醋 桿 菌 研 究 進 展 及 其 應(yīng) 用 前 景

■陳霈瑤 鄭 鋼 童雨翠 劉夢瑤 程 強 張日俊*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳資源與分子育種實驗室，北京 100193）

醋舊稱醯、苦酒等，是烹飪中常用的液體酸味調(diào)味料。醋既能夠去腥解膩還能增加菜肴的鮮味和香味，在食材加熱過程中加入適量的醋，還能夠減少維生素的損失，促使食材中的鈣質(zhì)分解，更易被人體吸收[1]。釀造醋以中國、日本、韓國為主的東亞地區(qū)主要采用多菌種固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中由于多種微生物共同代謝產(chǎn)生了大量的有機酸、氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等[2]，賦予固態(tài)釀造食醋豐富的口感，而歐美等大部分國家主要采用液態(tài)深層發(fā)酵工藝[3]。液態(tài)發(fā)酵食醋由于采用純菌發(fā)酵，相較于固態(tài)發(fā)酵食醋，其風(fēng)味物質(zhì)比較單一。

食醋釀造中的產(chǎn)酸微生物種類繁多，發(fā)酵過程中的主要細菌為醋桿菌屬（Acetobactersp.）、乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobactersp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）、黃桿菌屬（Flavobacteriumsp.）[4]，真菌為酵母菌屬（Saceharomycetaceaesp.）和曲霉菌（Aspergillussp.）[5]。醋桿菌和乳桿菌是發(fā)酵過程中最主要的微生物。醋桿菌可在乙酸發(fā)酵階段將大量的乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，提高產(chǎn)酸量及出醋率，因此成為研究熱點。國內(nèi)外有關(guān)醋桿菌的研究主要集中于新型醋桿菌菌種的分離與選育[6]；以不同原料為底物的乙酸發(fā)酵工藝優(yōu)化，包括新型果醋、糧醋等的開發(fā)等[7]；傳統(tǒng)食醋釀造過程中菌群多樣性分析以及醋桿菌耐酸機理的探索[4]等方面。

因此文章綜述了醋桿菌的生物學(xué)特性，并闡述了醋桿菌獨特的耐乙酸機制以及醋桿菌的應(yīng)用，以期為篩選具有耐酸耐乙醇的益生菌，以及利用醋桿菌特殊機制和有益代謝產(chǎn)物在畜牧生產(chǎn)中發(fā)揮作用提供新的思路。

1 醋桿菌的生物學(xué)特性

1.1 醋桿菌的定義及分類

醋桿菌是α-變形菌綱（α-Proteobacteria）、紅螺菌目（Rhodospirillales）中的一類革蘭氏陰性的專性好氧型細菌，廣泛分布于各種自然場所，包括發(fā)酵食品、腐敗植物、腐敗動物和土壤中，細胞呈桿狀或者橢圓狀，通常單個存在，也可成對成鏈，不形成芽孢，部分菌株能夠產(chǎn)生色素和纖維素，分為運動型和非運動型，運動型有周生鞭毛或者極生鞭毛，醋桿菌包括醋桿菌屬和葡糖桿菌屬等。醋桿菌屬種類繁多，加上未分類的醋桿菌有36 種被NCBI 收錄，包括東方醋桿菌（Acetobacter orientalis）[8]、釀酒醋桿菌（Acetobacter cerevisiae）[9]、木瓜醋桿菌（Acetobacter papayae）[10]、米醋醋桿菌（Acetobacter oryzoeni）[11]、攀膜醋桿菌（Acetobacter ascendens）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）等，醋酸桿菌屬能夠?qū)⒁宜岷腿樗岽x成CO2和H2O[12]。葡糖桿菌為周生鞭毛、可運動或無運動性的細菌種群，在乙醇、葡萄糖或醋酸鹽作為碳源時生長最佳，如Ga.oboediens菌株能在含30%葡萄糖的培養(yǎng)基上生長，并積累高濃度的葡萄糖酸[13]，可超氧化乙醇為CO2和H2O，培養(yǎng)基中醋酸鹽的濃度決定能否將醋酸鹽轉(zhuǎn)化為CO2和H2O。

1.2 醋桿菌的代謝途徑

醋桿菌的主要代謝途徑包括乙醇氧化呼吸、三羧酸循環(huán)（TCA）、丙酮酸代謝途徑。其中醋桿菌代謝的最大特征是在有氧條件下能將乙醇氧化為乙酸[14]。醋桿菌具有氧化乙酸的能力，稱為過氧化反應(yīng)，主要是靠三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)來完成。這種過氧化反應(yīng)與乙醇、乙酸、氧氣含量等有關(guān)。醋酸發(fā)酵過程首先通過醇脫氫酶（ADH）將乙醇氧化為乙醛，然后由醛脫氫酶（ALDH）將乙醛再氧化為乙酸，最終實現(xiàn)食醋釀造[15]。

