(gè)Unigene注釋到5個(gè)特定的通路中，包括生物系統(tǒng)(organism system)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、代謝(mentabolism)和細(xì)胞過程。

2.3.3 差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)分析

以FDR<0.05且|log2FC|>1為條件篩選甘露寡糖組和對照組之間DEG，結(jié)果如圖5所示，一共鑒定出9 964個(gè)DEG，包含3 801個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和6 163個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。

橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)對數(shù)值，縱坐標(biāo)表示FDR的負(fù)Log10值。The abscissa represented the logarithm value of difference multiple, and the ordinate represented the negative log10 value of FDR.圖5 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.5 Volcano map of DEG

DEG的GO功能富集分析結(jié)果如圖6所示，分別有5 592、3 131和5 274個(gè)Unigene注釋到參與的生物過程、細(xì)胞組成和分子功能中。在生物過程一類中，富集到細(xì)胞過程的DEG數(shù)目最多(72.59%顯著下調(diào))，其次為新陳代謝過程、單一生物代謝過程。在細(xì)胞組成一類中，富集到膜和膜部分中的DEG數(shù)目最多，其中膜有53.85%顯著下調(diào)，膜部分有47.34%顯著下調(diào)。在分子功能一類中，富集到結(jié)合中的DEG數(shù)目最多，有66.98%顯著下調(diào)。

圖6 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析Fig.6 GO functional enrichment analysis of DEG

DEG的KEEG富集分析如圖7所示，共有741個(gè)DEG被注釋到171個(gè)通路中，甘露寡糖和對照組之間差異最大的20條KEGG富集通路中，與新陳代謝有關(guān)且差異顯著的信號通路有11個(gè)，分別為煙酸與煙酰胺代謝(nicotinate and nicotinamide metabolism)、精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)、微生物在不同環(huán)境中的代謝(microbial metabolism in diverse environments)、泛酸與CoA生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)、初級膽汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、芳香族化合物的降解(degradation of aromatic compounds)、D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝(D-glutamine andD-glutamate metabolism)、亞油酸代謝(linoleic acid metabolism)、碳代謝(carbon metabolism)、初級膽汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)。與免疫有關(guān)且差異顯著的信號通路有4個(gè)，分別為吞噬體(phagosome)、細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)(intestinal immune network for IgA production)。其中，吞噬體和細(xì)胞黏附分子信號通路為顯著富集DEG數(shù)目最多的2條信號通路，含有DEG數(shù)目分別為52和46個(gè)。此外，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路中顯著富集的DEG數(shù)目有34個(gè)，免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號通路中顯著富集的DEG數(shù)目有13個(gè)。

圖7 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEG

2.4 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的影響

2.4.1 珍珠龍膽石斑魚腸道菌群多樣性分析

珍珠龍膽石斑魚腸道菌群α多樣性分析如表6所示，甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的OTU數(shù)量、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，甘露寡糖組和對照組之間Simpson指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

表6 珍珠龍膽石斑魚腸道菌群α多樣性分析Table 6 Alpha diversity analysis of intestinal microflora of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus (n=3)

基于加權(quán)Bray-Curtis距離進(jìn)行的PCoA如圖8所示，2個(gè)PCoA軸占2組之間變異的80.09%。甘露寡糖組在圖的下方，靠近主坐標(biāo)(PCo1)，占總變化的71.52%。β多樣性分析結(jié)果表明不同處理可顯著影響腸道菌群的組成。

圖8 主坐標(biāo)分析Fig.8 PCoA

2.4.2 腸道菌群組成

珍珠龍膽石斑魚腸道門水平菌群組成如圖9所示，在門水平上，對照組和甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚腸道中的菌群組成相同，包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，四者總相對豐度都超過了98%，還有部分未鑒定出及相對豐度極少的門類。不同門類菌群在2組中相對豐度有差異，甘露寡糖組中變形菌門相對豐度小于對照組，而擬桿菌門、藍(lán)藻門、厚壁菌門相對豐度高于對照組，其中，甘露寡糖組擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度顯著高于對照組(P<0.05)。

A：單個(gè)樣品中菌群相對豐度；B：不同組中菌群的平均相對豐度；C：優(yōu)勢菌群相對豐度比較。*代表與對照組差異顯著(P<0.05)。下表同。A: microflora relative abundance of single sample; B: microflora mean relative abundance of indifferent groups; C: comparison of dominant microflora relative abundance. * mean significant difference compared with the control group (P<0.05). The same as below.圖9 珍珠龍膽石斑魚腸道門水平菌群組成Fig.9 Intestinal microflora composition at phylum level of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus

如圖10所示，在屬水平上，對照組和甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚腸道中菌群組成相同，包括無色桿菌屬(Achromobacter)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、紅游動菌屬(Rhodoplanes)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。與對照組相比，甘露寡糖組中發(fā)光桿菌屬相對豐度顯著下降(P<0.05)，而德沃斯氏菌屬、鹽單胞菌屬和甲基桿菌屬相對豐度顯著升高(P<0.05)。

圖10 珍珠龍膽石斑魚腸道屬水平菌群組成Fig.10 Intestinal microflora composition at genus level of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus

