發(fā)酵米糠水提物的抗氧化活性研究

■董琛琳 劉 娜 王 園 宋 敏 王瑞芳 楊艷平 安曉萍 齊景偉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

米糠（rice bran），稻谷加工的主要副產(chǎn)品，由種皮、果皮、糊粉層和珠心層組成[1]，占稻谷總重量的5%～8%[2]。稻谷是全球產(chǎn)量最高的糧食作物之一[3]，而米糠作為其副產(chǎn)物，產(chǎn)量也極為豐富，但利用率卻很低。國(guó)際相關(guān)組織把米糠列為未充分利用的天然原材料之一[4]。米糠中除糖類、脂肪、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有大量多酚、黃酮、蛋白等天然抗氧化劑和功能性物質(zhì)，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義。如提高雞的產(chǎn)蛋量[5]、促進(jìn)寧鄉(xiāng)豬的小腸絨毛發(fā)育，提高其生長(zhǎng)性能[6]、提高肉牛的平均日增重[7]等。

微生物發(fā)酵是指在有氧或無(wú)氧條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的過(guò)程，微生物發(fā)酵不僅能促進(jìn)許多功能性物質(zhì)的釋放，而且還能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖[8]。用微生物來(lái)發(fā)酵飼料原料不僅可以降低、消除飼料原料中的有毒有害物質(zhì)、抗?fàn)I養(yǎng)因子，還可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用、補(bǔ)充有益微生物、調(diào)控宿主腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體免疫力等[9]。微生物發(fā)酵可以改變米糠中的活性成分含量，從而改善米糠穩(wěn)定性差、易哈變的特質(zhì)[10]。水提是一種較為便捷且成本較低的提取方法[11]。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一種較穩(wěn)定的自由基，其乙醇水溶液呈較深的紫色，而樣品中的抗氧化物質(zhì)可將其清除從而使紫色變淺，所以可根據(jù)其吸光度值減少的程度來(lái)判斷樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱，是一種簡(jiǎn)單快速的測(cè)定方法[12]。本試驗(yàn)以DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，優(yōu)化了發(fā)酵米糠水提物的提取時(shí)間、提取溫度和料水比，并對(duì)其活性成分以及體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，為米糠深加工提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠、麩皮、腐植酸鈉、博善菌均購(gòu)于市場(chǎng)；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、DPPH、水楊酸鈉、瓊脂糖等均為分析純；葡聚糖酶購(gòu)于濟(jì)南諾能生物工程有限公司；Bradford 試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所；pBRR322 質(zhì)粒DNA 購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司；5xTBE Buffer購(gòu)于北京酷來(lái)搏科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵米糠的制備

在發(fā)酵袋中加入80%的米糠原料和20%的麩皮輔料，加入0.5%的腐植酸鈉，再添加葡聚糖酶2 000 U，接種博善菌5‰，添加50%的蒸餾水，攪拌均勻，然后封口，排出發(fā)酵袋中的氣體，在28 ℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h。

1.2.2 發(fā)酵米糠水提物的制備

根據(jù)1.2.1 制備出發(fā)酵米糠。以DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵米糠水提物的提取時(shí)間、提取溫度和料水比。

1.2.2.1 提取時(shí)間

稱取1 g發(fā)酵米糠樣品和20 mL蒸餾水，在80 ℃水浴鍋中分別浸提0、20、40、60、80 min，冷卻后5 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，稀釋8倍作為樣液待測(cè)。

1.2.2.2 提取溫度

稱取1 g 發(fā)酵米糠樣品和20 mL 蒸餾水，分別在70、75、80、85、90 ℃水浴鍋中浸提60 min，冷卻后5 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，稀釋8 倍作為樣液待測(cè)。

1.2.2.3 料水比

稱取1 g 發(fā)酵米糠樣品，分別添加10、15、20、25、30 mL 蒸餾水，在85 ℃水浴鍋中浸提60 min，冷卻后5 000 r/min離心15 min，吸取上清液，稀釋8倍作為樣液待測(cè)。

1.2.2.4 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照Musa[13]的方法略做修改。吸取樣液1 mL，加1 mL DPPH應(yīng)用液，混勻靜置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度A1；用蒸餾水代替樣液測(cè)定吸光度A2；用95%乙醇代替DPPH應(yīng)用液測(cè)定吸光度A3。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A1-A3）/A2]×100