1.3 醋桿菌的乙醇耐受性

醋桿菌生長過程中能夠利用乙醇，因此在選擇菌株時，需要考慮其乙醇耐受性。劉陽等[16]于2018年從保寧醋醋曲中篩選出4株醋桿菌，其在2%～9%的乙醇中均能生長，其中，菌株A11能夠達到13%的乙醇耐受力。王超宇[17]從山西老陳醋中篩選的CP 175、CP 40、CP 416菌株對乙醇的耐受能力較好，可耐受的乙醇度值為10%。

然而乙醇濃度過高會抑制菌株的生長，大大降低乙醇的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)酸的速率。有研究發(fā)現(xiàn)，使用5%(V/V)乙醇和3%(W/V)乙酸和菌株預(yù)培養(yǎng)后，約有87.3%的菌株呼吸鏈沒有受到乙醇的損傷，但有41.6%的菌株其細胞膜的完整性受到了破壞[18]。利用基因芯片技術(shù)對醋桿菌三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)等有關(guān)基因的表達水平進行測定，發(fā)現(xiàn)以乙醇為碳源時，與乙醛酸有關(guān)的基因和應(yīng)急反應(yīng)(SOS)有關(guān)基因表達上調(diào)，因此，乙醇可能引起菌體內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷[19]。

面對乙醇引起的損傷，微生物主要通過同源適應(yīng)（Homeovicous Adaptation）機制和膜脂中脂肪酸的異構(gòu)化來實現(xiàn)細胞對有機溶劑的抗性，微生物通過調(diào)整膜中脂肪酸的飽和度和脂酞基的長度來維持膜原有的流動性，在有機溶劑存在的情況下，微生物可非常迅速地改變順式脂肪酸和反式脂肪酸的比例來對抗細胞膜通透性的增加[20]。

2 醋桿菌的耐酸機制

2.1 耐酸機制分子基礎(chǔ)

以通過誘變獲得的乙酸敏感突變株作為宿主，通過克隆獲得具有乙酸抗性的DNA 片段，發(fā)現(xiàn)其中大小為8.3 kb的PstⅠ片段與乙酸抗性有關(guān)，其中AarA、AarB、AarC是乙酸抗性基因。1.6 kb 的SphⅠ片段存在AarA基因，它具有一個單獨的開放閱讀框區(qū)域，與大腸桿菌的檸檬酸合酶基因序列（Citrate Synthases，CSs）具有64.3%的相似性[21]，與銅綠假單胞菌的CSs具有67.8%的相似性[22]，且分子大小和AarA基因的產(chǎn)物相似，因此AarA基因可能編碼CSs[23]。AarC能夠編碼含492 個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，與Neurospora crassa acu-8 基因具有44%的同源性，其編碼的蛋白具有乙酸氧化的功能，是一種羧酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶[24]。

醋桿菌細胞破碎上清的雙向凝膠電泳分析表明，上清部分存在幾種蛋白質(zhì)，它們的產(chǎn)量對乙酸的產(chǎn)生有不同程度的促進作用，其中一種表觀分子量為100 ku 的蛋白質(zhì)在乙酸作用下顯著增加，經(jīng)—NH2末端氨基酸序列測定和隨后的基因克隆鑒定為烏頭酸酶[25]，過表達烏頭酸酶基因，可以提高酶的活性和菌體的抗乙酸能力，并且可以縮短發(fā)酵周期。

2.2 耐酸調(diào)節(jié)通路

2.2.1 質(zhì)子動力外排泵（見圖1）

圖1 乙酸吸收示意圖[26]

因為醋桿菌優(yōu)異的耐酸特性，學(xué)者們推測在細胞質(zhì)膜上可能存在一個外排泵，能夠?qū)⒁宜釓募毎|(zhì)中外排出細胞質(zhì)膜，但是早期通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究的醋桿菌與乙酸適應(yīng)性相關(guān)的50 多種蛋白質(zhì)中，沒有發(fā)現(xiàn)某種蛋白質(zhì)是期待的外排蛋白，通過ISO（Inside-out）膜囊模型模擬醋桿菌質(zhì)子動力外排泵，發(fā)現(xiàn)醋桿菌能通過呼吸作用產(chǎn)生質(zhì)子動力，ISO 膜囊內(nèi)部為陽性和酸性（見圖1a）。在完整的細胞中，呼吸作用通過ADH 和、乙醛脫氫酶（ALDH）將乙醇氧化為乙酸，同時給氧化酶（terminal ubiquinol oxidase）提供電子，乙酸被外排泵被動穿過細胞膜排出（見圖1b）。

2.2.2 檸檬酸循環(huán)（見圖2）

圖2 醋桿菌檸檬酸循環(huán)[乙酸激酶（AckA）、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta）、乙酰輔酶A合成酶（Acs）]

有研究發(fā)現(xiàn)，醋桿菌含有完整但是非傳統(tǒng)意義上的檸檬酸循環(huán)，其中乙酸抗性蛋白（AarC）將琥珀酰輔酶A 和乙酸酯轉(zhuǎn)化為琥珀酸輔酶A 和乙酰輔酶A（見圖2）[27]，促進了乙酸的代謝活化和氧化，醋桿菌檸檬酸循環(huán)（CAC）將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為CO2，這是醋桿菌菌株特有的能力，乙酸乙酯到乙酰輔酶A的有效轉(zhuǎn)化是必要條件，這可以通過AckA/Pta 或Acs 來執(zhí)行，乙酸酯氧化過程中上述三種酶活性均增強[28]。

