捻轉(zhuǎn)血矛線蟲鋅金屬蛋白酶NAS-31的表達特性及功能初步研究

黃艷，張惠，童丹妮，周靜茹，吳飛，陳學秋，楊怡，馬光旭，杜愛芳

（浙江大學動物科學學院動物預防醫(yī)學研究所，杭州 310058）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）是一種重要的牛羊寄生蟲，其感染性3 期幼蟲（L3）常附著于牧草之上，通過消化道入侵宿主，最終寄生于小反芻獸的皺胃中，以宿主血液為食，導致宿主出現(xiàn)貧血、消化不良等癥狀，嚴重降低感染動物的生產(chǎn)性能[1-2]。目前，我國各地綿羊/山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染情況均較為嚴重[3-4]，常用治療藥物的耐藥性報道屢見不鮮[5-7]；同時，寄生性線蟲比其他胞內(nèi)或組織內(nèi)寄生蟲更易逃避宿主的免疫機制，通過注射疫苗很難達到理想的保護效果[8-9]。因此，我國目前小反芻獸捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防治工作亟待加強。L3 入侵宿主發(fā)育至4 期幼蟲（L4）的過程，是其從自由生活階段轉(zhuǎn)變?yōu)樗拗骷纳A段的重要時期，研究L3與L4轉(zhuǎn)錄差異基因的功能對于探明該寄生蟲的入侵機制至關(guān)重要。LAING 等[10]和SCHWARZ 等[11]于2013年同時完成了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的基因組和轉(zhuǎn)錄組測序工作，為該寄生蟲的研究奠定了重要的數(shù)據(jù)基礎。

我們從以上轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲鋅金屬蛋白酶NAS-31，蛋白功能預測分析顯示其屬于線蟲蝦紅素樣蛋白。蝦紅素樣蛋白家族是一類廣泛存在于細菌、無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi)的鋅金屬蛋白酶，最早發(fā)現(xiàn)于十足螯蝦[12]，其另一個重要的家族成員是骨形成蛋白1（bone morphogenetic protein 1, BMP-1），該蛋白的果蠅同系物是Tolloid和Tolloid-like蛋白，主要參與細胞外基質(zhì)組成成分的加工[13-15]，此外，某些轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）抑制因子也是BMP-1/Tolloid的作用底物，它們的降解可激活TGF-β信號通路[16-17]。蝦紅素樣蛋白的生理功能有很多，包括在孵化、食物消化、肽酶加工以及在形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮作用等。在模式生物秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中，編碼線蟲蝦紅素樣蛋白的基因總共有40個[18]，但是只有少數(shù)幾種基因的功能是明確的，如：hch-1/nas-34表達于蟲卵中，參與蟲卵孵化過程[19]；DPY-31/NAS-35表達于上皮細胞中，是膠原蛋白加工和表皮形成過程中發(fā)揮重要功能的蛋白酶之一[20]；nas-36/37基因突變株存在蛻皮缺陷，主要表現(xiàn)為舊皮無法脫落，說明這2個基因與舊皮降解、脫落有關(guān)[21]。在寄生性線蟲中，有關(guān)蝦紅素樣蛋白功能的研究比較少。馬來絲蟲（Brugia malayi）和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中均存在dpy-31的同源基因。STEPEK 等[20]發(fā)現(xiàn)：馬來絲蟲dpy-31的啟動子能在秀麗隱桿線蟲中啟動報告基因的表達，且報告基因的分布情況與Ce-dpy-31的表達特征一致，均在腸道和排泄分泌系統(tǒng)中分布及表達；另外，Ce-dpy-31突變株蟲體表現(xiàn)為與角質(zhì)層相關(guān)的溫度敏感致死表型，異源表達Hc-dpy-31能實現(xiàn)對該突變株的拯救。這些結(jié)果證明，寄生性線蟲的蝦紅素樣蛋白基因可能與秀麗隱桿線蟲同源基因發(fā)揮類似的生物學功能。

為研究鋅金屬蛋白酶NAS-31 的生物學功能，本實驗首先通過cDNA 末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends, RACE）、基因步移（genome walking）克隆得到Hc-nas-31的全基因序列并分析其基因結(jié)構(gòu)，隨后構(gòu)建原核表達載體，以制備多克隆抗體用于免疫組織定位，進而分析Hc-NAS-31蛋白在感染性幼蟲（L3）和成蟲體內(nèi)的表達情況，為進一步探明該基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲入侵及寄生過程中發(fā)揮的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株和質(zhì)粒

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲浙江株由本實驗室傳代并保存；表達質(zhì)粒pET-30a、大腸埃希菌TOP10 和BL21（DE3）菌株由本實驗室凍存。