1.2.3 發(fā)酵米糠水提物活性成分含量測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[14]；多酚含量的測(cè)定采用任雪榮等[15]的方法；黃酮含量的測(cè)定采用傅杰[16]的方法；蛋白含量的測(cè)定采用Bradford試劑盒；具體方法參照說(shuō)明書(shū)，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算其含量。

1.2.4 發(fā)酵米糠水提物的體外抗氧化活性分析

1.2.4.1 羥基自由基清除能力

參考Rajauria 等[17]的方法略做修改。吸取樣液0.5 mL，加入0.5 mL（9.0 mmol/L）硫酸亞鐵溶液和0.5 mL（8.8 mmol/L）過(guò)氧化氫溶液，室溫反應(yīng)10 min后，加入0.5 mL（9.0 mmol/L）水楊酸乙醇溶液，室溫反應(yīng)30 min 后，在510 nm 處測(cè)吸光度A1。用蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液重復(fù)上述步驟測(cè)吸光度A2，用蒸餾水代替樣液重復(fù)上述步驟測(cè)吸光度A3。

羥基自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A3]×100

1.2.4.2 還原力

1.2.4.3 DNA損傷保護(hù)

參考張溢等[19]的方法略做修改，采用瓊脂糖凝膠電泳法研究發(fā)酵米糠水提物對(duì)質(zhì)粒DNA 氧化損傷的保護(hù)作用。精密量取1 μL pBR322DNA（0.1 μg/μL），2 μL發(fā)酵米糠水提物的水溶液加入離心管中，混合均勻后再加入30%過(guò)氧化氫2 μL，反應(yīng)總體積為5 μL。在超凈臺(tái)中紫外線照射15 min，室溫靜置20 min。結(jié)束后，加入6×Loading Buffer 2.5 μL，混勻后點(diǎn)樣于0.5%瓊脂糖凝膠，110 V 電壓下電泳，40 min 后停止電泳。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Fluor Chem分析軟件進(jìn)行處理。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.2 單因素方差分析（one-way ANOVA），并用Duncan’s 法對(duì)各組間進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 不同提取條件下發(fā)酵米糠水提物的DPPH清除力

2.1.1 提取時(shí)間（見(jiàn)圖1）

圖1 提取時(shí)間對(duì)發(fā)酵米糠水提物抗氧化活性的影響

提取時(shí)間對(duì)發(fā)酵米糠水提物抗氧化活性的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著提取時(shí)間的增加，發(fā)酵米糠水提物的DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，其中提取時(shí)間為60 min 時(shí)，發(fā)酵米糠水提物的DPPH 自由基清除率最高且顯著高于其他組（P＜0.05）；提取時(shí)間為20、40、80 min時(shí)，發(fā)酵米糠水提物的DPPH 自由基清除率差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于0 min 組（P＜0.05）。原因可能在于，未提取或提取時(shí)間過(guò)短時(shí)，發(fā)酵米糠中的活性物質(zhì)未充分釋放出來(lái)，發(fā)酵米糠抗氧化活性較低。提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，發(fā)酵米糠抗氧化活性也較低，是因?yàn)殡S著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，釋放出來(lái)的活性物質(zhì)被破壞[20]。綜上所述，80 ℃水浴浸提時(shí)，60 min為發(fā)酵米糠水提物的最佳水提時(shí)間。

2.1.2 提取溫度（見(jiàn)圖2）

提取溫度對(duì)發(fā)酵米糠水提物抗氧化活性的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，發(fā)酵米糠水提物的DPPH自由基清除率隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)；其中提取溫度為85 ℃時(shí)，發(fā)酵米糠水提物的DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值，且顯著高于70、75、80 ℃組（P＜0.05），但與90 ℃組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。原因可能在于提取溫度主要通過(guò)影響活性物質(zhì)的釋放速度來(lái)影響發(fā)酵米糠的抗氧化活性。提取溫度較低時(shí)，分子的活動(dòng)較弱，活性物質(zhì)釋放得較慢。提取溫度較高時(shí)，活性物質(zhì)變性而被破壞了[21]。由此可得，85 ℃為發(fā)酵米糠水提物的最佳水提溫度。

