荊芥多糖制備及對(duì)百合荊梨汁的抑菌效果

曹 陽 張麗芳 賈春鳳

(1. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2. 保定學(xué)院，河北 保定 070100)

荊芥(Schizonepeta)為唇形科[1]，是一種藥食同源的植物，具有鎮(zhèn)痛消炎、止血、去痰平喘、抗氧化等多項(xiàng)作用，主治咽喉腫痛、感冒發(fā)熱、多種皮膚疾病等，為中醫(yī)臨床常用藥物[2]，在食品中的應(yīng)用鮮見報(bào)道。荊芥主要含有荊芥揮發(fā)油、薄荷酮、荊芥苷、黃酮、荊芥多糖等[3]，目前，荊芥揮發(fā)油是荊芥功能成分的主要研究對(duì)象[4-5]，對(duì)荊芥中多糖成分的研究較少。

近年來，天然抑菌劑的研發(fā)備受關(guān)注。資料[6-8]顯示，很多植物多糖具有較好的抑菌活性。孫立卿等[9]曾研究了荊芥多糖的提取工藝，發(fā)現(xiàn)荊芥中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)13.41%。有資料顯示，荊芥多糖不僅具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用[10]，還具有一定的抗氧化功能[11]，具有較高的研發(fā)價(jià)值。但目前對(duì)荊芥多糖的抑菌功能未見相關(guān)報(bào)道。

試驗(yàn)擬探究荊芥多糖的提取工藝，并將其與具有潤(rùn)肺、消痰、止咳、降火、治風(fēng)熱等功能的雪花梨[12-14]，以及具有潤(rùn)肺止咳、美容養(yǎng)顏、寧心安神等功效的干百合花[15]按一定比例配置成飲品，考察荊芥多糖對(duì)此飲品的抑菌效果，以期為荊芥在食品中的應(yīng)用提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雪花梨：江蘇省淮安市市售；

干百合花：蕪湖四月茶儂茶葉有限公司(分裝)；

荊芥：江蘇省淮安市大藥房；

干檸檬片：蕪湖四月茶儂茶葉有限公司(分裝)；

單晶體冰糖：保定市大眾味業(yè)有限公司；

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉菌(P.notatum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；

牛肉膏：天津市德晟生物技術(shù)有限公司；

蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

電子天平：JA2002型，上海精天電子儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：YX-24LDJ型，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2F型，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：svp-01型，湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；

可見分光光度計(jì)：722N型，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

(1)荊芥多糖制備：

荊芥→曬干→磨粉→稱量→加水→加熱→過濾→濾液→冷卻→多糖提取液

(2)百合荊梨汁制備：

1.2.2 原材料樣品制備

(1)雪梨汁：取新鮮雪花梨，清洗，去梗去核，切成1～2 cm的小塊，稱取100 g于1 000 mL白瓷缸中，加飲用水500 mL，加熱至沸騰后再用小火熬制至250 mL。

(2)檸檬汁：稱取干檸檬片15 g，加飲用水500 mL，加熱至沸騰后，改用小火熬煮濃縮至250 mL。

(3)糖水：稱取冰糖200 g，加水500 mL，加熱至沸騰后，改用小火熬煮8 min，冷卻至室溫，分裝于錐形瓶中，以4層保鮮膜及1層保鮮袋密封，放于冰箱冷藏備用(4 ℃)。

(4)百合雪梨汁：先按雪梨汁40%、糖水8%、檸檬汁1%配置好后，百合干花在此液中，按料液比1∶40 (g/mL)于80 ℃條件下浸泡20 min。

1.2.3 荊芥多糖制備 采用水提法。干燥荊芥粉碎并過40目篩。稱取10 g荊芥粉，加入300 mL水，加熱至60 ℃，保溫提取2 h。趁熱用6層滅菌紗布過濾、分裝入錐形瓶中，冷卻至室溫，4層食品級(jí)保鮮膜及1層食品級(jí)保鮮袋密封后，于4 ℃保存?zhèn)溆?。按?1)計(jì)算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——荊芥多糖的得率，mg/g；

