昆蟲抗菌肽及其活性機制

趙梓含 張愛忠 潘春媛 姜 寧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，大慶 163319)

昆蟲種類繁多、形態(tài)各異，屬于無脊椎動物中的節(jié)肢動物，是地球上數(shù)量最多的動物群體。昆蟲抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類小分子堿性多肽物質(zhì)，是昆蟲先天免疫的重要效應(yīng)分子，它具有不易形成耐藥性、廣譜抗菌、分子質(zhì)量小等特點，并且對病毒、細菌、真菌、癌細胞具有殺傷作用。AMPs是由較少氨基酸組成的小分子，其氨基酸由12～50個氨基酸殘基組成，通常具有正凈電荷[1]。AMPs是先天免疫的重要效應(yīng)分子，參與昆蟲機體內(nèi)的一些防御過程，如中和內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、殺死病原體。第1個昆蟲AMPs是在1980年從惜古比蠶蛾(Hyalophoracecropia)的蛹中分離出來的，之后人們在細菌、真菌、植物和動物中發(fā)現(xiàn)了大量AMPs[2]。大多數(shù)昆蟲AMPs是帶有陽離子的分子，具有抗細菌活性的堿性殘基。根據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，AMPs可分為4類：半胱氨酸多肽、甘氨酸多肽、脯氨酸多肽和α-螺旋多肽。

在過去的數(shù)十年里，由于昆蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的發(fā)表，鑒定出的昆蟲AMPs數(shù)量在增加。發(fā)現(xiàn)AMPs會因昆蟲的體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生，這些AMPs在微生物感染后釋放到昆蟲血淋巴。從昆蟲幼蟲體中提取的血淋巴，通過組學(xué)分析法和質(zhì)譜法對其進行分析，可分析出昆蟲血淋巴中分離的AMPs數(shù)量以及抗菌活性[3-4]。昆蟲AMPs具有廣泛的抗菌、抗病毒、抗真菌和抗癌活性。因此，昆蟲AMPs的發(fā)現(xiàn)以及多方面的應(yīng)用研究具有巨大的發(fā)展空間。

1 昆蟲AMPs的分類與活性

1.1 半胱氨酸AMPs

防御素(defensin)屬于半胱氨酸AMPs，是一類短陽離子肽，含34～51個氨基酸殘基，含有6個保守的半胱氨酸，形成3個分子內(nèi)二硫鍵，由于存在堿性氨基酸，特別是精氨酸具有抗菌活性。在大多數(shù)昆蟲中，包括白蛉(Phlebotomusduboscqi)、熊蜂(Bombuspascuorum)、紅頭麗蠅(Calliphoravicina)、始紅蝽(Pyrrhocorisapterus)、椰蛀犀金龜(Oryctesrhinoceros)等發(fā)現(xiàn)此類AMPs。昆蟲防御素對革蘭氏陽性(G+)菌和革蘭氏陰性(G-)菌具有抗菌活性。銅綠麗金龜(Anomalacuprea)的防御素A和防御素B也是一種半胱氨酸AMPs，其中防御素B對G+菌和G-菌均有效，而防御素A只對G+菌有效[5]。

1.2 α-螺旋AMPs

天蠶素(cecropins，Cec)屬于α-螺旋AMPs，是昆蟲中數(shù)量最多的線性α-螺旋AMPs，由58～79個氨基酸組成，主要對G-菌有活性，其次對G+菌有活性。天蠶素對G-菌的活性比在蟾蜍和哺乳動物分離出的馬蓋寧(magainins)要高10倍，而且多數(shù)天蠶素都經(jīng)過C-末端的酰胺化這種翻譯后的修飾，可提高它們的抗菌活性[6]。圓二色譜分析表明，天蠶素在水溶液中呈無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，在作用微生物膜時，呈α-螺旋結(jié)構(gòu)有利于插入細胞膜[7]。Cec A在家蠶體內(nèi)外均可以抑制球孢白僵菌的增殖，這表明Cec A對球孢白僵菌具有較好的抗真菌活性[8]。

