細(xì)菌生物膜的形成及抗菌肽抗生物膜活性的研究進(jìn)展

張珊珊 宋 靜 王家俊 單安山

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030)

細(xì)菌生物膜或稱細(xì)菌生物被膜是指附著于有生命或無(wú)生命物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有一定三維結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)菌群體，是大多數(shù)微生物在自然界中采用的一種生活方式[1]。生物膜的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，內(nèi)部分布不均勻。生物膜的結(jié)構(gòu)與細(xì)菌種屬和環(huán)境條件息息相關(guān)，不同細(xì)菌或同一細(xì)菌所處環(huán)境不同時(shí)，生物膜的疏密和厚薄都會(huì)存在明顯差異。由于生物膜中的細(xì)菌處在不同時(shí)間和空間發(fā)展，因此基因表達(dá)和生理活性具有不均質(zhì)性。此外，生物膜具有較高的耐藥性[2]、抗吞噬性[3]以及極強(qiáng)的黏附性[4]，可以導(dǎo)致多種細(xì)菌感染性疾病，是細(xì)菌感染的重要根源之一。與生物膜相關(guān)的細(xì)菌感染性疾病的治療極為棘手，目前主要有2種策略：一是抑制生物膜的形成，如應(yīng)用表面鍍銀和含鈦導(dǎo)管；二是用抗菌藥物來(lái)治療已形成的生物膜，如應(yīng)用抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、AMPs與抗生素聯(lián)用或借助納米遞藥系統(tǒng)。

1 生物膜的形成

生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，主要可分為5個(gè)階段：1)可逆附著階段，細(xì)菌非特異性地附著在底物表面上；2)不可逆附著階段，細(xì)菌與底物表面通過(guò)黏附素蛋白或黏附因子相互作用；3)微菌落形成階段，細(xì)菌產(chǎn)生胞外聚合物；4)生物膜成熟階段，細(xì)菌合成并釋放信號(hào)分子；5)細(xì)菌脫落/擴(kuò)散階段，細(xì)菌離開生物膜，回歸獨(dú)立的浮游生活方式。以豬鏈球菌生物膜形成過(guò)程為例，如圖1所示。

1：可逆附著 reversible attachment；2:不可逆附著 irreversible attachment；3:微菌落的形成 micro colony；4:成熟 maturation；5:細(xì)菌脫離/擴(kuò)散 cellular detachment。圖1 豬鏈球菌生物膜形成過(guò)程示意圖和掃描電鏡圖Fig.1 Schematic diagram and scanning electron microscopy of Streptococcus suis biofilm formation[5]

1.1 生物膜的黏附

細(xì)菌在剛接觸物體表面時(shí)會(huì)借助布朗運(yùn)動(dòng)、重力、擴(kuò)散、對(duì)流或內(nèi)在運(yùn)動(dòng)來(lái)進(jìn)行可逆性的黏附。當(dāng)細(xì)菌與基質(zhì)表面之間產(chǎn)生的吸引力大于排斥力時(shí)，細(xì)菌就會(huì)在基質(zhì)表面完成附著，但當(dāng)吸引力小于排斥力時(shí)，細(xì)胞則無(wú)法實(shí)現(xiàn)附著，從表面脫落，恢復(fù)浮游狀態(tài)。關(guān)于細(xì)菌如何實(shí)現(xiàn)可逆附著，目前存在2種不同的主張:一是認(rèn)為細(xì)菌需要借助黏附素蛋白來(lái)完成初始的可逆附著，這一觀點(diǎn)中強(qiáng)調(diào)了黏附素蛋白的特異性選擇，其受體為宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂。如多糖細(xì)胞間黏附素(polysaccharide intercellular adhesion，PIA)是表皮葡萄球菌在醫(yī)療器械上定植的關(guān)鍵物質(zhì)[6]；二是認(rèn)為細(xì)菌的不可逆附著過(guò)程中不存在特異性選擇，其依靠的是細(xì)菌表面的附屬結(jié)構(gòu)及黏附因子的黏合作用，細(xì)菌的附屬結(jié)構(gòu)常具有較高的親和性，有試驗(yàn)證明Ⅳ型纖毛等都具有黏性末端，可以幫助細(xì)菌完成黏附[7]，而鞭毛可以加快細(xì)菌和表面進(jìn)行接觸[8]和克服細(xì)菌與表面的排斥力。

