基于微生物群體感應(yīng)的固定化黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸

盧宗梅

(中糧生物化學(安徽)股份有限公司，安徽蚌埠233316)

近幾十年來，依賴于自動控制、材料和機械等學科的發(fā)展，發(fā)酵裝備與控制系統(tǒng)取得了長足進步，深層液態(tài)發(fā)酵成為了檸檬酸等生物化工產(chǎn)品最主要的生產(chǎn)方式。但是液態(tài)深層發(fā)酵也存在著一些天然缺陷：黑曲霉易受流體剪切壓力影響，環(huán)境的耐受性差,重復(fù)利用率低，即便采用連續(xù)發(fā)酵方式，也極易出現(xiàn)衰退、凋亡；同時，麩曲制備需要大量的人力資源和能源，這也成為了目前檸檬酸發(fā)酵難以有突破性發(fā)展的主要瓶頸之一[1-2]。因此，建立一種黑曲霉細胞高密度聚集、環(huán)境耐受性強和可連續(xù)重復(fù)利用的新型發(fā)酵工藝成為解決檸檬酸產(chǎn)業(yè)困境的關(guān)鍵，也是行業(yè)共同關(guān)注的熱點和焦點[3]。

與傳統(tǒng)游離發(fā)酵相比，固定化發(fā)酵因其具備明顯的優(yōu)勢，在生物化工產(chǎn)品的生產(chǎn)上得到了越來越廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[4-5]。固定化發(fā)酵可以不間斷地進行，減少了每批次種子液的培養(yǎng)時間，大大節(jié)省了生產(chǎn)時間和成本。同時，固定化生長的細胞會促進代謝的進行，使細胞的活性顯著增強，明顯縮短生產(chǎn)周期，提升產(chǎn)量，提高時空效率[6]。傳統(tǒng)的固定化方法主要采用凝膠包埋技術(shù)(如卡拉膠、海藻酸鈣)、自絮凝技術(shù)以及近年來流行的新型吸附介質(zhì)秸稈渣等[7]，達到固定化細胞的目的。該方法利用凝膠等可塑性強的載體對微生物細胞進行束縛，將其生長空間限定在一定范圍，對細胞的活性基本沒有影響[8]。凝膠成型方便且具有固定化密度高等優(yōu)點，因此該方法應(yīng)用得較為廣泛[9-11]。但是，在高溶氧、高剪切力的環(huán)境下，凝膠載體力學強度差、易破碎，無法長時間保持固定化發(fā)酵的狀態(tài)，從而限制了其在檸檬酸發(fā)酵以及其他工業(yè)上的應(yīng)用?；谖⑸锶后w感應(yīng)開發(fā)的生物膜固定化技術(shù)是一種新型的吸附法[12]。羅虎等[13]通過此法將酵母快速富集并產(chǎn)生大量生物膜，實現(xiàn)了高濃度酒精發(fā)酵。

本文中，針對黑曲霉無法形成適于發(fā)酵的生物膜問題，筆者提出了基于微生物群體感應(yīng)的生物膜催化體系，對介質(zhì)的各種物理性質(zhì)進行系統(tǒng)的優(yōu)化，篩選出合適的固定化介質(zhì)，使黑曲霉可以吸附在上面，形成合適的生物膜。同時，針對傳統(tǒng)發(fā)酵中添加的營養(yǎng)成分可能對固定化發(fā)酵不利的問題，重點研究氮源、磷源和麩皮水解液對固定化發(fā)酵的影響，并分析固定化發(fā)酵工藝的可行性，以期達到開發(fā)連續(xù)高效低成本的新型檸檬酸生產(chǎn)工藝的目的。

1 材料和方法

1.1 菌株

黑曲霉831，從ATCC12846菌株中誘變篩選得到，保藏于筆者所在實驗室。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

PDA培養(yǎng)基：稱取大約200 g土豆，削皮，切成1 cm3大小的小塊，加入600 mL水，煮沸30 min，然后用4層紗布過濾，得到的土豆汁定容至1 L，再加入20 g/L的葡萄糖和15 g/L的瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