1.3 甘氨酸AMPs

攻擊素(attacins)屬于甘氨酸AMPs，是由蛋白原前體產(chǎn)生的，這個蛋白原前體有1個信號肽、1個前肽、1個N端的攻擊素結(jié)構(gòu)域和2個甘氨酸結(jié)構(gòu)域(G1和G2結(jié)構(gòu)域)，它們可分為2類:酸性攻擊素(攻擊素E和F)和堿性攻擊素(攻擊素A～D)[9]。在鱗翅目和雙翅目昆蟲中都發(fā)現(xiàn)了攻擊素，主要抗G-菌，特別是大腸桿菌，但對一些G+菌也有活性[10]。例如，甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的攻擊素肽對G-大腸桿菌和菊苣假單胞菌有活性，但對G+枯草芽孢桿菌和單核細胞增生性李斯特菌也有活性[11]。

葛佬素(gloverins)是鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)的富含甘氨酸的多肽，是堿性分子，在水溶液中呈隨機卷曲結(jié)構(gòu)，在疏水環(huán)境中呈α-螺旋結(jié)構(gòu)；葛佬素主要對G-菌具有活性特別是大腸桿菌，但其中一些對G+菌、真菌和病毒也顯示出抗菌活性[12]。獵蝽素(prolixicin)是從長紅獵蝽(RhodniusProlixus)中分離得到的一種多肽，其N端有1個信號肽，C端有1個富含甘氨酸的G結(jié)構(gòu)域，在細菌感染血淋巴后由中腸組織釋放[13]。

1.4 脯氨酸AMPs

Lebocins是家蠶淋巴中分離得到的富含脯氨酸的多肽,對G+菌和G-菌以及一些真菌都有抗性作用，經(jīng)O-糖基化后對不動桿菌以及大腸桿菌具有活性[14]。由26個氨基酸組成的Metchnikowin在黑腹果蠅中分離鑒定，是一種富含脯氨酸的免疫誘導(dǎo)線性肽，對G-菌無抗性，而對G+菌和真菌具有抗性。Metchnikowin可以抑制線粒體中復(fù)合體Ⅱ琥珀酸-Q還原酶的鐵硫蛋白，也會抑制β(1，3)-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，干擾真菌細胞壁的合成，因為β(1，3)-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)細胞壁β(1，3)-葡萄糖鏈的延伸[15]。

2 昆蟲AMPs的活性機制

2.1 昆蟲AMPs的免疫機制

通過識別受體，檢測到外來微生物后，一些信號分子被激活。其中主要的途徑是免疫缺陷(IMD)、Janus激酶信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)和Toll途徑，黑腹果蠅的體液免疫反應(yīng)主要受Toll和IMD途徑控制，導(dǎo)致AMPs的產(chǎn)生。

2.1.1 Toll信號通路途徑

在昆蟲中，G+菌和真菌的抗原主要激活Toll通路(圖1-A)。在G+菌感染的情況下，通過肽聚糖識別蛋白SA,SD(PGRP-SA, SD)、G-菌結(jié)合蛋白1(GNBP1)激活Toll；而在真菌感染的情況下，Toll的激活是由G-菌結(jié)合蛋白3(GNBP3)介導(dǎo)的觸發(fā)絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，神經(jīng)生長因子同源物(Sp?tzle)的非活性區(qū)域被絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)剪切而被激活，Sp?tzle在神經(jīng)生長因子同源物激活酶(SPE)作用下活化[16]?；罨腟p?tzle與Toll受體結(jié)合時，激活Toll信號，隨后胞質(zhì)內(nèi)Toll的白細胞介素受體結(jié)構(gòu)域開始二聚化，然后與蛋白髓樣分化初級反應(yīng)基因88結(jié)合[17]。這個復(fù)合物再與接頭蛋白Tube結(jié)合，從而促進蛋白激酶(PELLE)進行自動磷酸化和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)抑制蛋白(cactus)的磷酸化和降解，然后NF-κB轉(zhuǎn)錄因子(DorsalL或Dif)被移位到細胞核中，它們在核內(nèi)激活A(yù)MPs的轉(zhuǎn)錄[18]。

