糖組檢測(cè)在肝臟疾病診療中的應(yīng)用現(xiàn)狀與未來(lái)展望

王蕾，李維泉，陳力，陳萃英*

（1. 先思達(dá)生物科技有限公司，江蘇 南京 211800；2. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）

糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要形式，約70%的蛋白需要經(jīng)過(guò)糖基化修飾后，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜或分泌到細(xì)胞外行使功能。在真核生物中，蛋白上的糖鏈共價(jià)連接到天冬酰胺、蘇氨酸或絲氨酸殘基上，參與蛋白的翻譯后折疊和質(zhì)控[1]。此外，糖鏈還可以連接到脂質(zhì)分子上，甚至RNA上[2]。在多細(xì)胞生物中，糖鏈廣泛參與受精、發(fā)育、生長(zhǎng)、分化以及免疫等生命過(guò)程中[3]。

糖組泛指在特殊的時(shí)間、空間和環(huán)境下細(xì)胞和組織產(chǎn)生的所有糖鏈的集合[4]。對(duì)比基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的蓬勃發(fā)展，糖組研究受限于分析技術(shù)。近20年來(lái)，由于分析技術(shù)的突飛猛進(jìn)，糖組的研究也開(kāi)始進(jìn)入爆發(fā)期[5]。包括質(zhì)譜（MS）、毛細(xì)管電泳（CE）、高效液相色譜（HPLC）和凝聚素芯片等在內(nèi)的新技術(shù)，推動(dòng)了肝臟糖鏈新標(biāo)志物在疾病領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。

肝病診斷中仍然存在著許多挑戰(zhàn)。以肝癌為例，α-甲胎血清蛋白（AFP）仍然是臨床肝癌檢測(cè)最常用的血液標(biāo)志物，其特點(diǎn)在于特異度高（80% ~94%），而靈敏度有限（25% ~ 65%）。進(jìn)一步研究表明，AFP的糖基化物即AFP異質(zhì)體（AFP-L3）在肝細(xì)胞癌（HCC）患者血清中的改變更具特異性，也成為肝癌早期診斷的血清標(biāo)志物[6]。近年來(lái)，異常凝血酶原（PIVKA-II）也逐漸在肝癌的診斷中發(fā)揮作用，并與AFP在臨床使用中互補(bǔ)，但是其臨床效能需要進(jìn)一步驗(yàn)證[7-8]。指南上推薦的基于液體活檢方案的微小RNA（miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）技術(shù)作為潛在的肝癌標(biāo)志物[9-10]，其臨床使用受限于樣本量、檢測(cè)周期和成本等因素。

本篇綜述旨在總結(jié)肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，糖組作為標(biāo)志物在肝臟疾病的早期診斷、治療效果監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估中的潛力和最新進(jìn)展。

1 人血清中糖組的穩(wěn)定性

生理?xiàng)l件下，糖蛋白主要來(lái)源于肝臟與免疫細(xì)胞[11]。對(duì)血液中主要糖蛋白的定量和糖型分析顯示，血液中蛋白總量為70 ~ 75 g · L-1，其中非糖基化的白蛋白約為40 g · L-1。糖基化的蛋白中，免疫球蛋白（Ig）家族中Ig G在血清中平均能達(dá)到約12 g · L-1，Ig A和Ig M在血清中濃度約為4 g · L-1，Ig E和Ig D在血清中含量較低。除Ig之外，包括纖維蛋白原、結(jié)合珠蛋白、酸性糖蛋白和載脂蛋白等在內(nèi)的肝臟分泌蛋白約能占到14 g · L-1[11]。

糖鏈的合成、降解和轉(zhuǎn)運(yùn)，涉及到至少250種不同的糖基轉(zhuǎn)移酶參與其中，在基因和轉(zhuǎn)錄水平上都受到了嚴(yán)格的調(diào)控[12]。糖鏈合成相關(guān)基因或調(diào)控元件的突變，會(huì)導(dǎo)致一系列的先天性糖基化障礙綜合征，從而發(fā)生胚胎致死，或因嬰幼兒時(shí)期多系統(tǒng)的發(fā)育遲緩和多臟器功能衰竭導(dǎo)致的早夭。對(duì)患者血液及組織水平上的蛋白糖基化研究，均觀察到了糖基化的顯著變化[13]。

