白蘇葉揮發(fā)油超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化、成分分析及抗氧化活性研究

齊富友 蹇順華 劉 吟 段麗萍 吳 昭

(1. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430040；2. 武漢黃鶴樓新材料科技開發(fā)有限公司，湖北 武漢 430040)

白蘇(PerillafrutescensL.Britt.)，唇形科紫蘇屬植物?，F(xiàn)有研究證明，白蘇葉具有抑菌、升血糖、保護(hù)腸胃、鎮(zhèn)靜、抗衰老等作用[1-3]，且對(duì)動(dòng)物油脂、肉類和調(diào)味食品等具有較強(qiáng)的抗氧化活性[4]。植物揮發(fā)油一般是從植物不同部位(種子、根、花、葉、果實(shí)、樹皮等)加工獲得的揮發(fā)性物質(zhì)，也是天然香料的重要組成部分[5]。但揮發(fā)油穩(wěn)定性較差，提取效果易受原料來(lái)源、品種、加工方法等影響。傳統(tǒng)的提取方法有壓榨法、水蒸氣蒸餾、溶劑萃取等[6-7]，但存在純度低、提取效能差、溶劑殘留的缺點(diǎn)，現(xiàn)在常用超聲、微波、超臨界流體萃取等方法[8-9]，其中超臨界與超聲、微波相比，香氣更天然[10]，還可添加夾帶劑，萃取的揮發(fā)油成分較完整，無(wú)殘留，無(wú)毒、無(wú)污染，符合國(guó)家大力倡導(dǎo)的綠色發(fā)展理念，因此仍是天然植物提取應(yīng)用的主流方向，尤以食品、揮發(fā)油及天然香料的提取分離最為熱門[11-12]。

目前，關(guān)于白蘇葉揮發(fā)油的提取多采用水蒸氣蒸餾和超聲提取，但提取時(shí)間長(zhǎng)和得率不理想[13]。試驗(yàn)擬以白蘇葉為研究原料，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超臨界CO2萃取白蘇葉揮發(fā)油提取工藝條件，通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)分析白蘇葉揮發(fā)油的化學(xué)成分，并以DPPH·和·OH的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)白蘇葉揮發(fā)油的抗氧化力，旨在提升白蘇葉的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

白蘇葉：恩施自治州農(nóng)科院；

硫酸亞鐵、水楊酸、30%過(guò)氧化氫：AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速粉碎機(jī)：FW-200型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

超臨界CO2萃取裝置：HA221-50-06型，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；

旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀：HD-205型，瑞士BUCH公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent GC 6890-MS5973N型，美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 白蘇葉處理 將白蘇葉洗凈放入烘箱內(nèi)，80～90 ℃下干燥24 h，用刀切成段后粉碎，過(guò)50目篩得到粒度分布均勻的粉末，備用。

1.2.2 超臨界CO2萃取 取處理后的白蘇葉250 g，裝入萃取罐內(nèi)，設(shè)定萃取壓力20 MPa，溫度45 ℃，CO2流量30 L/h；其他條件參照文獻(xiàn)[14]，按式(1)計(jì)算提取率。

(1)

式中：

R——白蘇葉揮發(fā)油的提取率，%；

m1——白蘇葉揮發(fā)油的質(zhì)量，g；

m2——白蘇葉原料的質(zhì)量，g。

1.2.3 水蒸氣蒸餾提取 參照文獻(xiàn)[15]，稱取白蘇葉粉末250 g裝入燒瓶，倒入1/3體積的蒸餾水和10 mL的萃取劑乙酸乙酯，加熱2 h，按式(1)計(jì)算提取率。

1.2.4 理化指標(biāo)測(cè)定

(1)色澤：按GB/T 22460—2008執(zhí)行。

(2)透明度、氣滋味：按GB/T 5525—2008執(zhí)行。

(3)過(guò)氧化值：按GB/T 5538—2005執(zhí)行。

(4)酸值：按GB/T 5530—2005執(zhí)行。

1.2.5 因素選擇 設(shè)定萃取壓力(25 MPa)、溫度(40 ℃)、時(shí)間(1.5 h)、CO2流量(25 L/h)為固定值，依次改變萃取壓力(15～35 MPa，每個(gè)水平增加5 MPa，共5個(gè)水平)、萃取溫度(30～50 ℃，每個(gè)水平增加5 ℃，共5個(gè)水平)、萃取時(shí)間(0.5～2.5 h，每個(gè)水平增加0.5 h，共5個(gè)水平)和CO2流量(15～35 L/h，每個(gè)水平增加5 L/h，共5個(gè)水平)，探討提取率受各因素的影響程度。