細(xì)菌的可逆性附著會(huì)隨著時(shí)間的推移變?yōu)椴豢赡娓街?，不可逆附著是通過(guò)短程相互作用實(shí)現(xiàn)的，例如偶極-偶極相互作用、氫鍵、離子鍵和共價(jià)鍵。不可逆附著可避免細(xì)菌本身被帶到不利于自身生長(zhǎng)的環(huán)境中，因此，生物膜一旦形成便很難消除。

1.2 微菌落的形成

細(xì)菌黏附到表面后便開始生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)基因表達(dá)上的調(diào)整會(huì)促使其分泌大量的胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)，其主要由多糖、蛋白質(zhì)和細(xì)胞外脫氧核糖核酸(eDNA)組成。EPS構(gòu)成了生物膜三維結(jié)構(gòu)的框架，其可以黏附單個(gè)細(xì)菌并形成扁平或類似“蘑菇狀”的微菌落，大量菌落堆積使生物膜加厚，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)環(huán)境(如抗菌劑、免疫因子、溫度和競(jìng)爭(zhēng)微生物)的適應(yīng)能力[9]。因此，EPS分子的產(chǎn)生對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)十分重要。生物膜的發(fā)展也離不開細(xì)菌內(nèi)的信號(hào)系統(tǒng)，有研究證明，環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是細(xì)菌在浮游狀態(tài)和固著狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵信號(hào)分子之一，可以調(diào)控多種細(xì)菌生物膜內(nèi)EPS的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。高濃度的c-di-GMP會(huì)正向調(diào)節(jié)生物膜的形成，而低濃度的c-di-GMP會(huì)對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生負(fù)向影響[11]。

1.3 生物膜的成熟

成熟的生物膜微菌落之間圍繞著輸水通道，可以運(yùn)送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排出廢物等[12-13]。這一過(guò)程中常伴隨著群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)調(diào)控系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)菌合成的信號(hào)分子濃度達(dá)到閾值水平后，位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中的受體會(huì)進(jìn)行信號(hào)分子的識(shí)別，并激活相關(guān)的基因表達(dá)。如群體信號(hào)分子AI-2不僅可以促進(jìn)不可分型流感嗜血桿菌生物膜增厚和成熟，而且在生物膜的發(fā)育和成熟過(guò)程中起到防止或延遲生物膜擴(kuò)散的作用[14]。研究表明，銅綠假單胞菌通過(guò)釋放群體感應(yīng)分子(3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯)抑制宿主免疫，從而更好的存活，并且3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯在生物膜中細(xì)菌內(nèi)積累濃度遠(yuǎn)高于浮游細(xì)菌內(nèi)的濃度[15-16]，這更直接地表明了群體感應(yīng)在銅綠假單胞菌生物膜形成中的作用。

1.4 細(xì)菌脫落/擴(kuò)散

細(xì)菌在浮游狀態(tài)和附著于多細(xì)胞群落的生物膜狀態(tài)之間交替存在[17]。當(dāng)生物膜成熟后，細(xì)菌從小菌落中分離出來(lái)，移動(dòng)到新的底物上。這個(gè)過(guò)程對(duì)于生物膜來(lái)說(shuō)也是一種很有效的傳播方式，釋放出的浮游細(xì)菌可以進(jìn)一步的繁殖、遷移，從而形成新的生物膜。擴(kuò)散是延續(xù)生物膜的一種策略，即生物膜內(nèi)的細(xì)菌為適應(yīng)特定的生理或環(huán)境的變化而啟動(dòng)的脫落行為[18-19]。