除了受遺傳因素導(dǎo)致的蛋白糖基化改變外，異常糖基化還與包括衰老、腫瘤、感染和自體免疫性疾病在內(nèi)的生理病理改變密切相關(guān)[14-15]。人群隊(duì)列的研究表明，糖基化水平與年齡、性別和疾病等生理因素相關(guān)，但不受血糖水平、飲食習(xí)慣、社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位等生理和非生理因素的影響[16]。個(gè)體水平上，血液中蛋白的糖基化水平穩(wěn)定[17]。以上研究，為糖鏈/糖組作為疾病的標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

2 肝臟疾病相關(guān)糖型

糖型與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，大量報(bào)道都觀察到了在肝病尤其是乙型肝炎病毒相關(guān)的肝癌患者組織和血清樣本中的特征糖型——巖藻糖、多分支、二平分N-乙酰葡糖胺、唾液酸等糖型的變化（見(jiàn)圖1）[6]。

圖 1 肝病相關(guān)糖型合成通路Figure 1 Synthetic pathway of live disease-related glycan

2.1 巖藻糖糖型

巖藻糖基化的改變是由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FUT）缺乏或過(guò)度表達(dá)所致，在肝病尤其是肝癌中，可觀察到核心巖藻糖基化和分支巖藻糖基化水平的升高。且基因組分析顯示，負(fù)責(zé)核心巖藻糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8的基因在HCC樣本中過(guò)度表達(dá)，與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝、肝硬化和肝癌患者的血清和肝組織中可觀察到蛋白過(guò)度核心巖藻糖基化[19-22]。在非酒精性脂肪肝患者中，巖藻糖基化的結(jié)合珠蛋白顯著升高，并與肝細(xì)胞的氣球樣變相關(guān)[19]。研究人員比較了健康對(duì)照組和肝硬化患者血漿中的Ig G蛋白和其他血清蛋白質(zhì)，均發(fā)現(xiàn)雙天線糖型、三天線糖型和四天線糖型的巖藻糖基化水平升高了約2倍[21]。巖藻糖基化N-聚糖，如核心α-1，6-巖藻糖基化三天線聚糖，在包括HCC在內(nèi)的晚期肝病患者的血清中顯著升高[22]。

巖藻糖基化的標(biāo)志物AFP-L3（即AFP上修飾了核心巖藻糖基化的糖型）在臨床實(shí)踐中展示了對(duì)早期肝癌的診斷效能[23-24]。在肝癌的組織病理樣本中，應(yīng)用N-糖基化的質(zhì)譜成像分析也觀察到了巖藻糖糖型的顯著升高，顯示其在肝癌診斷中的潛在價(jià)值[25]。

2.2 多分支糖型

與未患肝癌患者的樣本相比，研究人員在肝癌患者的組織以及血清樣本中也發(fā)現(xiàn)了高分支糖鏈的異常改變。多分支糖型的增加主要由N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶Ⅴ（N-acetylglucosaminyltransferase Ⅴ，GnT-Ⅴ）的上調(diào)引起[26]。

在嚴(yán)重的肝硬化患者中，研究人員觀察到α1-抗胰凝乳蛋白酶（AAT）的雙天線寡糖減少[27]。并且，在肝硬化和肝癌患者中，AFP和AAT蛋白均出現(xiàn)了多分支的聚糖變化[28]，以及四天線寡糖鏈水平的增加[29]。多分支糖型的改變同樣也在肝癌患者的組織病理樣本中被觀察到[25]。

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2.3 二平分N-乙酰葡糖胺糖型

二平分N-乙酰葡糖胺通過(guò)N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ（N-acetylglucosaminyltransferaseⅢ，GnT-Ⅲ）轉(zhuǎn)移到核心五糖β連接的甘露糖上。與健康人、肝炎和肝硬化患者相比，肝癌患者血清樣本中的GnT-Ⅲ活性顯著升高，并在有效治療后出現(xiàn)下降[30]。