1.2 試劑與儀器

LATaq酶、限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體、DNA標志物、RACE 試劑盒、基因步移試劑盒購自日本TaKaRa 公司；2×Taq主混合物購自上海近岸生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO 公司；基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自浙江易思得生物科技有限公司；His 標簽鼠多克隆抗體購自美國Proteintech 公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的山羊抗鼠IgG購自北京鼎國有限公司；封閉用驢血清購自北京索萊寶科技有限公司；Alexa Fluor?488 nm熒光二抗購自英國Abcam公司；細胞核染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛溶液、抗原修復液、0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution,PBS）、封閉液等由實驗室配制；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）儀購自德國Eppendorf 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）儀（美國Bio-Rad公司）為浙江大學動物科學學院大型儀器平臺儀器；Zeiss LSM-780 激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)（德國Zeiss 公司）為浙江大學農(nóng)生環(huán)測試中心平臺儀器。

1.3 引物設計與合成

根據(jù)Ce-nas-31（GenBank登錄號：NM_001028 822.4）的氨基酸序列，經(jīng)tBlastn在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.sanger.ac.uk）中得到相似度最高的序列片段（HCISE00439000.t1），命名為Hc-nas-31，以此為模板設計特異性引物用于RACE 和基因步移擴增。根據(jù)RACE 結(jié)果設計融合PCR、原核表達及熒光定量PCR實驗所需引物。所有引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

總RNA 提取方法參照TriZol 試劑（美國Invitrogen 公司）說明書進行。取適量捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲蟲體于玻璃研磨器中，加入1 mL 的TriZol試劑在冰上充分研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中，于室溫下靜置5 min；加入200 μL 三氯甲烷振蕩混勻15 s，室溫靜置15 min；在4 ℃條件下，以1.2×104r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上層液體至新的離心管中；加入500 μL 異丙醇，輕輕吹打混勻，室溫靜置10 min；在4 ℃條件下，以1.2×104r/min 離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%乙醇漂洗沉淀；在4 ℃條件下，以8 000 r/min 離心5 min，棄上清液，室溫干燥5～10 min；加入10 μL 的RNase-free dH2O 溶解沉淀，即得總RNA。向總RNA 中加入1 μL 的Oligo（dT），65 ℃變性處理5 min，隨后迅速置于冰上冷卻。按照說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應液，在PCR 儀上設置反轉(zhuǎn)錄程序：30 ℃孵育10 min，42 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，85 ℃孵育5 min，4 ℃冷卻5 min，反應結(jié)束后于－80 ℃冰箱中保存，備用。

1.5 Hc-nas-31 基因的3′-全長RACE 反應

用TriZol 提取RNA 后，按照3′-全長RACE 試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書將其配制成反轉(zhuǎn)錄溶液，反應液在42 ℃條件下延伸1 h，70 ℃條件下孵育15 min，所得產(chǎn)物用于后續(xù)實驗。按照上述說明書中巢式PCR 的Outer PCR 體系配制反應液，擴增步驟如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，必要時可進行2 輪PCR 擴增。以最后一輪Outer PCR產(chǎn)物為模板進行Inner PCR擴增，步驟如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將回收片段連接至pMD19-T 克隆載體上，轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細胞，挑選A＋抗性Luria-Bertani（LB）平板上的陽性克隆送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進行測序，對結(jié)果進行拼接及做比對分析。

1.6 基因步移擴增

提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組后，使用納米微量核酸分析儀（臺灣省Maestrogen 公司）測定模板濃度，按照基因步移試劑盒說明書，取50～100 ng RNA進行第1輪PCR。將反應產(chǎn)物根據(jù)需要稀釋1～1 000倍后，取1 μL 作為第2 輪PCR 的模板，以相同的兼并引物（AP primer）為上游引物。若第1 輪PCR 以SP1 為上游引物，則此次可用SP2 或SP3 作為下游引物，若第1 輪PCR 以SP2 為上游引物，則此次用SP3 作為下游引物，按照相同比例配制反應液進行第2輪PCR，反應條件參考上述說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離并檢測每一輪PCR產(chǎn)物，割下清晰的電泳條帶，經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后連接到pMD19-T載體上，并進行測序分析。