2 生物膜的耐藥機(jī)制

當(dāng)浮游細(xì)菌形成生物膜后，細(xì)菌耐藥性會(huì)大幅度增加，Shenkutie等[20]研究了黏菌素、環(huán)丙沙星和亞胺培南對(duì)9株鮑曼不動(dòng)桿菌的最小殺菌濃度(MBC)和最小生物膜清除濃度(MBEC)，結(jié)果表明9個(gè)菌株的生物膜細(xì)菌產(chǎn)生了高水平的抗生素耐藥性，與浮游細(xì)菌相比，根除鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜需要將黏菌素濃度提高64倍，環(huán)丙沙星和亞胺培南濃度提高1 024倍。因此，若想預(yù)防或控制生物膜形成，耐藥性是不容忽視的難題。關(guān)于生物膜的耐藥機(jī)制主要存在以下幾種假說(shuō)。

2.1 抗菌藥物滲透障礙

生物膜對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一是藥物滲透性差，這是由于大多數(shù)抗菌藥物擴(kuò)散和吸附到EPS的能力減少[21](圖2)。

圖2 生物膜中的抗菌藥物的滲透障礙Fig.2 Barriers to penetration of antimicrobial agents in biofilms[21]

大多數(shù)抗菌藥物受到大小限制難以通過(guò)水通道，因此對(duì)于包埋于EPS中的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，EPS相當(dāng)于一個(gè)可以阻礙抗菌藥物滲透的保護(hù)屏障，這種阻礙作用會(huì)降低與細(xì)菌接觸的抗菌藥物的濃度，從而使藥物達(dá)不到有效濃度，反而造成了細(xì)菌耐藥性的提高。但這一假說(shuō)并不適用于所有生物膜，如抗生素妥布霉素和環(huán)丙沙星可以穿透生物膜，但未能實(shí)現(xiàn)有效殺死細(xì)菌[22]。此外，由于細(xì)菌及其分泌的黏性基質(zhì)均帶負(fù)電，所以親水性抗菌藥物會(huì)吸附在表面并形成電荷屏障，阻礙藥物進(jìn)入菌體發(fā)揮作用[23]。

2.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)限制

細(xì)菌所處微環(huán)境的pH和氧化還原電位等不同，可使遺傳學(xué)上一致的細(xì)菌個(gè)體表現(xiàn)不同的特性，如產(chǎn)生毒素不同可使生物膜中一些細(xì)菌個(gè)體對(duì)宿主無(wú)危害，而另一些細(xì)菌則可能對(duì)宿主有致命威脅。因此，不均質(zhì)性是細(xì)菌生物膜的另一個(gè)重要特性，也與細(xì)菌的抗性有關(guān)。有研究表明，生物膜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧和代謝產(chǎn)物濃度呈現(xiàn)出一種自外向內(nèi)的下降趨勢(shì)[24]。這種特殊的微環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件導(dǎo)致位于生物膜頂部的細(xì)胞具有較好的代謝活性，而其他細(xì)菌則處于穩(wěn)定期或生長(zhǎng)緩慢[12](圖3)，從而降低了對(duì)抗菌藥物的敏感性。部分抗菌藥物可以殺滅最外層敏感性較高的細(xì)菌，但只能部分殺滅或無(wú)法殺滅敏感性低的細(xì)菌。而死亡細(xì)菌會(huì)成為殘存細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，從而形成新的生物膜。

圖3 生物膜中細(xì)菌的代謝活性Fig.3 Metabolic activity of bacteria in biofilms[12]

2.3 生物膜中基因表型改變

在形成生物膜時(shí)，細(xì)菌會(huì)由浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變成固著狀態(tài)，這種生長(zhǎng)環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致浮游細(xì)菌和生物膜細(xì)菌之間存在表型差異，具體表現(xiàn)為這2種生活方式的細(xì)菌不共享相同的轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組，生物膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性遠(yuǎn)低于基因相同的浮游細(xì)菌。且生物膜中的細(xì)菌比浮游細(xì)菌積累突變的速度更快，這些突變會(huì)導(dǎo)致抗生素耐藥性的增加[25]。生物膜中積累的突變會(huì)加速耐藥菌株的出現(xiàn)，開發(fā)根除生物膜藥物刻不容緩。