黑曲霉發(fā)酵合成培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100， (NH4)2SO42、NaNO31、 KH2PO40.5、MgSO4·7H2O 0.3；用水或麩皮水解液定容至1 L。

麩皮水解液：稱取15 g/L的麩皮，加入800 mL水，煮沸1 h后，用4層紗布過濾得濾液，用水再定容至1 L。

黑曲霉發(fā)酵木薯培養(yǎng)基：稱取160 g 木薯粉和40 g玉米粉，加入800 mL麩皮水解液，200 μL液化酶(酶活20 000 U/g)，攪拌均勻，然后加熱至86 ℃，保溫2 h后，4 000 r/min離心10 min取上清液，最后定容至1 L。

固定化介質(zhì)預(yù)處理：將載體用1 mol/L的NaOH浸泡1 h，用純水洗凈后，在1 mol/L鹽酸中浸泡1 h，之后用純水沖洗至pH為中性，再放入65 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量。將剪成不同大小的載體適量加入培養(yǎng)基中，115 ℃下共同滅菌20 min，冷卻待用。

黑曲霉活化：用接種環(huán)挑取些許孢子至PDA平板上，劃線使其分布均勻。36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，用適量的水將孢子刮下，制得孢子懸液，待用。

單批次發(fā)酵：500 mL三角瓶裝液量100 mL，以1%(體積分數(shù))的接種量將孢子懸液接種于培養(yǎng)基中，36 ℃、300 r/min搖床中培養(yǎng)，每隔一段時間取樣2 mL至離心管中，12 000 r/min離心5 min，將上清液與沉淀分離，測定上清的還原糖含量、檸檬酸含量以及菌的干質(zhì)量。

固定化連續(xù)發(fā)酵：第一批的培養(yǎng)方法與單批次發(fā)酵相同。當培養(yǎng)基中糖質(zhì)量濃度低于5 g/L時，將培養(yǎng)基倒出，然后補入新的培養(yǎng)基進行第二批發(fā)酵。之后的批次同該操作。

1.3 分析方法

1.3.1 還原糖、總糖及檸檬酸的測定

總糖含量的測定：取適量的樣品加入50 mL離心管中，然后加入5 mL濃H2SO4和5 mL純水，沸水浴10 min，使總糖完全水解。置于冰水中冷卻后，加一滴酚酞指示劑，用6 mol/L的NaOH中和至微紅色，最后定容至50 mL。之后按照3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定水解后的還原糖含量，即總糖含量。

標準曲線的繪制：配制質(zhì)量濃度為0～1.0 g/L的一系列糖標準溶液，各濃度分別取0.5 mL加入15 mL離心管中，然后在每個離心管中加入0.5 mL DNS溶液，將離心管置于沸水浴中反應(yīng)5 min后，置于冰水中冷卻，之后每個離心管中加入8 mL純水，混勻后測定波長540 nm下的吸光值A(chǔ)540，以0 g/L為對照。以標準溶液的濃度為縱坐標，吸光值A(chǔ)540為橫坐標繪制標準曲線。

樣品測量方法：樣品適當稀釋之后，測量方法同上。不同的糖對應(yīng)不同的標準曲線。

檸檬酸的測定：采用1100系列高效液相色譜(安捷倫公司)對檸檬酸含量進行測定，配制質(zhì)量濃度為0～10 g/L的一系列檸檬酸標準液，吸取1 mL，用0.22 μm的濾膜過濾后裝入液相小瓶中待測。分析條件如下：RID示差檢測器；流動相為5 mmol/L H2SO4；Bio-Rad的Aminex HPX-87H有機酸柱，流速為0.6 mL/min；進樣量20 μL，柱溫55 ℃，停止時間20 min。測定不同濃度樣品的峰面積，以標準溶液的濃度為縱坐標，對應(yīng)的峰面積為橫坐標繪制標準曲線。樣品測定時，將上清液進行適當稀釋后吸取1 mL，用0.22 μm的濾膜過濾后裝入液相小瓶中待測。測得的峰面積代入標準曲線算出濃度。

