不同剩余采食量下灘羊血漿代謝組學分析

盧童童 王俊奎 羅 芳 和東遷 陳麗堯 張 倩 吳少飛 郭延生 張瑞雪 陶金忠

(寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021)

剩余采食量(residual feed intake,RFI)是當前公認的評價飼料轉(zhuǎn)化率的最有效指標之一，1962年Koch等[1]提出將RFI作為評定飼料轉(zhuǎn)化效率的指標。RFI是指每只動物的體型和表現(xiàn)的實際飼料攝入量和預(yù)測攝入量之間的差值[2]。當RFI越小，即實際采食量減去預(yù)期采食量越小時，可以認為飼料利用率越高。RFI屬中高等遺傳力性狀，對RFI的選擇可提高飼料效率，降低采食量，減少機體脂肪沉積。近年來我國大力實施生態(tài)保護戰(zhàn)略，飼養(yǎng)方式從放牧逐漸轉(zhuǎn)向舍飼。在舍飼過程中，飼料成本占60%～70%，隨著飼料原料價格的不斷上漲，飼草料成本也逐漸升高。研究RFI調(diào)控機制可以降低飼草料成本，降低碳和甲烷的排放量，減少對環(huán)境的污染等，這是反芻動物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的關(guān)鍵[3-6]。

代謝物是生物體表型的基礎(chǔ)，可以更直觀有效地了解生物學過程及其機理。通過對代謝物的定性定量分析，可以解析代謝途徑或代謝網(wǎng)絡(luò)。代謝組學是一種運用高通量、高靈敏度的現(xiàn)代分析技術(shù)，是了解機體整體生理狀態(tài)的一門新興學科，它是系統(tǒng)生物學的重要構(gòu)成部分之一[7]。非靶向代謝組學是通過液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用及核磁共振等分析平臺來檢測某一特定條件下生物體或生物體的某一特定組織中所有代謝物，通過對獲得的多維海量數(shù)據(jù)進行降維和信息挖掘，篩選出反映代謝物變化的主要成分，通過模式識別與標準代謝物譜庫比對等手段來尋找潛在的差異代謝物[8-11]，并進一步研究所涉及的代謝途徑和變化規(guī)律，粗略闡述生物體對刺激的響應(yīng)機制[12-14]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法具有操作簡單、穩(wěn)定性好、回收率高、定量限低、抗干擾能力強的優(yōu)點。本試驗基于UPLC-MS/MS檢測方法以及多元統(tǒng)計分析研究不同RFI灘羊血漿代謝物的變化，探究不同RFI灘羊血漿代謝物是否有差異，以期從分子水平解釋不同RFI對灘羊代謝的影響機理，為后續(xù)提高灘羊飼料利用率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗群體

本試驗所有羊只來源于寧夏某灘羊核心育種場，并在該場內(nèi)飼養(yǎng)。選擇345只(163只公羊，182只母羊)健康、生長狀況良好、體重[(30±5) kg]相近的6月齡灘羊，公母分開飼養(yǎng)。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗期共75 d，包括過渡期15 d，預(yù)試期10 d，正試期50 d。公母分開飼養(yǎng)，分為8圈，每圈40～50只。試驗期所有羊飼喂相同顆粒飼料，飼喂時采用頸夾對羊只進行限制，飼喂結(jié)束后則放開頸夾，保證羊只自由活動及飲水。試驗羊只每日定點飼喂2次，每次飼喂前進行稱料，置于盆中。記錄羊只開始飼喂時間與結(jié)束時間，每次采食時間為20～30 min。飼喂結(jié)束后，取下食盆對剩料進行稱重并記錄。在正試期第1、10、20、30、40、50天晨飼前空腹稱量其體重。試驗開始前對羊圈進行全面消毒，每周清掃羊圈2次，保證羊只健康無病。