肝纖維化向肝硬化進(jìn)展的過(guò)程中，MS和CE分析結(jié)果表明，除了巖藻糖基化的改變外，二平分N-乙酰葡糖胺糖型顯著增加[31]。并且，隨著肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，二平分N-乙酰葡糖胺糖型出現(xiàn)下降，但依然高于健康組和肝纖維化組[32]。在肝癌患者樣本中，GnT-Ⅲ和GnT-Ⅴ都會(huì)升高，在競(jìng)爭(zhēng)同一底物的過(guò)程中，GnT-Ⅲ的活性強(qiáng)于GnT-Ⅴ[33-35]。GnT-Ⅲ會(huì)一定程度上阻礙腫瘤的進(jìn)展，而GnT-Ⅴ則會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[36-37]。

2.4 唾液酸糖型

唾液酸的高表達(dá)，伴隨著肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。在肝病尤其是HCC患者的組織和血清中也觀察到了α-2，3-和α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的異常變化。與正常肝臟和肝硬化肝臟相比，肝癌組織中α-2，6-唾液酸顯著過(guò)度表達(dá)[38]。與肝硬化患者相比，早期HCC患者血清中對(duì)氧磷酶1異質(zhì)體的巖藻糖基化和唾液酸化水平顯著升高，表現(xiàn)出其在區(qū)分早期肝細(xì)胞癌和肝硬化患者中的潛力[39]。

3 血清糖組作為診斷標(biāo)志物的效能

血清糖組檢測(cè)是一種評(píng)估肝臟狀態(tài)的非侵入性方法。通過(guò)糖組標(biāo)志物的確定，建立相關(guān)的預(yù)測(cè)模型和方法，來(lái)預(yù)測(cè)和輔助診斷相關(guān)的疾?。òǜ卫w維化、肝硬化、肝癌），以及進(jìn)行肝移植的過(guò)程監(jiān)測(cè)。

3.1 肝纖維化診斷標(biāo)志物

肝纖維化是一個(gè)病理生理過(guò)程，多種致病因子會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生。對(duì)于乙型肝炎病毒感染引起的肝纖維化，由于病人體內(nèi)病毒長(zhǎng)期存在，不斷刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞受損、凋亡。

Kam等[40]利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDITOF）發(fā)現(xiàn)，N-糖組圖譜可作為乙型肝炎肝纖維化的診斷標(biāo)志物，在17個(gè)N-糖相關(guān)的標(biāo)志物中，通過(guò)線性回歸發(fā)現(xiàn)4個(gè)峰納入診斷模型，對(duì)于46例肝纖維化診斷的AUC達(dá)到0.912，靈敏度85%，特異度84%。隨后，Gui等[41]在173例乙型肝炎患者中，通過(guò)熒光CE技術(shù)獲得血清的N-糖組圖譜，發(fā)現(xiàn)N-糖鏈的變化與肝纖維化的分級(jí)顯著相關(guān)。該研究組用GlycoFibroTest算法獲得了診斷肝纖維化的AUC為0.740，略優(yōu)于肝纖四項(xiàng)（FibroTest）。同時(shí)，N-糖組圖譜對(duì)肝纖維化的診斷效能，在128例肝損傷病理結(jié)果確認(rèn)的樣本中得到了驗(yàn)證；且研究組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)N-糖組圖譜在區(qū)分纖維化不同階段方面的潛力[42]。此后，Cao等[43]基于423例乙型肝炎肝纖維化患者的N-糖組圖譜的分析結(jié)果，建立了多參數(shù)的診斷模型，對(duì)于肝纖維化F0-F1/F2/F3/F4的分期效能分別為0.917、0.720和0.785。

3.2 肝硬化診斷標(biāo)志物

乙型肝炎病毒感染后，肝臟經(jīng)歷損傷、產(chǎn)生纖維因子，使纖維母細(xì)胞合成膠原的作用增強(qiáng)，致使肝內(nèi)纖維組織不斷地增生，形成纖維包繞的異常肝細(xì)胞結(jié)節(jié)（假小葉），即形成肝硬化。