2.4 產(chǎn)生QS信號(hào)

生物膜中的細(xì)菌可以利用QS機(jī)制產(chǎn)生耐藥性[26]。當(dāng)生物膜內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量超過(guò)一定閾值時(shí)，QS會(huì)使一部分細(xì)菌脫離表面，轉(zhuǎn)為浮游態(tài)，導(dǎo)致感染擴(kuò)散或復(fù)發(fā)。例如，低劑量的外源AI-2可顯著增強(qiáng)豬鏈球菌的生物膜形成能力，促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生[27]。目前，有研究證明“淬滅”生物膜中的QS系統(tǒng)可增加生物膜對(duì)抗菌藥物的敏感性，如群體感應(yīng)抑制劑可以降低銅綠假單胞菌對(duì)妥布霉素的抗性，但不影響浮游細(xì)菌的敏感性[28]。所以，通過(guò)抑制QS系統(tǒng)也可以有效控制細(xì)菌生物膜形成。

2.5 激活嚴(yán)緊反應(yīng)

嚴(yán)緊反應(yīng)是細(xì)菌的一種自我保護(hù)機(jī)制，可以確保細(xì)菌在惡劣的外界環(huán)境下存活。當(dāng)缺乏合成蛋白質(zhì)所必需的氨基酸時(shí)，細(xì)菌便會(huì)停止合成核糖體RNA，發(fā)生空轉(zhuǎn)反應(yīng)，RelA和SpoT調(diào)控警報(bào)素四磷酸鳥苷(ppGpp)和五磷酸鳥苷(pppGpp)的合成，從而引發(fā)細(xì)菌的適應(yīng)性調(diào)控[29]。嚴(yán)緊反應(yīng)在介導(dǎo)生物膜耐藥性上的重要性已經(jīng)得到證實(shí)，如氨基酸和葡萄糖缺乏會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)氧氟沙星和氨芐青霉素的長(zhǎng)期耐受性[30]。Honsa等[31]分離出1株由于RelA錯(cuò)義突變導(dǎo)致ppGpp水平升高的耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌(VRE)菌株，當(dāng)在生物膜中生長(zhǎng)時(shí)，它顯示出對(duì)2種抗生素(托霉素和利奈唑胺)的極高的耐藥性。因此，這種依賴于對(duì)饑餓條件的生理適應(yīng)會(huì)影響生物膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，是生物膜產(chǎn)生耐藥性的重要因素之一。

2.6 啟動(dòng)外排泵系統(tǒng)

研究顯示，生物膜內(nèi)細(xì)菌中編碼外排泵基因的相對(duì)表達(dá)量和浮游細(xì)菌中的表達(dá)量之間存在差異。氟康唑在白色念珠菌生物膜形成早期誘導(dǎo)外排泵編碼基因過(guò)度表達(dá)[32]；在鮑氏不動(dòng)桿菌生物膜形成的不同階段，編碼外排泵基因的表達(dá)均上調(diào)[33]。由此可以說(shuō)明，外排泵系統(tǒng)參與了生物膜的形成過(guò)程，即細(xì)菌通過(guò)外排泵系統(tǒng)將抗菌藥物泵出胞外，造成菌體內(nèi)藥物濃度下降。因此，外排泵系統(tǒng)與細(xì)菌形成生物膜后的耐藥性密切相關(guān)。

2.7 分泌抗生素水解酶

分泌抗生素水解酶也是產(chǎn)生耐藥性原因之一，如銅綠假單胞菌生物膜基質(zhì)中分泌的β-內(nèi)酰胺酶，可以降解抗菌藥物，從而阻止這些藥物發(fā)揮作用。Bowler等[34]認(rèn)為，基質(zhì)中β-內(nèi)酰胺酶的數(shù)量增加會(huì)導(dǎo)致成熟的銅綠假單胞菌生物膜對(duì)頭孢他啶和美羅培南更具耐藥性。