圖2 提取溫度對(duì)發(fā)酵米糠水提物抗氧化活性的影響

2.1.3 料水比（見(jiàn)圖3）

曾有人問(wèn)任正非，華為成功的關(guān)鍵是什么？“還是財(cái)務(wù)體系和人力資源體系?！比握堑倪@個(gè)回答被看作是對(duì)孟晚舟的極大肯定。

圖3 料水比對(duì)發(fā)酵米糠水提物抗氧化活性的影響

料水比對(duì)發(fā)酵米糠水提物抗氧化活性的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，發(fā)酵米糠水提物的DPPH自由基清除率隨著料水比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；在料水比為1∶30（g/mL）時(shí)，發(fā)酵米糠水提物的DPPH自由基清除率最低，且顯著低于其他組；在料水比為1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）和1∶25（g/mL）時(shí)，各組無(wú)顯著差異（P＞0.05），但在1∶20（g/mL）時(shí)，發(fā)酵米糠水提物的DPPH自由基清除率達(dá)到最高。原因可能在于水作為一種溶劑，在其體積不斷增加的過(guò)程中，水的傳質(zhì)動(dòng)力增大，從而導(dǎo)致傳質(zhì)效率也增大，使得發(fā)酵米糠水提物的DPPH 自由基清除率增大。隨著料水比不斷增加，其清除率開(kāi)始下降，可能是水體積的增加致使傳質(zhì)擴(kuò)散達(dá)到一種過(guò)飽和穩(wěn)定狀態(tài)[22]。綜上所述，料水比為1∶20（g/mL）為發(fā)酵米糠水提物的最佳料水比。

綜上所述，確定發(fā)酵米糠水提物提取時(shí)間為60 min，提取溫度為85 ℃，料水比為1∶20（g/mL）。此時(shí)其DPPH自由基清除率可達(dá)85.55%，較原料提高了52.63%。因此，發(fā)酵可明顯提高米糠的抗氧化活性，這與其活性成分在發(fā)酵過(guò)程中得到了大量釋放有關(guān)。

2.2 發(fā)酵米糠水提物活性成分分析（見(jiàn)表1）

表1 發(fā)酵米糠水提物活性物質(zhì)含量（n=3）

由表1可知，與米糠水提物（RBE）相比，發(fā)酵米糠水提物中多酚、黃酮、蛋白均顯著增加（P＜0.05），且分別增加了68.16%、80.31%、28.92%。原因可能在于在米糠發(fā)酵過(guò)程中，米糠中葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)成分被微生物所利用了，從而導(dǎo)致米糠中的其他活性物質(zhì)被釋放出來(lái)，而這些活性物質(zhì)的增加可能就是發(fā)酵米糠抗氧化活性增加的原因[23]。

2.3 發(fā)酵米糠水提物的體外抗氧化活性分析

2.3.1 羥基自由基清除能力（見(jiàn)圖4）

圖4 不同濃度米糠水提物和發(fā)酵米糠水提物羥基自由基清除率

羥基自由基被認(rèn)為是最活潑最有害的氧自由基，其可穿過(guò)細(xì)胞膜，從而損傷核生物大分子，導(dǎo)致組織產(chǎn)生氧化損傷[24]。不同濃度米糠水提物和發(fā)酵米糠水提物羥基自由基清除率見(jiàn)圖4，由圖4可知，同一濃度下，發(fā)酵米糠水提物羥基自由基清除率顯著高于米糠水提物（P＜0.05），且顯著高于標(biāo)準(zhǔn)品（BHA）（P＜0.05）；當(dāng)濃度為4 mg/mL 時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)羥基自由基清除率為33.69%，而發(fā)酵米糠水提物可達(dá)到78.58%。原因可能在于發(fā)酵有利于活性成分的釋放，使其更容易和羥基自由基反應(yīng)，因此發(fā)酵米糠水提物具有較高羥基自由基清除能力[25]。

2.3.2 還原力（見(jiàn)圖5）

衡量一種抗氧化物質(zhì)是否可以高效地提供電子的一個(gè)重要指標(biāo)就是還原力，還原力強(qiáng)的物質(zhì)可提供電子從而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，阻止自由基所產(chǎn)生的連鎖反應(yīng)[26]。不同濃度米糠水提物和發(fā)酵米糠水提物還原力見(jiàn)圖5。由圖5可知，同一濃度下，發(fā)酵米糠水提物的還原力顯著高于米糠水提物（P＜0.05），雖然其還原力顯著低于標(biāo)準(zhǔn)品（P＜0.05），但在濃度為4 mg/mL時(shí)，其還原力可達(dá)到1.432。原因可能在于發(fā)酵能夠提高米糠中酚酸的含量，而酚酸具有較強(qiáng)的還原力。因此，發(fā)酵米糠水提物具有較強(qiáng)的還原力[27]。