1.3 RFI的計算和試驗羊組別確定

1.3.1 RFI計算

RFI的計算參照Rajaei等[15]根據(jù)RFI分類的羔羊生產(chǎn)力影響的研究中所建模型。計算模型如下：

Yi=β0+β1ADGi+β2MBWi+ei；
ADG=(BW50-BW0)/N；
MBW=[(BW50+BW0)/2]0.75。

式中：ADG為平均日增重；MBW為平均中期代謝體重(W0.75)；BW0為試驗初始體重；BW50為試驗終末體重；ADGi為動物i的平均日增重；MBWi為動物i的平均中期代謝體重；N為飼養(yǎng)天數(shù)，Yi表示動物i的實際干物質(zhì)采食量；β0表示回歸截距；β1為固定值，表示ADG對采食量的影響程度；β2為固定值，表示MBW對采食量的影響程度;ei表示動物i的實際采食量與擬合采食量之差，即RFI。

RFI計算公式：

RFI=實際采食量-預(yù)測采食量。

預(yù)測采食量計算公式：

灘公羊DMI預(yù)測=-0.244+1.669MBW+0.079ADG；
灘母羊DMI預(yù)測=0.103+2.126MBW+0.051ADG。

1.3.2 試驗羊組別確定

正試期結(jié)束后，按照RFI的平均值(mean)和標準差(SD)將試驗羊分別歸入高RFI組(RFI>mean+0.5SD)、中RFI組(mean-0.5SD≤RFI≤mean+0.5SD)和低RFI組(RFI

1.4 試驗方法

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后第1天晨飼前空腹對試驗羊進行頸靜脈采血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采血結(jié)束后迅速3 000 r/min離心10 min，使用凍存管收集上層血漿，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)分析。

從-80 ℃冰箱中取出血漿樣品，于冰上解凍至樣品中沒有冰塊(后續(xù)操作都要求在冰上進行)。血漿樣品解凍后，渦旋10 s混勻，取50 μL加入到對應(yīng)編號的離心管中；加入300 μL純甲醇內(nèi)標提取液；渦旋3 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min；吸取上清液200 μL到另一個對應(yīng)編號的離心管中，-20 ℃冰箱中靜置30 min；4 ℃條件下12 000 r/min再離心3 min；取150 μL上清液于對應(yīng)進樣瓶內(nèi)襯管中，用于超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將試驗羊的初始體重、終末體重、飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)、平均日增重(ADG)、平均中期代謝體重(MBW)、RFI數(shù)據(jù)用Excel 2019進行初步整理。將后續(xù)分析的數(shù)據(jù)導入SIMCA 14.1經(jīng)pareto scaling處理后，利用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)和有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)對數(shù)據(jù)進行分析；用正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)分析方法對PLS-DA分析結(jié)果進行修訂，利用t檢驗和變異系數(shù)分析對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進行分析，篩選差異代謝物。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，根據(jù)ROC曲線下的面積(AUC)進行判別，代謝物AUC>0.5時，說明此代謝物具有較好的識別能力，代謝物AUC>0.8時，說明此代謝物是識別血漿樣品的主要指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異代謝物分析

2.1.1 PCA

PCA是一種非監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析方法，它將原本鑒定到的所有代謝物重新線性組合，形成一組新的綜合變量，同時根據(jù)所分析的問題從中選取幾個綜合變量，使它們盡可能多地反映原有變量的信息，從而達到降維的目的。PCA模型參數(shù)R2X、Q2分別表示模型對X變量的解釋率和模型預(yù)測能力，R2X越接近1表明模型越穩(wěn)定可靠。按照性別差異與RFI差異分為3組(極低RFI公羊vs極高RFI公羊組、極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI羊vs極高RFI羊組)，對不同組樣品數(shù)據(jù)進行PCA，PCA得分圖見圖1。由圖可知，各樣品能夠較好地聚類在一起，說明代謝物檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性較好，代謝物檢測數(shù)據(jù)可靠。雖然同組樣品間有交叉現(xiàn)象，但是不同組之間仍有明顯分開區(qū)域，可通過深入分析進一步研究不同組血漿代謝物的差異。