1.3.2 菌體干質(zhì)量的測定

培養(yǎng)基中的菌絲干質(zhì)量：將所取樣離心后的沉淀用純水洗2次后，置于100 ℃烘箱中，24 h后烘干至恒質(zhì)量，稱量并記下離心管的質(zhì)量。之后再用6 mol/L NaOH將離心管中的菌絲去除干凈，再次在100 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量后，稱量并記下空離心管的質(zhì)量。用之前的質(zhì)量減去空離心管的質(zhì)量即為培養(yǎng)基中游離菌絲干質(zhì)量。

載體上固定化的菌絲干質(zhì)量：將瓶中的所有載體用純水沖洗3次后，置于100 ℃烘箱中，24 h后烘干至恒質(zhì)量，稱量并記下載體的質(zhì)量。之后再用6 mol/L NaOH將載體上的菌絲去除干凈，再次在100 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量后，稱量并記下空載體的質(zhì)量。用之前的質(zhì)量減去空載體的質(zhì)量即為固定化細胞干質(zhì)量。

1.3.3 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察生物膜

將固定化發(fā)酵后的載體取出，用PBS緩沖液沖洗3遍吸附的菌絲。-80 ℃冰箱放置過夜后置于凍干機(Labconco公司)中凍干。再將載體通過導(dǎo)電膠粘在點鏡臺上，20 mA、30 s進行噴金。然后用TM3000掃描電子顯微鏡(Hitachi公司)觀察分析，放大倍數(shù)在50、100和200倍左右。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化介質(zhì)的優(yōu)化

2.1.1 固定化介質(zhì)的疏水性對黑曲霉固定化發(fā)酵的影響

為了獲得最適宜的黑曲霉固定化發(fā)酵介質(zhì)，首先考察介質(zhì)表面疏水性對黑曲霉固定化發(fā)酵的影響，以檸檬酸高產(chǎn)菌株黑曲霉 831為出發(fā)菌株，通過固定化發(fā)酵以及游離發(fā)酵來對比考察3種不同疏水性的載體PUF、PPF和PAF201(疏水性從大到小依次為PUF、PAF201、PPF)效果，結(jié)果如圖1和表1所示。

圖1 3種原始載體以及它們固定化發(fā)酵后的掃描電鏡圖像Fig.1 SEM images of Aspergillus niger 831 cultured with three different support carriers

由圖1和表1可知：與游離發(fā)酵相比，只有PAF201在固定化發(fā)酵過程中表現(xiàn)出更好的效果，PAF201固定化黑曲霉的檸檬酸產(chǎn)量為80.5 g/L，產(chǎn)率達到了82.9%，而游離發(fā)酵僅有61.2%，相比而言，固定化的產(chǎn)率提升了35.4%。PPF固定化的發(fā)酵結(jié)果與游離發(fā)酵的結(jié)果基本相同，而PUF的固定化效果比游離發(fā)酵的效果差。

表1 不同載體的發(fā)酵結(jié)果

此外，3種載體固定的黑曲霉干質(zhì)量有著顯著的差異。在PUF的固定化體系中，有21.5 g/L細胞固定在了載體上，而游離細胞僅為1.38 g/L，這表明幾乎所有的菌絲都被吸附在載體上。但是大量菌絲在發(fā)酵過程中堵塞了載體孔徑，而且菌絲緊緊地包裹著載體，并且互相交聯(lián)纏繞，形成了一個白色緊密的塊狀物，這會導(dǎo)致載體中間大部分的菌絲都因缺乏營養(yǎng)和氧氣而死亡。與PUF相反，黑曲霉在PPF上的吸附量很少，游離細胞的干質(zhì)量與游離發(fā)酵的細胞干質(zhì)量幾乎相同，可見只有少數(shù)菌絲被吸附在載體上，不能形成成熟的生物膜。因此，與PUF和PPF相比，PAF201更適合黑曲霉的固定化發(fā)酵。