2.1.2 IMD信號通路途徑

G-菌的感染信號使肽聚糖識別蛋白LC(PGRP-LC)受體與二氨基庚二酸型肽聚糖(DAP-PG)結(jié)合，IMD信號通路被激活(圖1-B)。IMD與含有死亡結(jié)構(gòu)域Fas相關(guān)蛋白(dFADD)、半胱氨酸蛋白酶的同源物(DREDD)組成信號復(fù)合體，而DREDD被用來裂解IMD，K63泛素化裂解后的IMD，K63的多聚泛素鏈有助于IMD-dFADD-DREDD復(fù)合體與生長因子β活化酶(TAK1蛋白、TAB2蛋白)連接起來，激活NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK復(fù)合體)，并可以降解IκB使NF-κB轉(zhuǎn)錄因子(Relish)磷酸化[19]。在Relish經(jīng)過裂解和磷酸化之后，Relish的C端部分仍在細胞質(zhì)中，活性N端部分轉(zhuǎn)移到細胞核中，在那里它激活特定AMPs的轉(zhuǎn)錄[20]。

2.1.3 JAK-STAT信號通路途徑

在昆蟲JAK-STAT中(圖1-C)，在不成對的細胞因子(Upd)與其DOME(Domeless)受體結(jié)合后JAK被激活，Upd細胞因子誘導(dǎo)酪氨酸蛋白激酶(HOP，1個JAK分子)自身磷酸化以及DOME受體的細胞質(zhì)部分酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，受體上磷酸化的酪氨酸是STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的識別和結(jié)合位點[21]。同時，單個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子92e(Stat92e)與DOME受體上的磷酸化酪氨酸結(jié)合，并被HOP磷酸化[22]。酪氨酸磷酸化的stat92e從DOME受體上分離出來，形成二聚體并進入細胞核，在那里它們與其目標(biāo)基因的啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)含有硫酯的蛋白基因和圖蘭朵基因的轉(zhuǎn)錄[23-24]。

GNBP3:革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白3 Gram-negative binding protein 3；GNBP1:革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白1 Gram-negative binding protein 1；PGRP-SA,SD:肽聚糖識別蛋白SA,SD peptidoglycan recognition protein-SA，SD；TIR:Toll的白細胞介素1受體 Toll interleukin 1 receptor；dMyD88:果蠅骨髓分化初級反應(yīng)蛋白同源物 drosophila homologue of myeloid differentiation primary response protein；Tube :含有死亡結(jié)構(gòu)域接頭蛋白 contains death domain adaptor proteins； PELLE :蛋白激酶 protein kinase；DorsalL,Dif :NF-κB轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB transcription factor；Cactus :IκB(NF-κB抑制蛋白)同源物 IκB (NF-κB inhibitor protein) homologue；DAP-PG:二氨基庚二酸型肽聚糖 diaminopimelic acid peptidoglycan；PGRP-LC:肽聚糖識別蛋白LC peptidoglycan recognition protein LC；IMD:免疫缺陷 immune deficiency；dFADD:含死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白 drosophila Fas-associated with death domain；Dredd: 半胱氨酸蛋白酶的同源物 homologue of cysteine protease; K63-polyubiquitin chains:K63多聚泛素鏈；TAK1:生長因子β活化酶1 growth factor beta activase 1; TAB2:生長因子β活化酶2 growth factor beta activase；IKK complex(IRD5, key):IKK(IκB kinase)復(fù)合體 IKK (IκB kinase) complex;Relish:NF-κB轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB transcription factor；Upd:不成對的細胞因子 unpaired cytokines; HOP:酪氨酸蛋白激酶 tyrosine protein kinase; Stat92e:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子92e the signal transducer and activator of transcription at 92e。圖1 Toll(A)、IMD(B)和JAK-STAT(C)信號通路示意圖Fig.1 Schematic representation of Toll(A), IMD(B)and JAK-STAT(C)signaling pathways[22,25]

2.2 昆蟲AMPs的抗菌作用機制

大多數(shù)昆蟲AMPs帶有正電荷，與細菌細胞表面的負(fù)電荷相互作用，分別為G-菌的脂多糖和G+菌的磷壁酸，靜電吸引是多肽和細胞膜之間發(fā)生的第1個相互作用。AMPs引起細菌細胞膜去極化，這一過程導(dǎo)致細菌細胞膜的通透性增加，達到起始濃度后，可以誘導(dǎo)孔隙或通道的形成以及細胞死亡[26]。目前已經(jīng)提出了幾種模型機制來解釋孔隙的形成。