3 AMPs抗生物膜作用

3.1 AMPs

AMPs具有良好的抗生物膜活性，可以抑制和清除生物膜[35-36]。與傳統(tǒng)抗生素相比，AMPs不易產(chǎn)生耐藥性，是極具潛力的抗生素替代物。如螺旋肽G3可以干擾變形鏈球菌生物膜形成的不同階段來(lái)抑制變異鏈球菌生物膜的形成。在初始階段，G3通過(guò)降低細(xì)菌表面電荷、疏水性、膜完整性和黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制細(xì)菌黏附。在后期，G3與EPS中的eDNA相互作用，破壞成熟生物膜的3D穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，從而分散它們。因此，G3在預(yù)防和治療變形鏈球菌生物膜感染方面表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力[37]。在銅綠假單胞菌生物膜開始生長(zhǎng)時(shí)添加肽DJK-5和DJK-6，能夠抑制生物膜的形成；在生物膜的結(jié)構(gòu)已經(jīng)明顯時(shí)，DJK-5和DJK-6可以分散和根除成熟生物膜中的細(xì)菌[38]。肽cCATH-2對(duì)浮游菌和生物膜內(nèi)細(xì)菌有快速殺滅能力，可以減少細(xì)菌最初附著和其他階段的生物量[39]。Moazzezy等[40]發(fā)現(xiàn)，3種人中性粒細(xì)胞肽類似物均顯示出對(duì)大腸桿菌生物膜的抑制和根除作用?？咕腖L-37在濃度遠(yuǎn)小于其MIC時(shí)即可破壞鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜，且隨著LL-37濃度的增加，生物膜呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)[41]。P318在0.15 μmol/L時(shí)可以抑制白色念珠菌生物膜的形成[42]。上述肽的序列和來(lái)源詳見表1。

表1 肽的名稱、序列和來(lái)源Table 1 Peptide names, sequences and sources

3.2 AMPs與抗生素聯(lián)用

部分AMPs與抗生素聯(lián)用可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的協(xié)同作用。青霉素、氨芐青霉素和紅霉素與一系列含色氨酸的AMPs可以協(xié)同抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成[44]。肽DJK-5和DJK-6與幾種常見抗生素(環(huán)丙沙星、頭孢他啶、亞胺培南和妥布霉素)聯(lián)合使用時(shí)，抑制生物膜所需的抗生素濃度顯著降低，其中DJK-5與環(huán)丙沙星聯(lián)合抑制銅綠假單胞菌生物膜的FICI值為0.14(FICI指數(shù)為0.5表示良好的協(xié)同作用，相當(dāng)于每個(gè)化合物組合使用時(shí)MBIC下降了4倍，F(xiàn)ICI指數(shù)為1.0表示每個(gè)化合物組合使用時(shí)MBIC下降了2倍)，DJK-6與頭孢他啶聯(lián)用抑制大腸桿菌0157的FICI值為0.35[38]。與生理鹽水組相比，DJK-5和抗生素的聯(lián)合使用明顯減少小鼠皮膚膿腫模型中的細(xì)菌總數(shù)，表現(xiàn)出較好治療效果[45]。Zhang等[46]研究了14種抗生素聯(lián)合CRAMP對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的干預(yù)作用，最終篩選出以1/4最低抑菌濃度的CRAMP與黏桿菌素結(jié)合可以顯著抑制銅綠假單胞菌生物膜內(nèi)的活菌數(shù)和生物量。Dosler等[47]研究發(fā)現(xiàn)，3種抗生素(妥布霉素、環(huán)丙沙星和黏菌素)分別與LL-37和CAMA存在協(xié)同作用，可以抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，其中環(huán)丙沙星與LL-37/CAMA的協(xié)同效果最好。肽AS10在0.22 μmol/L時(shí)可以抑制白色念珠菌生物膜，并與兩性霉素B和卡泊芬凈協(xié)同作用于成熟生物膜，F(xiàn)ICI值小于或等于0.5[42]。Chernysh等[48]發(fā)現(xiàn)，肽FLIP7與美羅培南、阿米卡星、卡那霉素、氨芐青霉素、萬(wàn)古霉素和頭孢噻肟有高度協(xié)同作用，F(xiàn)ICI值小于0.25，且與單獨(dú)使用抗生素相比，用FLIP7和抗生素組合處理后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生物膜內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)、死細(xì)胞和活細(xì)胞都明顯減少。莫匹羅星與蜂毒素的協(xié)同作用為消除金黃色葡萄球菌生物膜也提供了新的思路[49]。