C——荊芥汁中荊芥多糖的濃度，mg/mL；

V1——測(cè)定用荊芥汁體積，mL；

V——荊芥汁制備的總體積，mL；

M——荊芥干粉質(zhì)量，g。

1.2.4 荊芥多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[9]修改如下：用1 mL移液管移取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL。分別置于10 mL容量瓶中，均添加蒸餾水至1.0 mL，再加入1 mL 50 mg/mL苯酚溶液，然后再加入7 mL濃硫酸，定容，搖勻，放置至室溫，同時(shí)設(shè)置一組空白對(duì)照，490 nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 荊芥多糖制備的單因素試驗(yàn)

(1)料液比對(duì)荊芥汁制備的影響：在浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間3 h的條件下，分別按料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)配置樣品，考察料液比對(duì)荊芥多糖提取的影響。

(2)提取時(shí)間對(duì)荊芥汁制備的影響：在浸提溫度60 ℃、最佳料液比的條件下，分別在浸提時(shí)間1，2，3，4，5 h 時(shí)測(cè)定多糖含量，以確定最佳的浸提時(shí)間。

(3)提取溫度對(duì)荊芥汁制備的影響：在最佳浸提時(shí)間，最佳浸提料液比的條件下，測(cè)定浸提溫度50，60，70，80，90 ℃下的荊芥多糖提取率以確定最佳提取溫度。

1.2.6 荊芥多糖制備的正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇提取時(shí)間、提取溫度、料液比為考察因素，各因素下設(shè)3個(gè)水平，按L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以荊芥多糖的提取率作為參考標(biāo)準(zhǔn)，確定荊芥多糖最佳水提條件。

1.2.7 菌種活化及培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)分別挑取青霉菌、酵母菌菌種劃線至馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)44～48 h，取出放冰箱冷藏待用。再分別將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h，取出放冰箱冷藏待用。

在超凈工作臺(tái)上，分別用接種環(huán)在5種菌的斜面培養(yǎng)基上各挑取5環(huán)菌，放置于相對(duì)應(yīng)的5瓶250 mL的液體培養(yǎng)基中，混勻，在相應(yīng)溫度下分別培養(yǎng)18～24 h和44～48 h，取出待用。

1.2.8 百合荊梨汁抑菌作用測(cè)定 采用濾紙片擴(kuò)散法[8,16]。將配置好的百合荊梨汁分別以0%，20%，40%，60%，80%，100%加入6支試管中，再將配置好的液體培養(yǎng)基分別以100%，80%，60%，40%，20%，0%依次加入相對(duì)應(yīng)的6支試管中，每支試管均有10 mL，依次做好標(biāo)記。把濾紙片用打孔器打成直徑為5 mm的圓片，制作充足數(shù)量，然后滅菌，把滅好菌的濾紙片置于各種抑菌劑溶液中，且每種溶液中的濾紙片為10片，浸泡12 h。無菌水為對(duì)照。

將1.2.7制備好的菌懸浮液各取0.2 mL分別均勻涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基的平皿中，制成含菌平板，同時(shí)將在各種濃度抑菌劑浸泡好的濾紙片置于含菌平板中，做好標(biāo)記，同時(shí)做3組平行試驗(yàn)。青霉菌和酵母菌菌懸液分別放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌菌懸液放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.9 荊芥汁對(duì)百合荊梨汁抑菌作用影響 采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果。分別取已配置好的100%百合荊梨汁、荊芥汁和百合雪梨汁10 mL放入試管中，把滅好菌的濾紙片置于以上各種液體中，浸泡12 h。無菌水為對(duì)照。將1.2.7制備好的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液各取0.2 mL分別均勻涂布牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平皿中，每個(gè)平板放置浸泡好的濾紙片，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在相同的條件下，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±誤差值表示，用SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SigmaPlot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制荊芥多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，吸光值隨葡萄糖含量的增加而增加，二者呈較好的正比例關(guān)系。通過統(tǒng)計(jì)分析獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=7.428 6X+0.098 6，R2=0.976 9。因此，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于試驗(yàn)中多糖含量的測(cè)定。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of glucose