由圖1還可知，黑曲霉在不同載體上形成了不同的生物膜。對PAF201而言，適量的細胞被固定在載體上，形成成熟的生物膜，菌絲從生物膜中伸出。由于菌絲在載體上的分布較為松散，因此它們不會堵塞毛孔，阻止養(yǎng)分的傳遞。死菌絲可以從載體上脫落進入培養(yǎng)基，而活性細胞則繼續(xù)吸附在載體上。這樣的細胞動態(tài)平衡有助于保持載體上細胞的發(fā)酵活性，維持固定化系統(tǒng)的發(fā)酵性能[14]。

適合的吸附載體是黑曲霉固定化發(fā)酵的關(guān)鍵因素。黑曲霉孢子壁具有很強的疏水力，它會促使發(fā)酵過程中的孢子團聚以及載體吸附等過程[15]。PAF201、PPF和PUF具有不同的疏水力，它們在固定化發(fā)酵中表現(xiàn)出不同的效果。因為PUF載體具有強疏水性，所以在遇到同樣是強疏水的黑曲霉孢子時，可通過強疏水相互作用吸附在一起，并在載體上進行生長。因為PPF具有很弱的疏水力，孢子與載體表面無法產(chǎn)生足夠的疏水作用，因此無法形成生物膜。PAF201具有合適的疏水性，可以適當?shù)匚胶谇沟逆咦?，所以PAF201固定化體系可以顯著提高黑曲霉的發(fā)酵效率。

2.1.2 載體孔徑大小以及載體添加量對固定化發(fā)酵的影響

由于在固定化時，黑曲霉會在載體孔徑內(nèi)吸附生長，因此，孔徑的空間大小也會影響固定化發(fā)酵的效果。因此考察不同孔徑(0.2、0.6和1.5 mm)的PAF201載體對黑曲霉固定化發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：載體孔徑的增加導(dǎo)致固定的細胞干質(zhì)量大幅減少和游離細胞干質(zhì)量增加。在孔徑0.2 mm的載體上，由于孔徑過小，菌絲很容易長滿孔徑中的空間，這限制了內(nèi)層菌絲獲得外部營養(yǎng)的能力。1.5 mm孔徑載體上的固定化黑曲霉干質(zhì)量明顯低于0.6 mm的載體，因為在較大的孔隙的載體上結(jié)合的生物膜很容易被旋轉(zhuǎn)以及渦流等產(chǎn)生的剪切力給消除。因此，孔徑1.5 mm的載體幾乎無法固定黑曲霉，其發(fā)酵性能與游離細胞發(fā)酵相似；而0.6 mm孔徑的PAF201可以固定適量的黑曲霉，形成穩(wěn)定的生物膜，檸檬酸產(chǎn)量最高。

為了確定最佳載體添加量，研究了添加0.5、1.0和3.0 g/L的PAF201對黑曲霉固定化的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：在培養(yǎng)基中添加1.0 g/L載體時，固定化的效果最好；隨著載體數(shù)量的增加，載體上的菌絲量開始增加，游離細胞干質(zhì)量減少。同時可以發(fā)現(xiàn)，添加3.0 g/L載體后菌絲已經(jīng)將載體的孔徑封住了，這可能是由于載體自身具有的最大吸附能力造成的[16]。當載體數(shù)量過多，幾乎所有菌絲都被吸附在PAF201上，使固定化的細胞無法與游離的細胞形成動態(tài)平衡。因此，在黑曲霉固定化發(fā)酵中，載體PAF201的最適添加量為1.0 g/L。

圖2 不同載體孔徑大小對固定化效果的影響Fig.2 Effects of different carrier pore sizes on immobilization

圖3 載體添加量對固定化效果的影響Fig.3 Effects of different carrier adding amount on the immobilization

2.2 氮源、磷源以及麩皮水解液對固定化的影響

2.2.1 (NH4)2SO4添加量對固定化發(fā)酵的影響

在檸檬酸發(fā)酵途徑中，NH4+不僅可以激活磷酸果糖激酶，還能解除檸檬酸和ATP對該酶的底物抑制作用，促進黑曲霉快速消耗葡萄糖并用于三羧酸循環(huán)(TCA)中積累檸檬酸。同時，NH4+作為一種重要的無機氮源，是黑曲霉生長的必需營養(yǎng)[17]。但是在固定化過程中，發(fā)酵前期菌體如果生長過快，就會導(dǎo)致載體孔徑的堵塞，因此，合適的氮源添加量對固定化發(fā)酵來說是相當重要的。不同(NH4)2SO4濃度對黑曲霉固定化發(fā)酵的影響如圖4所示。