1.7 不同時期的轉(zhuǎn)錄水平檢測

收集感染宿主的糞便，通過飽和食鹽水漂浮法分離蟲卵，轉(zhuǎn)到含D-Hanks溶液的瓊脂平板中進行體外培養(yǎng)，得到L1～L3 蟲體。對4—6 月齡湖羊連續(xù)注射免疫抑制劑3 d后，經(jīng)口感染6 000～8 000條L3蟲體，分別于感染后第11天和第45天剖殺湖羊，分離其皺胃中的L4和成蟲[22][本實驗得到浙江大學實驗動物中心實驗動物使用和管理委員會的批準（ZJU201308-1-10-072）]。提取各時期蟲體RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用熒光定量PCR 引物進行轉(zhuǎn)錄水平的檢測。采用2－ΔΔCT值比較法、t檢驗法及單因素方差分析法對轉(zhuǎn)錄水平進行相對定量分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.8 Hc-NAS-31 原核表達及多克隆抗體的制備

根據(jù)RACE 結(jié)果設計2 對分段引物Hc-nas-31F1/R1 和Hc-nas-31F2/R2，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，通過融合PCR 擴增得到Hcnas-31的全長cDNA 序列。用Hc-nas-31F/R 擴增帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的全長序列，與經(jīng)過相同限制性內(nèi)切酶處理的表達載體pET-30a連接過夜，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞后挑取陽性克隆進行測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pET-30a-Hc-nas-31轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆進行菌液PCR 和雙酶切鑒定。鑒定為陽性的菌液進行誘導表達實驗，以摸索最佳誘導條件；擴大培養(yǎng)后經(jīng)1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導5 h，利用親和鎳柱純化重組蛋白。用Bradford 法測定蛋白濃度后，根據(jù)常規(guī)免疫程序?qū)π挛魈m大白兔免疫，共進行3 次，末次免疫后第7 天在耳緣靜脈采血并分離血清，測定多克隆抗體滴度，以滿足后續(xù)實驗需求；3 d 后實施心臟采血并分離血清，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測抗體結(jié)合能力，于－80 ℃條件下分裝、保存。

1.9 間接免疫熒光分析

1.9.1 L3 全蟲間接免疫熒光

收集L3 蟲體，加入1%次氯酸鈉溶液處理30 min 以進行人工脫鞘，采用PBS 充分洗滌，加入4%多聚甲醛溶液于4 ℃條件下固定7 d以上；經(jīng)PBS充分洗滌后，按照體積比1∶100 加入蛋白酶K，于55 ℃條件下消化45 min；用PBS 洗滌后，加入0.1%的Triton X-100，室溫透化過夜[23]；用PBS 洗滌后，加入1.5%牛血清蛋白（bovine serum albumin,BSA）的封閉液，室溫過夜孵育；用PBS洗滌后，加入稀釋200倍的Hc-NAS-31兔多克隆抗體，于37 ℃條件下孵育1 h；用PBS 充分洗滌后，加入1∶1 000 稀釋的Goat Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor?488 nm）熒光二抗，于37 ℃條件下避光孵育1 h；用PBS避光洗滌后，加入DAPI 染色液，在室溫避光下孵育30 min；用PBS 洗滌后，在Zeiss LSM-780 激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.9.2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲石蠟切片的制作

收集捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲蟲體，加入4%多聚甲醛溶液，在4 ℃條件下固定7 d 以上，用PBS 漂洗3～5次后進行梯度乙醇脫水：50%乙醇10 min，75%乙醇10 min，80%乙醇10 min，95%乙醇10 min，100%乙醇10 min，100%乙醇10 min。將蟲體轉(zhuǎn)移至100%乙醇-二甲苯（體積比1∶1）溶液中處理10 min，用二甲苯浸泡10 min（2 次）；透明結(jié)束后，浸入融化的石蠟中包埋1～2 h 后，蠟塊凝固后可在4 ℃條件下長期保存[24]。利用組織切片機，將石蠟塊切成4 μm 的蠟片，在42 ℃水浴鍋中展開后用黏附載玻片撈起，轉(zhuǎn)移至50 ℃烘箱中進行干燥后，室溫保存。

1.9.3 免疫組織熒光分析

在顯微鏡下選取合適的石蠟切片放置到切片架中，依次將切片浸入二甲苯Ⅰ6 min，二甲苯Ⅱ6 min，無水乙醇Ⅰ4 min，無水乙醇Ⅱ4 min，90%乙醇3 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min，蒸餾水3 min；鍋中盛適量自來水，放入裝有抗原修復液的燒杯，煮沸，將水化完成后的切片浸入燒杯中，20 min 后轉(zhuǎn)移至蒸餾水中冷卻。滴加10%驢血清，37 ℃封閉1 h；用PBS 潤洗3 次，滴加稀釋200 倍的血清抗體，37 ℃孵育1 h；用PBS 潤洗3 次，加入Alexa Fluor?488 nm 熒光二抗（用PBS 按體積比1∶1 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；用PBS 潤洗3 次，DAPI 染核30 min；用PBS 潤洗后，滴加適量50%丙三醇封片，在Zeiss LSM-780 激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因序列獲得及結(jié)構(gòu)分析