鑒于生物膜的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，僅用抗生素很難將其徹底清除，因此將AMPs與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合使用具有完全消除生物膜的可能性，適合用于治療生物膜導(dǎo)致的感染。但目前對(duì)于AMPs與抗生素聯(lián)用的研究仍然停留在效應(yīng)的觀察上，缺乏聯(lián)合作用機(jī)制的研究與抗體內(nèi)生物膜研究。

3.3 納米遞藥系統(tǒng)

采用納米遞藥系統(tǒng)可以克服AMPs在毒性、對(duì)蛋白水解的敏感性和藥代動(dòng)力方面的不足[50]。納米粒根據(jù)材料來(lái)源可分為無(wú)機(jī)納米粒載體和脂質(zhì)納米粒載體兩大類(表2)。

表2 納米粒分類Table 2 Classification of nanoparticles

近幾年對(duì)無(wú)機(jī)納米粒的研究相對(duì)較多，如銀納米粒本身就具有較強(qiáng)的抗菌活性和較強(qiáng)的抗菌膜效果，將其和AMPs結(jié)合后還可以提高AMPs的活性[51-52]。Gao等[53]研究開發(fā)了一種可以增強(qiáng)肽P-13抗菌活性的銀納米粒子，其可以提高肽P-13對(duì)4種細(xì)菌的抗菌活性[53]。脂質(zhì)納米載體可以改善藥物的生物利用度和吸收穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌膜靶向作用，是極有發(fā)展前途的新型藥物傳遞系統(tǒng)，如脂質(zhì)體是最常見脂質(zhì)納米載體。Meng等[54]通過(guò)在脂質(zhì)體上修飾靶向基團(tuán)實(shí)現(xiàn)了對(duì)EPS的選擇性結(jié)合，進(jìn)而提高了脂質(zhì)體對(duì)細(xì)菌生物膜的靶向性結(jié)合。因此，納米粒和AMPs聯(lián)合治療代表了開發(fā)抗生物膜藥物的一種新方法。

4 AMPs抗生物膜機(jī)制

4.1 破壞或降解生物膜內(nèi)細(xì)菌的細(xì)胞膜電位

革蘭氏陰性菌EPS多由細(xì)胞外基質(zhì)多糖組成，如脂多糖、蛋白聚糖、細(xì)胞外DNA。這些分子大部分帶負(fù)電荷，并且通過(guò)電荷排斥和空間位阻抑制抗菌劑的擴(kuò)散[55]。目前研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)AMPs是通過(guò)引起細(xì)胞質(zhì)膜去極化，誘導(dǎo)磷脂不規(guī)則分布，抑制重要代謝產(chǎn)物和細(xì)胞組分的合成，最終達(dá)到殺菌目的[56]。對(duì)3種不同結(jié)構(gòu)的細(xì)菌素(乳酸鏈球菌素nisin A、乳鏈球菌素lacticin Q和羊毛硫細(xì)菌素nukacin ISK-1)的活性和作用方式進(jìn)行研究，結(jié)果表明它們可以破壞膜電位，導(dǎo)致ATP外流，從而殺滅生物膜細(xì)菌[57]。

4.2 生物膜基質(zhì)的降解

AMPs還可以作用于生物膜的胞外聚合物基質(zhì)，抑制其產(chǎn)生和積累。例如，肽PI可以降解變異鏈球菌產(chǎn)生的胞外多糖，導(dǎo)致聚苯乙烯或唾液包被的羥基磷灰石上形成的生物膜減少[58]。與上述結(jié)論類似，在人肝源性抗菌肽Hepcidin 20(Hep20)存在下，生物膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，細(xì)胞外基質(zhì)明顯減少[59]。