2.2.1 環(huán)孔模型

環(huán)孔模型是溶膜機制的一部分，環(huán)孔模型的特征是由多肽和脂類構(gòu)成，多肽垂直排列。與桶板模型相似，在環(huán)形孔模型中，多肽垂直插入膜內(nèi)形成孔隙，而肽的親水區(qū)與脂頭基團結(jié)合，肽的疏水區(qū)與膜脂的疏水核心結(jié)合[27]。因此，多肽和磷脂頭部基團的親水性區(qū)域形成裂口，隨著脂質(zhì)分子的傾斜，雙層膜也向內(nèi)彎曲，形成1個由脂頭基團排列并被多肽覆蓋的孔隙[28]。

2.2.2 桶板模型

在桶板模型中多肽垂直插入磷脂雙分子層，多肽的疏水區(qū)域與膜的疏水核心相結(jié)合，而親水區(qū)域彼此相對，形成孔隙或通道，使外界水分子和離子等滲透入細胞內(nèi)部，破壞細胞膜[27]。最初多肽與雙層膜表面結(jié)合，通過構(gòu)象改變，多肽的疏水區(qū)域與雙層膜上的疏水成分相互作用進而插入到膜中。當(dāng)達到一個閾值時，多肽通過親水性氨基酸殘基之間的相互作用進而更深地插入疏水膜核心中[29]。桶板模型有3個特征：1)肽在垂直方向上形成孔隙或通道；2)膜脂不鑲嵌在孔隙的內(nèi)部，并且與上面環(huán)孔模型相比，在孔隙形成過程中它們不會與多肽一起彎曲或傾斜；3)孔隙是動態(tài)結(jié)構(gòu)且輪廓分明[30]。研究者觀察到惜古比蠶蛾體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天蠶素可形成1個桶板，它可以穿透細菌細胞膜，使其細胞內(nèi)容物外泄導(dǎo)致細胞死亡[28]。在意大利蜜蜂毒液中被鑒定出來的蜂毒肽是1種26個殘基的多肽毒素，它對幾種細菌有很強的抗菌活性，它結(jié)合到細菌細胞膜表面導(dǎo)致孔隙形成，進而溶解細胞[31-32]。

2.2.3 地毯模型

地毯模型既不需要特定的多肽結(jié)構(gòu)，也不需要形成結(jié)構(gòu)化的通道。在地毯模型中，多肽與膜結(jié)合，平行于磷脂雙分子層表面，多肽覆蓋了整個膜表面并且僅與脂頭基團作用。這種作用破壞了磷脂的包裝，并由于多肽對磷脂的置換而導(dǎo)致雙層膜流動性的改變，因此細胞膜的穩(wěn)定性受到干擾[33]。多肽的正電荷氨基酸沿非極性側(cè)鏈擴散，而多肽的非極性側(cè)鏈又與膜疏水核心結(jié)合，使多肽穿透膜的疏水核心、極性殘基與磷脂結(jié)合從而形成通道破壞細胞膜[28]。即使多肽不與膜疏水核心結(jié)合，不插入膜疏水核心，當(dāng)達到多肽閾值濃度時，雙層膜也是會以類似分散的方式溶解，雙層膜會破裂[27]。在低肽濃度時，天蠶素AMPs可在膜的特定部位形成通道或孔[34]。

2.2.4 其他

此外，昆蟲AMPs也可以通過非溶膜機制產(chǎn)生作用。AMPs可以靶向細菌的幾種功能，包括核酸、蛋白質(zhì)、酶和細胞壁的合成。AMPs干擾細菌幾種生物合成途徑的能力說明了對AMPs產(chǎn)生耐藥性的難度[35]。Attacins通過與脂多糖結(jié)合而不穿過內(nèi)膜或細胞質(zhì)，阻止幾種細菌外膜蛋白如OmpA、OmpC和OmpF的合成，從而抑制大腸桿菌的生長[36]。

3 提高昆蟲AMPs的穩(wěn)定性

AMPs在血漿中的穩(wěn)定性較低，會迅速被肝臟和腎臟清除。因此已開發(fā)出了不同的策略來提升AMPs的穩(wěn)定性,其中主要有D-氨基酸替換、N-末端氨基酸殘基的修飾、環(huán)化等。