ELM與EHM分別表示極低RFI公羊與極高RFI公羊，ELF與EHF分別表示極低RFI母羊與極高RFI母羊，EL與EH分別表示極低RFI羊與極高RFI羊。下圖同。圖A、B、C分別表示極低RFI公羊vs極高RFI公羊組、極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI羊vs極高RFI羊組PCA得分圖。ELM and EHM denoted extreme low RFI rams and extreme high RFI rams, respectively; ELF and EHF denoted extreme low RFI ewes and extreme high RFI ewes, respectively; EL and EH denoted extreme low RFI sheep and extreme high RFI sheep, respectively. The same as below.Figures A, B and C represented the PCA score plots of ELM vs EHM group, ELF vs EHF group and EL vs EH group, respectively.圖1 3組灘羊PCA得分圖Fig.1 PCA score plots of Tan sheep in three groups

2.1.2 OPLS-DA

OPLS-DA是在PLS-DA的基礎(chǔ)上對數(shù)據(jù)進行進一步修正，過濾無關(guān)的信息，從而提高模型的有效性，直接區(qū)分組間變異。如圖2中A、B、C所示，在OPLS-DA模型下，各組樣品區(qū)分良好，可進一步計算用以衡量各代謝物的表達模式對樣品分類判別的影響強度和解釋能力的變量投影重要度(variable important for the projection，VIP)，從而篩選標志差異代謝物。

圖A、B、C分別表示極低RFI公羊vs極高RFI公羊組、極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI羊vs極高RFI羊組OPLS-DA得分圖。Figures A, B and C represented the OPLS-DA score plots of ELM vs EHM group, ELF vs EHF group and EL vs EH group, respectively.圖2 3組灘羊OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA score plots of Tan sheep in three groups

2.2 差異代謝物篩選

利用t檢驗和變異系數(shù)分析對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)合多元統(tǒng)計分析，利用OPLS-DA計算所得VIP，以VIP>1、P<0.05且FC>2或FC<0.5為標準篩選差異代謝物，并對其進行鑒定，結(jié)果如表1所示。本試驗中極低RFI公羊vs極高RFI公羊組共篩選鑒定出5種差異代謝物，為?；悄懰帷ⅵ?羥基異戊酸、庚酰肉堿、壬酰肉堿、壬酰肉堿異構(gòu)體，均下調(diào)；極低RFI母羊vs極高RFI母羊組共篩選鑒定出2種差異代謝物，為DL-3-苯基乳酸、十八碳二烯酰肉堿，均下調(diào)；極低RFI羊vs極高RFI羊組共篩選鑒定出4種差異代謝物，為β-羥基異戊酸、庚酰肉堿、壬酰肉堿、壬酰肉堿異構(gòu)體，均下調(diào)。

表1 已鑒定差異代謝物Table 1 Identified differential metabolites

使用MetaboAnalyst分析平臺對篩選出的差異代謝物進行聚類分析。由圖3可知，極低RFI公羊和極高RFI公羊組、極低RFI母羊和極高RFI母羊組、極低RFI羊和極高RFI羊組內(nèi)數(shù)據(jù)部分能聚集在一起，說明試驗樣品組內(nèi)存在差異。

Class：分類；Carnitine C7∶0：庚酰肉堿；Carnitine C9∶0:壬酰肉堿；Carnitine C9∶0 isomer：壬酰肉堿異構(gòu)體；Taurocholic acid：?；悄懰幔?-hydroxy-3-methyl butyric acid：β-羥基異戊酸；DL-3-phenyllactic acid：DL-3-苯基乳酸；Carnitine C18∶2：十八碳二烯酰肉堿。圖A、B、C分別表示極低RFI公羊vs極高RFI公羊組、極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI羊vs極高RFI羊組層次聚類結(jié)果。Figures A, B and C represented the hierarchical clustering results of ELM vs EHM group, ELF vs EHF group and EL vs EH group, respectively.圖3 3組灘羊差異代謝物層次聚類結(jié)果Fig.3 Hierarchical clustering results of differential metabolites of Tan sheep in three groups