3 醋桿菌的應(yīng)用

3.1 醋桿菌工業(yè)應(yīng)用

核黃素被大量用作食品和飼料添加劑、食品著色劑和藥物制劑，這種維生素的商業(yè)化生產(chǎn)可以通過化學(xué)合成或生物合成來完成。通過對一株葡糖醋桿菌FBFS97的全基因組測序[29]，結(jié)果表明該菌株具有核黃素產(chǎn)生的完整操縱子，通過響應(yīng)面優(yōu)化法和中心組設(shè)計優(yōu)化了該菌株的培養(yǎng)基組分，核黃素產(chǎn)量達到23.24 mg/L，因此，其他醋桿菌可能也具有生產(chǎn)核黃素的潛能。

纖維素是地球上含量最豐富的生物聚合物，被認為是植物生物量的主要組成部分，也是細菌胞外聚合物的代表，植物纖維具有木質(zhì)素、果膠、半纖維素和植酸等，導(dǎo)致回收困難且價格昂貴[30]，細菌合成纖維素提供了一種更具成本效益的供應(yīng)方式。細菌纖維素形成獨特的織態(tài)結(jié)構(gòu), 并因“納米效應(yīng)”而具有高吸水性和高保水性、對液體和氣體的高透過率、高濕態(tài)強度，尤其在濕態(tài)下可原位加工成型等特性，可以應(yīng)用于醫(yī)療業(yè)、食品行業(yè)、造紙業(yè)等。研究發(fā)現(xiàn)，番茄汁是鑒定巴氏醋桿菌生產(chǎn)細菌纖維素的有效培養(yǎng)基[31]，對10 L生產(chǎn)培養(yǎng)基的放大工藝進行了優(yōu)化，細菌纖維素的最高產(chǎn)量達到7.8 g/L，并且純度較高，木醋桿菌TISTR 967也被用于細菌纖維素的生產(chǎn)[32]，對醋桿菌V6生產(chǎn)細菌纖維素的培養(yǎng)基成分進行研究，顯示甘油可以成為醋桿菌屬細菌生產(chǎn)細菌纖維素的低成本底物[33]。

D-葡萄糖酸是一種無腐蝕性、不揮發(fā)、無毒、溫和的有機酸，是水果、植物、葡萄酒和蜂蜜的天然成分，具有清新的酸味。它被歐盟食品安全局（EFSA）列為公認的食品添加劑(E574)，并被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）列為GRAS（公認為安全）添加，D-葡萄糖酸可以通過化學(xué)方法或純化酶通過酶法生產(chǎn)，最常見的合成方法是氧化發(fā)酵。在醋桿菌中，D-葡萄糖酸可以通過兩條不同的途徑合成。用醋桿菌發(fā)酵草莓濃縮液中的D-果糖，可以實現(xiàn)D-葡萄糖向D-葡萄糖酸的選擇性轉(zhuǎn)化[34]。

3.2 醋桿菌畜牧生產(chǎn)應(yīng)用

在畜牧方面，醋桿菌常和芽孢桿菌、酵母菌、乳酸桿菌等混合制備成為混合制劑。在蛋雞產(chǎn)蛋后期的全價料中添加適量復(fù)合生物菌，可提高產(chǎn)蛋率及平均蛋重[35]，初生仔豬補給復(fù)合生物菌，可幫助仔豬迅速建立完善的腸道正常菌群，提高機體免疫力，維護仔豬自然健康狀態(tài)[36]。葡糖醋桿菌重氮營養(yǎng)菌是革蘭氏陰性菌、耐酸專性需氧菌具有固氮能力，對于農(nóng)作物氮的利用有著舉足輕重的作用，研究表明[37]葡糖醋桿菌對所施的氮肥具有固氮效果并且能夠提高玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，在飼料原料的種植過程中利用醋桿菌的固氮作用能夠有效提高飼料經(jīng)濟效益，減少成本。

4 結(jié)論

醋桿菌都是產(chǎn)生食醋的主要菌種，從第一株醋桿菌被發(fā)現(xiàn)以來，篩選獲得的醋桿菌數(shù)量急劇增加，種屬得到極大擴展，其生物學(xué)功能也越來越豐富，其特殊的耐酸機制受到了學(xué)者們的關(guān)注，近年來相關(guān)研究主要集中在耐酸機制相關(guān)的基因、通路等方面，并通過誘變等方法獲得能夠耐高濃度酸的新型菌株。在醋桿菌的全基因組分析中，也發(fā)現(xiàn)具有應(yīng)用前景的代謝通路（如核黃素、細菌纖維素的產(chǎn)生）。醋桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物推測可以調(diào)節(jié)腸道菌群，此外，因乙酸制品具有殺滅病原微生物的作用，因此篩選耐酸產(chǎn)乙酸的醋桿菌，其在畜牧生產(chǎn)中的消殺作用和益生作用也是一個極具潛力的研究方向。