Callewaert等[31]基于熒光CE技術(shù)，分析丙型肝炎肝硬化病人的血清中蛋白糖組圖譜。該方法對(duì)于24例代償期肝硬化病例的靈敏度為79%，特異度為86%；對(duì)于24例失代償期肝硬化病例的診斷，達(dá)到了100%的靈敏度和特異度。與之一致，Kam等[40]利用MALDI-TOF獲得N-糖組圖譜，對(duì)46例乙型肝炎肝硬化診斷的AUC達(dá)到0.911，靈敏度88%，特異度83%。

3.3 肝癌的診斷標(biāo)志物

由乙型肝炎病毒所引發(fā)的肝炎、肝硬化、肝癌被眾多醫(yī)者比喻為肝癌“三部曲”。我國(guó)的肝癌患者約90%與慢性乙型肝炎病毒感染有關(guān)。85% ~ 95%的肝癌發(fā)生在肝硬化基礎(chǔ)上。

陳萃英研究組發(fā)現(xiàn)，與乙型肝炎肝硬化患者相比，乙型肝炎肝癌患者血清中的α-1，3-巖藻糖基化三天線寡糖增加，而二平分的核心α-1，6-巖藻糖基化二天線寡糖降低。針對(duì)這2個(gè)標(biāo)志物建立的分析預(yù)測(cè)模型GlycoHCCTest對(duì)HCC患者的診斷準(zhǔn)確率為81%，優(yōu)于常規(guī)的AFP檢測(cè)（對(duì)HCC患者的診斷準(zhǔn)確率為50% ~ 60%）[32]。與此一致，Comunale等[44]報(bào)道了總血清的聚糖分析方法，其區(qū)分乙型肝炎肝硬化和乙型肝炎肝癌的AUC為0.851，靈敏度為73%，特異性為88%。并且，總血清聚糖分析方法與AFP檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)乙型肝炎肝癌的靈敏度在90%的特異性下可提高到95%。此后，Cong等[45]通過(guò)血清糖組中3個(gè)特征糖峰，建立了早癌預(yù)測(cè)模型Glycomics-EHCC。在247例患者中，該模型在臨界值為-0.39時(shí)，區(qū)分早期HCC與肝纖維化/肝硬化的靈敏度為84.6%，特異性為85.0%。此外，在67例早期HCC患者確診前6和12個(gè)月的樣本中，該模型預(yù)測(cè)早期HCC的靈敏度和特異性分別超過(guò)90%和85%。

3.4 肝移植過(guò)程的監(jiān)測(cè)

肝臟移植是終末肝病的最終治療手段，移植成功后的病人生存率較長(zhǎng)。對(duì)于移植手術(shù)，移植肝臟的狀態(tài)直接影響移植結(jié)局。在一項(xiàng)肝臟移植手術(shù)中，研究人員前瞻性地對(duì)肝臟灌洗液進(jìn)行糖組檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝失能病例中出現(xiàn)特征的去唾液酸無(wú)半乳糖核心巖藻糖基化二天線N-聚糖，與移植的結(jié)局完全相符[46]，提示糖組檢測(cè)在肝移植過(guò)程監(jiān)測(cè)中的潛力。

4 糖組檢測(cè)方法

檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，為糖組在各種疾?。ㄌ貏e是肝臟疾?。╊I(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的支撐。從糖蛋白上釋放的糖鏈/糖組，可通過(guò)質(zhì)譜（成像）、高效液相色譜和CE等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行直接分離和分析，或使用凝聚素芯片進(jìn)行間接檢測(cè)。