2.2 荊芥多糖制備工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn) 由圖2(a)可知，荊芥水提法中的料液比對(duì)荊芥多糖的提取有明顯的影響，隨著料液比的增加，荊芥多糖的提取率先上升后下降。當(dāng)料液比為1∶10 (g/mL)時(shí)，提取率僅為(7.22±0.12)mg/g，當(dāng)料液比為1∶30 (g/mL)時(shí)，荊芥多糖的提取率達(dá)到最高(27.55±0.41)mg/g，之后隨著料液比的增加，荊芥多糖的提取率開始下降，但下降速度較慢。分析原因，可能是料液比大時(shí)，由于液體較少，溶出物較多，達(dá)到飽和后不再溶出，隨著液體的增加，多糖溶出率不斷提高。但當(dāng)料液比過高時(shí)，可能由于物料中其他物質(zhì)的溶出增多，并可能與多糖結(jié)合，影響了其原本的特性，使其測(cè)定含量微有下降。雖然在不同料液比的提取中，溶出物間不斷地相互作用，但在料液比為1∶30 (g/mL)時(shí)，可以測(cè)得其最大提取率，因此，以1∶30 (g/mL)為最佳料液比。

由圖2(b)可知，在提取溫度60 ℃、料液比1∶30 (g/mL)的條件下，荊芥多糖的提取率先隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，荊芥水提至2 h時(shí)，荊芥多糖提取率最高，為(29.20±0.41)mg/g。1，3 h時(shí)，荊芥多糖提取率分別為(25.30±0.36)，(27.90±0.39)mg/g，4 h荊芥多糖提取率繼續(xù)下降，4，5 h 時(shí)下降得很快。以上現(xiàn)象可能是由于隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖不斷溶出，2 h溶出達(dá)到最高后，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞或降解，從而呈下降趨勢(shì)[16]。

圖2 料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)荊芥多糖提取率的影響Figure 2 Effects of solid-liquid ratio,extraction time and extraction temperature on the extraction yield of Schizonepeta polysaccharide

由圖2(c)可知，在最佳料液比1∶30 (g/mL)、提取時(shí)間2 h下，隨著提取溫度的不斷升高，荊芥多糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。50 ℃時(shí)，荊芥多糖提取率為(25.80±0.29)mg/g。60 ℃時(shí)，荊芥多糖提取率為(29.35±0.37)mg/g。但提取溫度超過60 ℃時(shí)，荊芥多糖提取率逐漸下降。80 ℃時(shí)，多糖提取率迅速下降，可見荊芥多糖對(duì)提取溫度比較敏感，提取溫度較低時(shí)，可以增加植物細(xì)胞的通透性，促使多糖盡快溶出；提取溫度過高會(huì)破壞多糖中的某些化學(xué)鍵，改變其結(jié)構(gòu)，致使得率下降。因此，60 ℃為荊芥多糖提取的最佳溫度。

2.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定正交試驗(yàn)因素水平取值見表1。

由表2可以看出，各因素對(duì)水提法提取荊芥多糖提取率的大小影響順序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間>提取溫度，最佳提取條件為料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h。在最優(yōu)提取條件下，進(jìn)行荊芥多糖的提取，重復(fù)3次，取平均值，最后測(cè)得荊芥多糖提取率為(29.43±0.16)mg/g，低于文獻(xiàn)[9]報(bào)道的荊芥多糖提取率(18.25%)。這可能與試驗(yàn)原料及提取工藝有關(guān)。

2.3 荊芥汁對(duì)百合荊梨汁的抑菌能力

2.3.1 百合荊梨汁的抑菌能力 選擇細(xì)菌、霉菌和酵母菌3類菌中的常見5株菌作為試驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定了百合荊梨汁對(duì)其的抑菌效果。用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑(包括紙片直徑)，3次平行試驗(yàn)測(cè)量后取平均值，得出結(jié)果如表3所示。