圖4 不同(NH4)2SO4濃度對黑曲霉固定化發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of different (NH4)2SO4 concentrations on immobilization

由圖4可知：(NH4)2SO4為0 g/L時，固定化黑曲霉的檸檬酸產(chǎn)量較低，同時載體上固定的菌量也很少。由于(NH4)2SO4是培養(yǎng)基中的唯一氮源，在缺少氮源的情況下，黑曲霉的生長受到抑制，檸檬酸積累較低。當(NH4)2SO4的添加量逐漸增加時，黑曲霉的生長恢復(fù)正常，NH4+對糖酵解途徑(EMP)起促進作用，加快葡萄糖的消耗，檸檬酸的產(chǎn)量有了顯著的提升，載體固定的菌量也逐漸增多。(NH4)2SO4大于3 g/L，檸檬酸產(chǎn)量又明顯下降，固定化的菌量突然增多，逐漸將載體包裹堵塞，傳氧傳質(zhì)受到阻礙，載體中的菌開始大量死亡。這說明固定化黑曲霉對NH4+更加敏感，過多或過少的氮源都會對固定化發(fā)酵產(chǎn)生明顯的抑制。同時，添加2 g/L的(NH4)2SO4時，黑曲霉831的固定化發(fā)酵效果是最佳最穩(wěn)定的。

2.2.2 KH2PO4添加量對黑曲霉固定化的影響

圖5 不同KH2PO4濃度對黑曲霉固定化發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of different KH2PO4 concentrations on immobilization

圖7 固定化黑曲霉在不同發(fā)酵時期的掃描電鏡圖Fig.7 SEM images of Aspergillus niger cultured at different fermentation stages with PAF201

2.3 麩皮水解液(WBE)對黑曲霉固定化發(fā)酵的影響

麩皮在黑曲霉乃至絲狀真菌工業(yè)發(fā)酵中都起到至關(guān)重要的作用。但是在PAF201存在的環(huán)境下，直接加入固體麩皮會對固定化環(huán)境造成不良的影響，因此，筆者研究麩皮水解液是否可以代替固體麩皮，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：在未添加麩皮水解液的發(fā)酵條件下，固定化黑曲霉生長緩慢，在96 h的時候只消耗了38 g/L的糖，檸檬酸產(chǎn)量只有10 g/L左右。載體上的黑曲霉雖然不多，但是全部聚集在一起，可能因為在缺少麩皮水解液的情況下，黑曲霉的生長環(huán)境不適宜黑曲霉發(fā)生群體效應(yīng)。而在添加了麩皮水解液的培養(yǎng)基中，在96 h的時候殘?zhí)侵挥?.4 g/L，檸檬酸產(chǎn)量達到81.7 g/L。該結(jié)果證明了麩皮水解液對固定化黑曲霉的發(fā)酵起到促進作用。

圖6 麩皮水解液對固定化黑曲霉發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of wheat bran extract (WBE) on immobilization

2.4 發(fā)酵過程中黑曲霉生物膜的形態(tài)變化

通過SEM分析不同發(fā)酵時序下的固定化載體，研究對固定化發(fā)酵的微尺度機制。圖7為固定化發(fā)酵過程中不同時間點生物膜的形態(tài)。由圖7可知：在發(fā)酵12 h時，形成了早期生物膜，這時載體表面可以檢測到許多萌發(fā)孢子，這些孢子開始萌發(fā)和分泌黏附物質(zhì)，導(dǎo)致細胞開始聚集。在發(fā)酵24 h時，早期的生物膜開始出現(xiàn)頂端延伸和菌絲分支，在此階段，黑曲霉開始產(chǎn)生胞外基質(zhì)，以增強生長的菌落與基質(zhì)之間的黏附。發(fā)酵72 h時，載體表面已經(jīng)形成了成熟的生物膜，在此階段，由于細胞的動態(tài)平衡，生物膜的厚度基本保持不變。成熟的生物膜可以提供良好的條件，使其在固定化連續(xù)發(fā)酵中維持一個高效穩(wěn)定的發(fā)酵環(huán)境。