4.3 避免細(xì)菌嚴(yán)緊反應(yīng)

目前，已有研究表明，在(p)ppGpp缺乏的菌株中，細(xì)菌形成生物膜的能力會(huì)明顯減弱。因此，通過(guò)調(diào)控(p)ppGpp合成酶和水解酶的表達(dá)來(lái)避免細(xì)菌嚴(yán)緊反應(yīng)是抗生物膜的一個(gè)有效機(jī)制。如SpoT是一種雙功能(p)ppGpp酶，即在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的條件下SpoT會(huì)促進(jìn)(p)ppGpp合成，在營(yíng)養(yǎng)物充足時(shí)SpoT水解(p)ppGpp以下調(diào)嚴(yán)緊反應(yīng)。肽1018通過(guò)下調(diào)SpoT的表達(dá)，導(dǎo)致(p)ppGpp降解，從而影響生物膜的形成[60]。

4.4 干擾信號(hào)系統(tǒng)和下調(diào)負(fù)責(zé)生物膜形成的基因

抑制c-di-GMP的合成可以干擾生物膜的形成。Foletti等[61]研究發(fā)現(xiàn)，富含脯氨酸的短肽能夠選擇性地結(jié)合細(xì)菌第二信使c-di-GMP，從而可以抑制銅綠假單胞菌生物膜的生長(zhǎng)。AMPs抑制生物膜形成的另一個(gè)機(jī)制是影響QS系統(tǒng)，例如LL-37降低了銅綠假單胞菌中與QS相關(guān)的基因表達(dá)，所以LL-37在低于抑制濃度時(shí)可以防止生物膜形成[62-63]。

在形成葡萄球菌生物膜時(shí)，PIA是表皮葡萄球菌生物膜發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要的物質(zhì)，其可以使表皮葡萄球菌相互黏附，從而形成生物膜。PIA由icaABCD操縱子編碼，而icaADBC操縱子由上游基因icaR編碼的阻遏物負(fù)調(diào)控[64-65]。有研究發(fā)現(xiàn)，暴露于6倍MIC的hBD-3的菌株組顯著下調(diào)了icaD的表達(dá)并上調(diào)了icaR的表達(dá)，而抑制icaD的轉(zhuǎn)錄會(huì)導(dǎo)致PIA的下調(diào)，從而減少了生物膜的形成[66]。

5 小 結(jié)

近年來(lái)，隨著對(duì)細(xì)菌生物膜的研究，人們逐漸意識(shí)到生物膜感染會(huì)造成嚴(yán)重的危害。然而傳統(tǒng)抗生素的治療效果較差，且極易造成病原菌的耐藥性，因此急需開發(fā)新型治療生物膜感染的藥物。AMPs具有多種積極的抗生物膜機(jī)制，可以抑制或消除生物膜，將其與抗生素聯(lián)用可有效減少抗生素的用量，因此AMPs在治療生物膜感染方面具有廣闊的發(fā)展前景。然而，目前在實(shí)際臨床治療中仍存在以下問(wèn)題亟待深入研究：AMPs自身對(duì)血清、蛋白酶敏感和生物安全問(wèn)題，并且造成感染的常是已經(jīng)成熟的生物膜。所以應(yīng)重點(diǎn)解決AMPs自身存在的不足，并加強(qiáng)AMPs對(duì)已經(jīng)成熟的生物膜的清除作用，以便于將AMPs更好的應(yīng)用于相關(guān)治療。納米遞藥系統(tǒng)可以在一定程度上克服上述缺點(diǎn)，是開發(fā)AMPs抗生物膜藥物未來(lái)研究的新方向之一。此外，繼續(xù)深入研究AMPs如何影響生物膜信號(hào)傳導(dǎo)、相關(guān)基因表達(dá)以及作用靶點(diǎn)等問(wèn)題有助于更合理高效的預(yù)防、控制傳染性和致病性生物膜形成，為開發(fā)治療生物膜感染藥物奠定理論基礎(chǔ)。