表1 荊芥多糖制備的正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Levels and factors in orthogonal test of preparation of Schizonepeta polysaccharide

由表3可以看出，隨著百合荊梨汁體積分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)5種菌的抑菌效果均在不斷增強(qiáng)。尤其是當(dāng)百合荊梨汁體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，抑菌效果比較明顯，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到100%時(shí)，抑菌效果更好。表3中還顯示，同一體積分?jǐn)?shù)百合荊梨汁溶液對(duì)不同菌種的抑菌效果也不同。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)<80%時(shí)，同一體積分?jǐn)?shù)的百合荊梨汁對(duì)5種菌的抑菌比較差，差別也較小。但當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，百合荊梨汁仍然對(duì)青霉菌、酵母菌抑菌效果較差，但對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好。當(dāng)用100%百合荊梨汁進(jìn)行抑菌時(shí)，百合荊梨汁對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果增加得更多。可見，高體積分?jǐn)?shù)的百合荊梨汁對(duì)細(xì)菌的抑菌效果較好，對(duì)霉菌和酵母菌的抑菌效果較差。

2.3.2 荊芥多糖對(duì)百合荊梨汁的抑菌能力的影響 對(duì)比圖3～圖5可以看出，在相應(yīng)溫度下，培養(yǎng)相同時(shí)間后，測(cè)得的百合荊梨汁、荊芥多糖、百合梨汁細(xì)菌都有一定抑制作用，但百合梨汁大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果最差，百合荊梨汁的抑菌效果最強(qiáng)。因此可得，荊芥多糖的加入，增強(qiáng)了百合荊梨汁抑制細(xì)菌的能力。比較百合荊梨汁和荊芥多糖的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，百合荊梨汁的抑菌效果還是較強(qiáng)?？梢?，荊芥多糖和百合梨汁混合后，有增強(qiáng)混合果汁抑菌功效的作用，從而使混合物呈現(xiàn)出高于兩種原料的抑菌活性，而不是呈現(xiàn)介于二者之間的抑菌活性。

表2 水提法提取荊芥多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of water extraction of Schizonepeta polysaccharide

圖3 百合荊梨汁、百合雪梨汁和荊芥汁對(duì)大腸桿菌菌抑菌效果Figure 3 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Escherichia coli

圖4 百合荊梨汁、百合雪梨汁和荊芥汁對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果Figure 4 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Bacillus subtilis

圖5 百合荊梨汁、百合雪梨汁和荊芥汁對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果Figure 5 Inhibitory effect of the juice of Lily Schizonepeta Pear juice,Lily Pear juice and Schizonepeta juice on Staphylococcus aureus

3 結(jié)論

以荊芥多糖含量提取率為指標(biāo)，通過單因素正交試驗(yàn)對(duì)荊芥汁的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳制備工藝參數(shù)為：料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h。在最優(yōu)提取條件下，荊芥多糖提取率為(29.43±0.16)mg/g。與其他提取方法比較，此方法簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，且制備的提取液用于食品非常安全，可以直接應(yīng)用到各種食品中。抑菌試驗(yàn)表明，百合荊梨汁對(duì)青霉菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好抑制作用，但是對(duì)細(xì)菌的抑菌效果相對(duì)較好。進(jìn)一步比較分析荊芥汁、百合梨汁和百合荊梨汁的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)百合荊梨汁抑菌能力最強(qiáng)，荊芥汁的加入大大增強(qiáng)了百合荊梨汁抑菌能力。研究結(jié)果顯示，荊芥可以應(yīng)用到飲品中以增強(qiáng)其抑菌活性。后續(xù)可以繼續(xù)對(duì)荊芥多糖進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，研究其抑菌機(jī)理、抗氧化活性等，為荊芥多糖的深入研究及進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供更多依據(jù)。