進一步采用ROC曲線對已篩選出的差異代謝物進行分析。由圖4可知，在公羊中，牛磺膽酸、β-羥基異戊酸、庚酰肉堿、壬酰肉堿、壬酰肉堿異構(gòu)體AUC>0.5，說明這5種代謝物對公羊血漿樣品具有較好的識別能力，其中β-羥基異戊酸、庚酰肉堿、壬酰肉堿、壬酰肉堿異構(gòu)體AUC在0.80以上，說明這4種代謝物可作為識別高、低RFI公灘羊血漿的生物標志物。在母羊中，DL-3-苯基乳酸、十八碳二烯酰肉堿AUC>0.8，說明這2種代謝物對母羊血漿樣品具有較好的識別能力，可以作為識別高、低RFI母灘羊血漿的生物標志物。在所有羊中，β-羥基異戊酸、庚酰肉堿、壬酰肉堿、壬酰肉堿異構(gòu)體AUC>0.5，說明這4中代謝物對所有羊血漿樣品具有較好的識別能力，其中庚酰肉堿AUC>0.8，說明庚酰肉堿可以作為識別灘羊血漿樣品的主要指標。

Carnitine C7∶0：庚酰肉堿；Carnitine C9∶0:壬酰肉堿；Carnitine C9∶0 isomer：壬酰肉堿異構(gòu)體；Taurocholic acid：?；悄懰?；3-hydroxy-3-methyl butyric acid：β-羥基異戊酸；DL-3-phenyllactic acid：DL-3-苯基乳酸；Carnitine C18∶2：十八碳二烯酰肉堿；Reference line：參考線；AUC：ROC曲線下面積 area under ROC curve；Sensitivity：靈敏度； Specificity：特異性。圖A、B、C分別表示極低RFI公羊vs極高RFI公羊組、極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI羊vs極高RFI羊組ROC曲線。Figures A, B and C represented the ROC curves of ELM vs EHM group, ELF vs EHF group and EL vs EH group, respectively.圖4 3組灘羊差異代謝物的ROC曲線Fig.4 ROC curves of differential metabolites of Tan sheep in three groups

將AUC>0.8的差異代謝物進行峰強箱式圖分析，進一步篩選差異代謝物。在圖5中可以看出，在母灘羊中，十八碳二烯酰肉堿能明顯區(qū)分開，有望作為母灘羊RFI識別生物標志物；在公灘羊中，β-羥基異戊酸、庚酰肉堿，壬酰肉堿和壬酰肉堿異構(gòu)體能明顯區(qū)分開，有望作為公灘羊RFI識別生物標志物；在所有灘羊中，庚酰肉堿無法明顯區(qū)分，故不能作為所有灘羊RFI識別生物標志物。