通過D-氨基酸(DAA)替換特定區(qū)域以及天然序列，有助于立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的部分或全部翻轉(zhuǎn)，有助于增強多肽對蛋白酶的穩(wěn)定性[37]。Jia等[38]將Polybia-CP天然序列用DAA進行部分和全部替換，發(fā)現(xiàn)Polybia-CP的對映異構(gòu)體類似物和反轉(zhuǎn)型類似物與天然序列的Polybia-CP具有相似的抗菌活性，對酶降解的穩(wěn)定性也有所提高。因此，DAA的替換可以提高AMPs對蛋白酶降解的穩(wěn)定性。然而，盡管可以防止蛋白酶降解，但已證明用DAA部分或全部替換是非常昂貴的[39]。

細菌和真核生物氨基酸的N端氨基酸可以甲基化。例如，N-甲基化氨基酸是環(huán)孢菌素A的結(jié)構(gòu)特征，含有N-甲基化氨基酸的多肽對蛋白降解能力表現(xiàn)出更好的抗性，而且也具有更好的膜滲透能力[40]。Liu等[41]對蜂毒AMP anoplin的天然序列進行了修飾，從獨居的蜘蛛蜂的毒囊中分離出最小的一種線性α-螺旋AMPs anoplin，將N-甲基化氨基酸選擇特定的位置，并連接不同鏈長的脂肪酸。它們先采用單一和多個N-甲基氨基酸替換anoplin來提高肽對酶降解的抗性，再引入從C8到C14的脂肪酸來修飾N-末端，進而發(fā)現(xiàn)含C12/C14的N-甲基化脂肽對G-菌和G+菌均表現(xiàn)出較強的抗菌活性。

幾個富含二硫鍵的多肽，如植物環(huán)肽或靈長類的θ防御素，顯示出具有半胱氨酸的三維穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[42-43]。半胱氨酸的側(cè)鏈硫醇氧化后可以形成二硫鍵，而形成二硫鍵可以使AMPs更穩(wěn)定。目前通過形成肽鍵、內(nèi)酰胺鍵或二硫鍵都可以實現(xiàn)環(huán)化，進而提升AMPs的穩(wěn)定性?？梢砸胍恍?gòu)象來限制肽鏈彎曲；也可以環(huán)化修飾天然序列，使肽鏈具有剛性，難以發(fā)生彎曲。因此，剛性肽鏈的結(jié)構(gòu)構(gòu)象對蛋白酶水解具有一定抗性[44]。

4 小 結(jié)

昆蟲缺乏適應(yīng)性免疫，它們的生存依賴于廣譜AMPs的產(chǎn)生，而廣譜AMPs使它們能夠創(chuàng)造強大的防御機制來對抗感染。事實上，由于它們吃的食物種類不同，以及它們生活的環(huán)境不同，昆蟲在先天免疫中產(chǎn)生了各種各樣的反應(yīng)，而且昆蟲的物種超過100萬個，幾乎是取之不盡用之不竭的生物活性化合物的來源。因此，昆蟲AMPs的研發(fā)具有重要意義和巨大潛力。昆蟲AMPs在食品領(lǐng)域是一大研發(fā)熱點，雖可以作為飼料添加劑，但其純度仍需進一步提高。一些細菌對抗生素產(chǎn)生了耐藥性，因此需要尋找和開發(fā)新的抗菌藥物，而昆蟲AMPs因為具有抗微生物等多種生物學(xué)功能有著廣闊的應(yīng)用前景。但其研發(fā)和制備仍存在一些問題，抗菌活性還需不斷優(yōu)化并且其作用機理及應(yīng)用效果有待更進一步研究。昆蟲AMPs的不穩(wěn)定性以及未知的藥代動力學(xué)，使量產(chǎn)的可行性較低，而通過化學(xué)合成、基因工程等方法雖然能實現(xiàn)量產(chǎn)，但是高昂的成本也使AMPs研發(fā)受到了限制。隨著昆蟲AMPs的研究和開發(fā)不斷地深入研究有望提高其產(chǎn)量，這將會對昆蟲AMPs新用途的開發(fā)起到推動作用。