1.2.6 響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選定影響較顯著的3個(gè)因素，設(shè)置響應(yīng)值為白蘇葉揮發(fā)油提取率，借助Box-Behnken工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并對(duì)模型預(yù)測(cè)的工藝設(shè)置進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.7 白蘇葉揮發(fā)油的GC-MS分析

(1)色譜條件：色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣為高純He；流速l mL/min(恒流)；柱頭壓83 kPa；進(jìn)樣量1.5 μL；分流比20∶1；程序升溫起始溫度60 ℃，停留l min，以5 ℃/min的升溫速率升至260 ℃保持5 min。

(2)質(zhì)譜條件：EI離子源；電離能量70 eV；離子源溫度190 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描范圍50～550；檢索譜庫(kù)為NIST譜庫(kù)。

1.2.8 抗氧化活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)樣品重復(fù)3次。運(yùn)用Excel、Origin 2019b和 Design Expert 8.0.6 軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

如圖1所示，壓力上升至25 MPa時(shí)提取率顯著增加，繼續(xù)加壓提取率反而有所下降，最終壓力選擇20～30 MPa；溫度為40 ℃時(shí)提取能力穩(wěn)定，持續(xù)升溫不能提高提取率，可能是較高溫度會(huì)降低揮發(fā)油的穩(wěn)定性，故萃取溫度初步定為35～45 ℃；萃取時(shí)間在0.5～1.5 h時(shí)，揮發(fā)油提取率迅速增加，1.5 h后溶液與溶質(zhì)充分接觸達(dá)到平衡，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間提取率也難以提高，所以選用1.5 h左右為提取時(shí)間較合適；當(dāng)CO2流量由25 L/h變?yōu)?0 L/h時(shí)，揮發(fā)油提取率顯著增加，繼續(xù)增加揮發(fā)油提取率反而下降，在白蘇葉揮發(fā)油萃取試驗(yàn)中，CO2流量為30 L/h左右最佳。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 比較單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終設(shè)置CO2流量30 L/h，選擇萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間為響應(yīng)變量(表1)，設(shè)定響應(yīng)值為白蘇葉揮發(fā)油提取率進(jìn)行響應(yīng)面分析(表2)。

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得各影響因素與響應(yīng)值的模型回歸方程：

圖1 萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間和CO2流量對(duì)白蘇葉揮發(fā)油提取率的影響Figure 1 Effects of extraction pressure,extraction temperature,extraction time and CO2 flow on the yield of volatile oil from Perilla frutescens leaf

Y=2.45+0.31A-0.26B+0.56C-0.13AB+0.29AC+0.25BC-0.96A2-0.49B2-0.27C2。

(2)

由圖2可知，萃取時(shí)間一定時(shí)，隨著萃取壓力和萃取溫度的升高，響應(yīng)值Y(白蘇葉揮發(fā)油提取率)先升高后下降，當(dāng)萃取壓力提升至25 MPa、萃取溫度至40 ℃附近時(shí)，白蘇葉揮發(fā)油提取率存在最大值。萃取溫度和萃取壓力一定時(shí)，響應(yīng)值同樣隨著其他因素水平的提升先增加后降低。其中萃取壓力和萃取時(shí)間的影響最顯著，響應(yīng)曲面較陡，與回歸模型方差分析結(jié)果一致。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Experiment design of response surface factor

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Table 2 The RSM design and results

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Regression coefficient and variance analysis

圖2 各參數(shù)交互作用的影響Figure 2 Effects of interaction with different factors

2.2.3 工藝驗(yàn)證 模型預(yù)測(cè)的最佳工藝組合為：萃取壓力26.56 MPa、萃取溫度39.76 ℃，萃取時(shí)間2.0 h，其預(yù)測(cè)揮發(fā)油提取率約為2.83%。考慮生產(chǎn)應(yīng)用的可行性，以萃取壓力27 MPa、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間2.0 h進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=5)。結(jié)果表明，白蘇葉揮發(fā)油提取率為(2.71±1.19)%，與預(yù)測(cè)值(2.83%)非常接近。相同提取時(shí)間下，提取率比水蒸氣蒸餾高67%。