圖5 5個差異代謝物峰強度箱式圖Fig.5 Peak intensity boxplot of five differential metabolites

3 討 論

3.1 公羊差異代謝物

肉堿是一種B族維生素，又叫維生素Bt，其主要功能是作為轉(zhuǎn)運長鏈脂肪酸的載體，將其轉(zhuǎn)運至線粒體中參與脂肪酸β氧化[17]。肉堿在運輸化合物的過程中會以酰基肉堿形式產(chǎn)生能量[18]。?；鈮A是參與脂肪酸氧化和能量消耗的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物[19]，具有較高脂肪沉積能力的個體中?；鈮A水平較高[20]。在脂肪代謝中，?；鈮A水平的改變被認為是線粒體代謝改變的間接證據(jù)。酰基肉堿的積累也可被視為脂肪代謝狀態(tài)不佳的標志。Clemmons等[21]在不同RFI黑安格斯肉牛血清代謝組研究中發(fā)現(xiàn)，肉堿水平在低RFI牛中含量較高。本研究發(fā)現(xiàn)在極低RFI公羊vs極高RFI公羊組中庚酰肉堿、壬酰肉堿和壬酰肉堿的異構(gòu)體這3種酰基肉堿下調(diào)。導致這種現(xiàn)象的原因可能是與高RFI公羊相比，在極低RFI公羊中奇數(shù)中鏈脂肪酸在體內(nèi)發(fā)生β氧化的量更多，產(chǎn)生更多的能量來維持機體的能量需求；而在極高RFI公羊中，奇數(shù)中鏈脂肪發(fā)生β氧化的較少，產(chǎn)生能量較少，導致?；鈮A積累，所以飼料的利用率較低。這3種物質(zhì)AUC均大于0.8，能識別不同RFI公灘羊，它們在脂肪代謝中發(fā)揮作用。

牛磺膽酸是動物膽汁成分中的一種[22]，在羊膽汁中含量最高，是膽酸的羧基與牛磺酸的氨基以酰胺鍵相連的一種結(jié)合型膽汁酸[23]。?；悄懰釋ο乐兄惖奈帐潜匦璧摹Ｅ；悄懰崮茉黾痈鞣N脂肪酶的活性，加速脂肪水解；可降低脂肪的表面張力，增加脂肪酶作用的面積，促進水解的進行；能與甘油一酯結(jié)合，提高膽固醇和脂溶性維生素等的溶解性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)在極低RFI公羊vs極高RFI公羊組中牛磺膽酸下調(diào)，可能原因是極低RFI公羊脂肪代謝能力更好，脂肪沉積更少，從而造成血漿中?；悄懰岷枯^低。雖然該物質(zhì)的AUC較低，不能識別不同RFI公灘羊，但是其在脂肪代謝中發(fā)揮作用。

β-羥基異戊酸又稱β-羥基-β-甲基丁酸，是亮氨酸代謝的一種中間產(chǎn)物，可以促進肌肉生長并減少脂肪沉積[25]。在營養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，β-羥基異戊酸作為補充劑可調(diào)節(jié)生長豬脂肪組織的脂質(zhì)代謝，促進脂質(zhì)代謝，導致脂肪組織減少；在飼糧中添加β-羥基異戊酸能夠提高肉仔雞的生長性能和屠宰性能[26-27]。在人類肥胖疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，β-羥基異戊酸能夠通過調(diào)節(jié)合成、代謝信號通路刺激蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮肌肉保護作用，可用于持續(xù)性減脂、瘦體重的保持和提高[25]。有試驗表明β-羥基異戊酸能通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體β/δ(PPARβ/δ)和細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)通路促進線粒體生物合成[28]和脂肪氧化[29]。在動物試驗中，β-羥基異戊酸作為補充劑可以影響脂肪沉積，且過量補充亮氨酸可能會對脂肪代謝產(chǎn)生負面影響[30]。本研究中，在公羊中發(fā)現(xiàn)β-羥基異戊酸在極低RFI公灘羊中低表達，可能的原因是因為極低RFI公灘羊的脂肪代謝能力更好，β-羥基異戊酸作為亮氨酸代謝的中間產(chǎn)物，可以更好地參與到脂肪酸的氧化過程中。β-羥基異戊酸參與促進蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)分解，促進肌肉生長，減少肌肉消耗，由于極低RFI公灘羊飼料利用率更高，脂肪儲備更少，β-羥基異戊酸更多的被消耗。而極高RFI公灘羊飼料利用效率低，脂肪代謝能力較差，脂肪酸分解速率較慢，飼料更多轉(zhuǎn)化為脂肪沉積，導致β-羥基異戊酸的積累。這個物質(zhì)AUC大于0.8，能識別不同RFI公灘羊，其在脂肪代謝中發(fā)揮作用。