3 討 論

3.1 飼料中添加甘露聚糖對珍珠龍膽石斑魚生長性能的影響

基于國內(nèi)外研究，飼料中添加甘露寡糖對畜禽類動物幼體有促進(jìn)生長的作用[8,26]。而飼料中添加適宜的甘露寡糖是否能夠有效促進(jìn)水產(chǎn)動物生長性能尚存在較大的爭議[23]。Lu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加不同水平的甘露寡糖可提高草魚(Ctenopharyngodonidella)幼魚終末體重和WGR。馬志紅等[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1 g/kg甘露寡糖添能顯著提高鯉魚(Cyprinuscarpio)的WGR，降低FCR。高瞻[29]研究表明，飼料中添加甘露寡糖可以降低花鱸(Lateolabraxjaponicas)機(jī)體水分含量，同時(shí)提高機(jī)體粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量，有效改善魚肉的品質(zhì)，提高WGR，降低FCR。本試驗(yàn)中，飼料中添加100 mg/kg甘露寡糖顯著提高了珍珠龍膽石斑魚的終末體重、WGR、SGR和CF，但對SR和FCR無顯著影響。但是，Ren等[23]在飼料中添加甘露寡糖的研究表明，添加0.3%～2.0%的甘露寡糖對龍虎斑的生長性能均無顯著影響，這可能與甘露寡糖的添加量有直接關(guān)系，0.3%～2.0%的甘露寡糖添加量與其他研究相比，明顯高出許多?？傮w而言，上述研究表明，盡管養(yǎng)殖品種有所差異，飼料中添加適量的甘露寡糖可顯著提高動物的生長性能。

3.2 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚血清免疫指標(biāo)的影響

SOD可催化氧自由基對過氧化氫和分子氧的歧化作用，提高吞噬細(xì)胞防御功能，在動物機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中起重要作用[30]。LZM是一種水解N-乙酰壁酸和N-乙酰葡糖胺的酶，是生物體內(nèi)重要的免疫因子之一，已在魚類組織、血清和黏液中發(fā)現(xiàn)，并且大量存在于血細(xì)胞中。AKP是一種非特異性磷酸水解酶，可催化磷酸單脂的水解，促進(jìn)磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在動物代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用[31]。CAT可清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基，是一種保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整的酶類[32]。甘露寡糖具有抗原的特性，能夠刺激動物機(jī)體做出免疫應(yīng)答反應(yīng)[30]。本試驗(yàn)中，飼料中添加甘露寡糖顯著提高了珍珠龍膽石斑魚血清中SOD、AKP、LZM和CAT活性。與本試驗(yàn)結(jié)果一致的是，飼料中添加甘露寡糖顯著提高半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)稚魚體內(nèi)SOD、CAT和LZM活性，提高腸道發(fā)育和非特異性免疫水平[9]；飼料中添加0.2%～0.3%魔芋甘露寡糖可以顯著增強(qiáng)黃顙魚血清SOD和LZM活性，增加其免疫器官指數(shù)[33]；楊敏等[14]在飼料中添加適宜的甘露寡糖，可顯著提高歐洲鰻鱺血清SOD、AKP、LZM活性。劉愛君等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露寡糖能顯著提高奧尼羅非魚血清SOD和AKP活性。MDA是一種有害物質(zhì)，其含量的升高是氧自由基過多產(chǎn)生的一種反應(yīng)，損害細(xì)胞膜的流動性，MDA含量降低表明對機(jī)體產(chǎn)生的毒性降低。此外，在本研究中，甘露聚糖組珍珠龍膽石斑魚血清MDA含量較對照組顯著降低，這與Lu等[27]在草魚中的研究結(jié)果一致。上述研究都表明飼料中添加甘露寡糖能在一定程度提高動物機(jī)體的免疫相關(guān)酶活性，從而提高動物免疫功能。