質(zhì)譜技術(shù)基于物質(zhì)質(zhì)荷比，對(duì)分子進(jìn)行直接解析，在疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中占有重要的位置。2010年后，質(zhì)譜技術(shù)在糖肽和糖鏈分析中的顯著進(jìn)步，推動(dòng)了該技術(shù)在糖蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)中的應(yīng)用[47-48]。質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度、高覆蓋率和高分辨等優(yōu)勢(shì)。但是，設(shè)備、專業(yè)分析人員、復(fù)雜樣本預(yù)處理及結(jié)果穩(wěn)定性不佳等方面的因素，制約了質(zhì)譜技術(shù)在臨床中的大規(guī)模應(yīng)用[49]?；谫|(zhì)譜技術(shù)的質(zhì)譜成像技術(shù)，在包括肝癌在內(nèi)的腫瘤診斷中展現(xiàn)了巨大的價(jià)值[25]。質(zhì)譜成像技術(shù)在病理切片樣本分析中的應(yīng)用，展現(xiàn)了其無(wú)需標(biāo)記、高靈敏和可反映分子的空間分布等優(yōu)勢(shì)。在未來(lái)的臨床應(yīng)用中，高昂的平臺(tái)建設(shè)和復(fù)雜的前處理過(guò)程仍是需要解決的問(wèn)題。高效液相色譜具有優(yōu)越的分離功能，常與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，可將靈敏度提高至納克水平[50]。而單獨(dú)使用高效液相色譜時(shí)，仍需要對(duì)樣本進(jìn)行相應(yīng)前處理來(lái)獲得高質(zhì)量的結(jié)果。

臨床應(yīng)用場(chǎng)景中，操作簡(jiǎn)單、靈敏、可靠和高通量是決定檢測(cè)能否大規(guī)模使用的先決條件。CE是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，分離不同構(gòu)型糖鏈的方法。只需微量樣本，無(wú)需樣本預(yù)處理，即可對(duì)樣本進(jìn)行高靈敏和高分辨率的檢測(cè)，且每次上機(jī)可以達(dá)到96個(gè)樣品的檢測(cè)通量[51]。

凝集素芯片是間接的糖組檢測(cè)方法，該方法系通過(guò)凝集素對(duì)特定寡糖結(jié)構(gòu)、糖鍵和糖型的識(shí)別，檢測(cè)樣本間的糖組差異。對(duì)于各種天然/重組的凝集素的高需求、糖芯片定制的復(fù)雜性，以及特異度不高等因素，限制了該方法在臨床應(yīng)用過(guò)程中的推廣[52]。

以上糖組檢測(cè)技術(shù)的方法、檢測(cè)原理、優(yōu)勢(shì)和現(xiàn)存問(wèn)題如表1所示。CE技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、無(wú)需樣本前處理、只需微量樣本、高靈敏等特性，目前正在臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中[53]。質(zhì)譜（成像）、高效液相色譜和凝集素芯片技術(shù)則廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究中。在未來(lái)的技術(shù)發(fā)展過(guò)程中，降低儀器成本、簡(jiǎn)化樣本預(yù)處理過(guò)程、提高樣本處理和分析自動(dòng)化水平是糖組檢測(cè)技術(shù)的主要發(fā)展方向。

表 1 糖組檢測(cè)技術(shù)匯總Table 1 Glycome test techniques

5 結(jié)語(yǔ)與展望

在生理和病理過(guò)程中，糖鏈均發(fā)揮著重要的作用。糖鏈結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，與肝病尤其是肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近幾十年的研究表明，血清糖組在肝纖維化、肝硬化和肝癌的診斷和預(yù)后中具有巨大潛力。

未來(lái)，血清糖組的臨床數(shù)據(jù)和進(jìn)入臨床后的隨訪數(shù)據(jù)，將更清晰地為其在臨床病人管理、診斷、治療和預(yù)后中提供方向。此外，在肝癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，特征糖鏈的生物學(xué)意義將會(huì)得到闡明，為疾病的干預(yù)提供新的手段。

感染乙型肝炎病毒后，部分患者會(huì)經(jīng)歷肝炎、肝硬化，甚至肝癌的病程階段，需要終身隨訪和管理。如何對(duì)肝病進(jìn)行全周期的管理，是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。結(jié)合現(xiàn)有的臨床診斷和干預(yù)手段，我們也對(duì)肝病糖組寄以厚望，相信它能為臨床的決策提供新的信息和手段。