3.2 母羊差異代謝物

DL-3-苯基乳酸可以與氧化態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)結(jié)合生產(chǎn)3-羥基丙酮酸和還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，來釋放能量。苯乳酸脫氫酶催化可逆的(R)-苯乳酸脫氫為(E)-肉桂酸。在苯乳酸脫水過程中，短暫的輔酶A酯的形成類似于由細菌檸檬酸裂解酶催化的檸檬酸裂解過程，其中包含1個共價結(jié)合到酰基載體蛋白(ACP)的乙酰輔酶A衍生物[31]。本研究中，在母羊中發(fā)現(xiàn)DL-3-苯基乳酸在極高RFI灘母羊中高表達，飼料效率較低，該物質(zhì)的AUC較低，不能識別不同RFI母灘羊。DL-3-苯基乳酸代謝對飼料效率的機制還不清楚，需進一步研究。

十八碳二烯酰肉堿是一種長鏈?；鈮A，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)活性降低會導致十八碳二烯酰肉堿含量降低，而肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT)家族成員控制脂肪酸的線粒體β氧化，并在脂質(zhì)分解代謝中扮演關(guān)鍵分子的角色[32]。本研究中，在極低RFI母羊中發(fā)現(xiàn)十八碳二烯酰肉堿下調(diào)，在極高RFI灘母羊中則高表達，可能的原因是極高RFI灘母羊十八碳二烯酰肉堿分解的速度較慢，而極低RFI灘母羊脂肪的分解速率較快，分解速度快釋放出大量的能量，導致飼料轉(zhuǎn)化效率更高。這個物質(zhì)AUC大于0.8，能識別不同RFI母灘羊，其在脂肪代謝中發(fā)揮作用。

3.3 所有灘羊差異表達分析

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同RFI下所有灘羊篩選出的差異代謝物與公羊出現(xiàn)了重復(fù)，庚酰肉堿在所有灘羊中下調(diào)，雖然AUC大于0.8，但箱式圖中不能明顯區(qū)分，故不能作為所有灘羊RFI的生物標志物。在對所有灘羊差異代謝物進行研究時，由于性別因素的影響，導致某些代謝物顯著性水平發(fā)生變化。在公灘羊中篩選出3種奇數(shù)碳鏈的中鏈酰基肉堿差異表達，均下調(diào)，而在母灘羊中只檢測到1種長鏈酰基肉堿，這說明性別會影響?；鈮A的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)RFI與脂肪沉積有關(guān)[33]，而脂肪代謝較差會引起?；鈮A的積累。有試驗表明公綿羊的終末體重、日增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率等生長性能顯著優(yōu)于母綿羊[34]。Clare等[35]研究發(fā)現(xiàn)在不同RFI下性別會影響肉牛皮下脂肪組織脂肪生成途徑的關(guān)鍵基因表達。Fan等[36]基于尾巴大小和性別對呼倫貝爾綿羊的尾脂肪沉積進行轉(zhuǎn)錄組研究，研究發(fā)現(xiàn)呼倫貝爾羊的脂肪代謝存在明顯的性別差異。高棟等[37]研究了性別因素對蘇尼特羊肌內(nèi)脂肪沉積的影響，研究發(fā)現(xiàn)性別對蘇尼特羊的脂肪沉積、脂代謝基因表達有影響，并且母羊體內(nèi)含有正向調(diào)控脂肪沉積的基因含量顯著高于公羊，說明母羊更易沉積脂肪。本研究在公灘羊中檢測出多種酰基肉堿，可能也反映出性別對脂肪代謝有影響。

4 結(jié) 論

本試驗發(fā)現(xiàn)在不同RFI下性別會影響血漿中的差異代謝物，血漿中β-羥基異戊酸、庚酰肉堿、壬酰肉堿、壬酰肉堿可作為識別高、低RFI公灘羊的生物標志物，血漿中十八碳二烯酰肉堿可作為識別高、低RFI母灘羊的生物標志物。