3.3 飼料中添加甘露聚糖對珍珠龍膽石斑魚血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

轉(zhuǎn)錄組研究可基于特定條件下基因的表達(dá)信息來推測未知基因的功能，進(jìn)而揭示基因在相應(yīng)通路中的作用機(jī)制。在魚類中，轉(zhuǎn)錄組測序已被廣泛應(yīng)用，主要用途包括檢測基因功能、篩選DEG及開發(fā)分子標(biāo)記等。例如張海艷等[20]對β-葡聚糖刺激下斜帶石斑魚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，獲得了DEG以及免疫相關(guān)條目，并篩選出部分顯著性差異表達(dá)的免疫基因。石立冬等[34]研究牛磺酸對紅鰭東方鲀的熱應(yīng)激調(diào)控的影響，獲得了DEG的數(shù)據(jù)以及DEG注釋的具體通路，為研究牛磺酸對紅鰭東方鲀的熱應(yīng)激調(diào)控的影響和?；撬峥箲?yīng)激功能提供參考數(shù)據(jù)。朱婷芳等[35]對大彈涂魚單核巨噬細(xì)胞低氧脅迫比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，獲得了不同時(shí)間巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并且篩選出了相關(guān)DEG。珍珠龍膽石斑魚作為重要的海水養(yǎng)殖品種，其全基因序列還未公布，從基因水平研究飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚免疫保護(hù)機(jī)制存在限制。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，鑒定出DEG顯著影響了魚體細(xì)胞組成、細(xì)胞代謝過程和分子功能等方面，這些改變暗示了細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)與功能可能發(fā)生了重大改變。本研究中發(fā)現(xiàn)具有最多Unigene的條目是結(jié)合、催化活性、細(xì)胞過程、代謝過程和細(xì)胞組成，這些過程對機(jī)體正常生命活動很重要。此外，KEEG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，DEG被注釋到171個(gè)通路中，與免疫緊密相關(guān)的吞噬體通路、細(xì)胞黏附因子通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路以及免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)通路差異顯著，且顯著富集的DEG數(shù)目較多，其中吞噬體通路和細(xì)胞黏附因子通路是顯著富集DEG數(shù)目最多的2條信號通路，這些結(jié)果提示甘露寡糖的添加對珍珠龍膽石斑魚的免疫功能產(chǎn)生了顯著影響。吞噬體是通過吞噬固有免疫細(xì)胞攝取顆粒而形成的高度動態(tài)的細(xì)胞器，在微生物清除和抗原呈遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。細(xì)胞黏附分子是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱，以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，參與多種細(xì)胞活動，是免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生等重要生理病理過程的分子基礎(chǔ)[37]。細(xì)胞因子是指主要由免疫細(xì)胞分泌的小分子多肽，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長等多種功能，其發(fā)揮作用是通過與靶細(xì)胞膜表面的受體相結(jié)合并將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部而完成的，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[38]。由此可見，飼料中添加甘露寡糖調(diào)控珍珠龍膽石斑魚的免疫功能的可能機(jī)制是甘露寡糖的攝入激活魚體內(nèi)免疫細(xì)胞中吞噬體的產(chǎn)生，進(jìn)而通過細(xì)胞黏附分子信號通路將信號傳遞，刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子，起到免疫調(diào)節(jié)作用。這一機(jī)制在單胃動物的研究中已被提出[39]，但在魚類中還有待進(jìn)一步證實(shí)。

3.4 飼料中添加甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚腸道菌群的影響

腸道本身具有重要的功能，腸道微生物的作用也不可忽視，腸道有益菌群具有營養(yǎng)、免疫、抑制病原菌、定植阻抗等作用[40]，而有害菌會使黏膜層滲透性增加，讓病原和食物大分子穿過黏膜屏障[41]。腸道微生物對魚類的健康也發(fā)揮重要作用。在斑馬魚(Daniorerio)中，腸道微生物可以調(diào)節(jié)消化道基因的表達(dá)，促進(jìn)營養(yǎng)代謝和免疫反應(yīng)[42]。在人類及其他哺乳動物、爬行動物蛇[43]和蜥蜴[44]、青石斑魚[45]腸道菌群中，厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌群，其中的大部分細(xì)菌參與了食物的消化和代謝。本研究中，飼料中添加甘露寡糖后，珍珠龍膽石斑魚腸道中擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度較對照組顯著升高。擬桿菌門和厚壁菌門是人類腸道內(nèi)的優(yōu)勢有益菌，結(jié)合本研究中甘露寡糖對珍珠龍膽石斑魚免疫的促進(jìn)作用可知，飼料中添加甘露寡糖可能通過提高珍珠龍膽石斑魚腸道中有益菌的相對豐度進(jìn)而使其免疫功能得到提高，這一結(jié)果與譚蓉等[46]的研究結(jié)果中腸道炎癥伴隨著擬桿菌門相對豐度的下降相吻合。飼料中添加甘露寡糖后珍珠龍膽石斑魚腸道菌群在屬水平上相對豐度的變化也進(jìn)一步說明了這一點(diǎn)。與對照組相比，甘露寡糖組石斑魚腸道中發(fā)光桿菌屬相對豐度顯著下降，而德沃斯氏菌屬、鹽單胞菌屬和甲基桿菌屬相對豐度顯著升高。發(fā)光桿菌屬屬于弧菌科，由弧菌屬細(xì)菌引起的疾病是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最大的細(xì)菌性疾病[47]。德沃斯氏菌屬、鹽單胞菌屬和甲基桿菌屬則是3種已知的益生菌[48]。類似地，王琨等[49]、何遠(yuǎn)法等[50]和張琴等[51]分別在牙鲆、對蝦凡納濱和刺參中研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露寡糖可顯著降低腸道弧菌的數(shù)量。綜合而言，本研究結(jié)果表明甘露寡糖可通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡來提高珍珠龍膽石斑魚免疫功能，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相吻合，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信號通路被顯著激活，這也為深入研究甘露寡糖提高魚類免疫力的作用機(jī)制提供了重要參考。

4 結(jié) 論

飼料中添加100 mg/kg甘露寡糖可以改善珍珠龍膽石斑魚的生長性能和腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高機(jī)體免疫功能，并在轉(zhuǎn)錄組水平產(chǎn)生有利的免疫應(yīng)答效應(yīng)。