2.3 白蘇葉揮發(fā)油品質(zhì)分析

2.3.1 萃取工藝對(duì)白蘇葉揮發(fā)油品質(zhì)的影響 由表4可知，超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾相比，揮發(fā)油各指標(biāo)均有一定程度改善，香氣更接近天然香味，可能是因?yàn)槌R界CO2萃取工藝溫度低，較好地保留了熱敏性物質(zhì)的天然活性。夾帶劑乙醇的加入能一定程度降低過(guò)氧化值和酸值，但其機(jī)理尚不清楚。

表4 白蘇葉揮發(fā)油的主要質(zhì)量指標(biāo)Table 4 The main quality index of Perilla leaf oil

2.3.2 白蘇葉揮發(fā)油GC-MS分析 對(duì)白蘇葉揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，其總離子流圖如圖3所示，共分離出55個(gè)峰，并采用面積歸一化法計(jì)算白蘇葉揮發(fā)油各組分相對(duì)含量，結(jié)果見表5。共51種成分被鑒定出，鑒定出的物質(zhì)成分占總峰的98.49%，其主要成分是酯類、醇類和烯類化合物。在鑒定出的化合物中，相對(duì)含量在1%以上的有7種，占被檢測(cè)物質(zhì)總量的90.83%，其中乙酸芳樟酯的相對(duì)含量達(dá)到54.22%，其次是芳樟醇(19.59%)、松油烯(5.06%)、丙酸葉醇酯(4.94%)、β-石竹烯(3.37%)、橙花醇乙酸酯(2.34%)、石竹素(1.31%)等。

圖3 白蘇葉揮發(fā)油的總離子流色譜圖Figure 3 Total ion flow chromatography of volatile oil from Perilla frutescens leaf

2.4 白蘇葉揮發(fā)油的抗氧化活性

2.4.1 清除DPPH·能力 由圖4可知，白蘇葉揮發(fā)油對(duì)DPPH·具有很好的清除作用，清除率隨濃度的增加而變強(qiáng)，呈明顯的量效關(guān)系。白蘇葉揮發(fā)油濃度為60～80 μL/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率變化平緩。相同濃度下白蘇葉揮發(fā)油對(duì)DPPH·清除率低于維生素C。濃度為80 μL/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率為89.21%。

表5 白蘇葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析結(jié)果Table 5 GC-MS analysis of volatile oil from Perilla frutescens leaf

2.4.2 清除·OH能力 由圖5可知，揮發(fā)油濃度為20～60 μL/mL時(shí)，隨著濃度的升高其對(duì)·OH的清除率顯著增強(qiáng)；濃度>80 μL/mL時(shí)，白蘇葉揮發(fā)油對(duì)·OH清除率與維生素C接近，說(shuō)明白蘇葉揮發(fā)油與維生系C的抗氧化活性相當(dāng)。

圖4 白蘇葉揮發(fā)油對(duì)DPPH·的清除率Figure 4 Scavenging rate of volatile oil to DPPH· from Perilla frutescens leaf

圖5 白蘇葉揮發(fā)油對(duì)·OH的清除率Figure 5 Scavenging rate of volatile oil to ·OH from Perilla frutescens leaf

3 結(jié)論

超臨界CO2萃取白蘇葉揮發(fā)油的最適參數(shù)為萃取壓力27 MPa、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間2.0 h，此條件下白蘇葉揮發(fā)油實(shí)際提取率可達(dá)(2.71±1.19)%。與水蒸氣蒸餾法對(duì)比提取率高67%，且白蘇葉揮發(fā)油各理化指標(biāo)均有一定程度改善，香氣更接近天然香味，加入夾帶劑能一定程度降低揮發(fā)油過(guò)氧化值和酸值。通過(guò)GC-MS分析，白蘇葉揮發(fā)油中含有51種化學(xué)成分，主要是酯類、醇類和烯類化合物?？寡趸囼?yàn)表明白蘇葉揮發(fā)油對(duì)DPPH·自由基和·OH自由基清除能力與白蘇葉揮發(fā)油濃度呈正相關(guān)，具有一定的抗氧化能力，可作為一種天然抗氧化劑原料。

白蘇葉作為一種常見中藥和日常調(diào)味品，在人們的生活中占據(jù)重要地位。但由于白蘇葉揮發(fā)油的組成成分豐富，其抗氧化機(jī)理及清除自由基活性成分分析仍需進(jìn)一步研究。下一步，擬開展不同夾帶劑對(duì)揮發(fā)油提取率及對(duì)品質(zhì)的影響，并對(duì)揮發(fā)油中主要的活性成分進(jìn)一步分離純化，探討其體內(nèi)體外抗氧化機(jī)理。