2.5 固定化黑曲霉在木薯粉培養(yǎng)基中的連續(xù)發(fā)酵性能

目前工業(yè)上檸檬酸發(fā)酵大多使用木薯粉作為原料，因此筆者驗證PAF201固定化黑曲霉發(fā)酵木薯粉的效果。圖8顯示了固定化連續(xù)發(fā)酵8個批次的發(fā)酵結(jié)果。由圖8可知：在第1和第2批次中，發(fā)酵周期分別約為96和85 h,比之后的批次略長(72 h)。這是由于黑曲霉在固定化前期需要花費一定的時間在載體上形成生物膜。在第3批次之后，固定化的發(fā)酵周期只有72 h，比游離發(fā)酵的時間縮短了約24 h。此外，檸檬酸始終保持在160 g/L左右，而且8個批次下來，檸檬酸產(chǎn)量一直保持穩(wěn)定。

圖8 固定化黑曲霉利用木薯粉連續(xù)發(fā)酵檸檬酸的發(fā)酵效果Fig.8 Citric acid production by Aspergillus niger in immobilized repeated fed-batch culture using cassava medium

為了比較固定化和游離發(fā)酵的檸檬酸生產(chǎn)強度，筆者同時進行游離細胞的連續(xù)發(fā)酵，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，隨著時間的推移，游離連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)強度不斷下降。固定化發(fā)酵的檸檬酸生產(chǎn)強度(2.26 g/(L·h))幾乎是游離發(fā)酵的1.6倍(1.41 g/(L·h))。此外，在3～8批次的固定化過程中，檸檬酸的生產(chǎn)強度沒有明顯的下降。這表明，PAF201固定化系統(tǒng)在黑曲霉發(fā)酵中的穩(wěn)定性較好。在8批次發(fā)酵中，檸檬酸產(chǎn)量最高可以達到162.7 g/L，產(chǎn)率達到89.9%。表2顯示了使用PAF201作為載體的檸檬酸生產(chǎn)效率與使用其他載體之間的比較。與文獻[18-22]結(jié)果相比，PAF201固定化系統(tǒng)可以明顯提高檸檬酸的產(chǎn)量，并且比其他吸附固定化系統(tǒng)更有效且穩(wěn)定。

圖9 固定化連續(xù)發(fā)酵與游離連續(xù)發(fā)酵之間穩(wěn)定性的差異Fig.9 Comparison of citric acid productivity in repeated fed-batch fermentation with free-cell cultivation and immobilized fermentation

表2 本研究與其他固定化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸水平的比較

3 結(jié)論

載體優(yōu)化實驗表明，孔徑0.6 mm、添加量1.0 g/L的PAF201最適合黑曲霉的固定化發(fā)酵，在以葡萄糖為底物的發(fā)酵中，發(fā)酵周期明顯減少，產(chǎn)量最高達到80.5 g/L，產(chǎn)率達到了82.9%，比游離發(fā)酵提高了35.4%。

2 g/L的(NH4)2SO4和0.5 g/L的KH2PO4是最適宜的添加量。同時，添加麩皮水解液可以穩(wěn)定黑曲霉的固定化環(huán)境，改善了黑曲霉的固定化效果。

以工業(yè)常用的木薯粉培養(yǎng)基為底物，進行8批次總計超過600 h的固定化黑曲霉連續(xù)發(fā)酵。結(jié)果表明，發(fā)酵周期比游離發(fā)酵縮短了24 h ，檸檬酸產(chǎn)量最高達到了162.7 g/L，生產(chǎn)強度達到了2.26 g/(L·h)，是游離發(fā)酵的1.6倍。8批次連續(xù)發(fā)酵中，發(fā)酵性能沒有明顯下降，整個固定化發(fā)酵體系穩(wěn)定高效。

由此可見，利用微生物群體感應(yīng)的發(fā)酵體系具有較強的工業(yè)應(yīng)用價值。