圖5 不同濃度米糠水提物和發(fā)酵米糠水提物還原力

2.3.3 DNA損傷保護(hù)（見(jiàn)圖6～圖8和表2）

表2 發(fā)酵米糠水提物對(duì)·OH 介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用

圖6 不同處理對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA的損傷

圖8 米糠水提物與發(fā)酵米糠水提物對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用

米糠水提物與發(fā)酵米糠水提物對(duì)羥自由基（·OH）介導(dǎo)的DNA損傷保護(hù)作用以DNA雙螺旋比例進(jìn)行表征。在一定的場(chǎng)強(qiáng)下，DNA分子的遷移速率與其自身的大小和構(gòu)型有關(guān)，通常情況下，DNA 分子為雙螺旋結(jié)構(gòu)，條帶移動(dòng)較快。但當(dāng)DNA分子受到損傷后，雙螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)變成開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)或線性結(jié)構(gòu)，條帶移動(dòng)較慢[28]。雙螺旋比例越高表明其對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用越強(qiáng)[29]。由圖6、圖7可知，正常pBRR322質(zhì)粒DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)為主（泳道1），被·OH損傷后，部分雙螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)環(huán)或線型（泳道4）。與正常pBRR322質(zhì)粒DNA 相比，在紫外光（UV）的照射下（泳道2），DNA雙螺旋比例無(wú)顯著差異（P＞0.05）；加入30% H2O2（泳道3）時(shí)，DNA 雙螺旋比例顯著低于正常pBRR322 質(zhì)粒DNA組（P＜0.05）；當(dāng)兩者共同作用時(shí)（泳道4），DNA雙螺旋比例顯著低于30% H2O2組（P＜0.05）；這表明在紫外光(UV)的照射下或者加入30% H2O2時(shí)，不足以直接損傷DNA，而兩者共同作用時(shí)，過(guò)氧化氫可被光解產(chǎn)生羥自由基（·OH），而·OH被認(rèn)為是最活潑的活性氧，也是引起DNA 氧化損傷的主要因素之一。

圖7 不同處理對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA的損傷

發(fā)酵米糠水提物對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用見(jiàn)圖8 以及表2。由表2 可知，在同一濃度下，各組之間的差異都顯著（P＜0.05），這表明，發(fā)酵米糠水提物對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA損傷保護(hù)作用顯著高于米糠水提物。

綜上所述，文章以DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，優(yōu)化了發(fā)酵米糠水提物的提取時(shí)間、提取溫度和料水比，得出發(fā)酵米糠水提物提取時(shí)間為60 min，提取溫度為85 ℃，料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，其DPPH 自由基清除率可達(dá)85.55%，較原料提高了52.63%。對(duì)其活性成分含量進(jìn)行測(cè)定，得出發(fā)酵米糠水提物中多酚、黃酮、蛋白含量可達(dá)29.58、8.15、74.44 mg/g，較米糠水提物分別增加了68.16%、80.31%、28.92%；對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)酵米糠水提物的羥基自由基清除率、還原力以及對(duì)羥自由基（·OH）介導(dǎo)的DNA 損傷的保護(hù)作用都顯著強(qiáng)于米糠水提物。徐磊等[30]研究了米根霉發(fā)酵對(duì)脫脂薏米麩皮抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)與未發(fā)酵脫脂薏米麩皮相比，發(fā)酵處理后脫脂薏米麩皮的游離型酚類提取物的抗氧化活力顯著提高。李冰等[31]研究了發(fā)酵前后芍藥花中總酚總黃酮含量的變化及抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后芍藥花的總酚、總黃酮含量和抗氧化活性顯著提高。本研究結(jié)果與此相一致。

3 結(jié)論

總體而言，發(fā)酵后米糠的活性成分含量和抗氧化活性均顯著提高，試驗(yàn)研究結(jié)果將為深度開(kāi)發(fā)利用米糠資源提供一定的理論依據(jù)。