以HCISE00439000.t1 為模板設計特異性擴增引物，按照說明書進行RACE 實驗未擴增得到目的條帶，將Outer PCR 和Inner PCR 均進行2 輪，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Inner PCR 第2 輪產(chǎn)物在500 bp 左右有一條疑似條帶（圖1A），回收后連接T載體進行測序，經(jīng)拼接比對后確定為Hc-nas-31基因片段，并成功獲得該基因的3′端非編碼區(qū)（untranslated region, UTR）。5′基因步移擴增得到1 500 bp 左右片段，3′基因步移擴增得到1 000 bp 左右片段，回收后連接T 載體進行測序，結(jié)果顯示2 個片段均為目的基因序列（圖1B～C）。結(jié)合RACE、基因步移及Sanger 數(shù)據(jù)庫信息，成功獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲浙江株Hc-nas-31基因的全長mRNA 和DNA 序列：其mRNA 序列（GenBank登錄號：MW142213）全長1 982 bp，包括1 617 bp的編碼區(qū)和365 bp的3′UTR，其中3′UTR與編碼區(qū)之間無內(nèi)含子；Hc-nas-31基因DNA（GenBank 登錄號：MW142214）全長15 519 bp，由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成（圖1D）。

圖1 Hc-nas-31基因擴增與結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Hc-nas-31 gene amplification and structural schematic diagram

2.2 Hc-nas-31 全長編碼序列（coding sequence,CDS）擴增

根據(jù)獲得的Hc-nas-31mRNA序列設計2對引物，分別擴增得到該基因的2段基因片段，再經(jīng)過融合PCR方法擴增Hc-nas-31全長CDS。如圖2所示，最終在1 500 bp左右可以看到清晰的條帶，與目的基因大小相符。回收目的片段并連接T載體后，轉(zhuǎn)化到TOP10 感受態(tài)細胞中，將陽性菌斑送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果與所得到的mRNA序列相似性為100%。用InterProScan 和PredictProtein 軟件對基因編碼的氨基酸序列功能域進行預測，結(jié)果顯示：Hc-NAS-31有1個蝦紅素樣蛋白結(jié)構(gòu)域、1個CUB結(jié)構(gòu)域和1個SXC結(jié)構(gòu)域，在分類上屬于蝦紅素樣金屬肽酶，該蛋白N端還有一段信號肽（圖2）。

圖2 Hc-nas-31全長CDS擴增及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Amplification of Hc-nas-31 full-length CDS and structural schematic diagram of Hc-NAS-31 protein

2.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各時期Hc-nas-31的轉(zhuǎn)錄水平

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各時期蟲體中Hc-nas-31基因均有不同水平轉(zhuǎn)錄，其中L2 和L3 幼蟲中轉(zhuǎn)錄水平較高，而蟲卵和雌性成蟲（FA）體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平較低（圖3）。在自由生活階段，該基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，在L3期時達到峰值，但當捻轉(zhuǎn)血矛線蟲入侵宿主后出現(xiàn)斷崖式下降。

圖3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各時期Hc-nas-31轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Transcription levels of Hc-nas-31 at different stages of H.contortus

2.4 Hc-NAS-31原核表達及多克隆抗體制備結(jié)果

將編碼區(qū)序列插入表達載體pET-30a，重組質(zhì)粒測序正確后轉(zhuǎn)化至BL21 感受態(tài)細胞中，挑選單克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 號和4號菌斑為陽性（圖4A）。選取3 號菌斑進行誘導以摸索最佳誘導時間，發(fā)現(xiàn)在37 ℃條件下誘導5 h 即能成功表達足夠量的蛋白（圖4B）。擴大培養(yǎng)后誘導5 h，收集菌體并純化重組蛋白用于多克隆抗體制備，發(fā)現(xiàn)制備的多克隆抗體能與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3和成蟲全蟲蛋白特異性結(jié)合（圖4C），可用于后續(xù)實驗。

圖4 重組質(zhì)粒鑒定、誘導表達及多克隆抗體蛋白質(zhì)印跡法檢測Fig.4 Identification of the recombinant plasmid,induction expression and Western blotting analysis of polyclonal antibodies

2.5 L3 全蟲間接免疫熒光結(jié)果

根據(jù)各時期轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果，基因在L3蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他時期，因此，收集潔凈的L3 蟲體人工脫鞘后，進行全蟲間接免疫熒光分析。結(jié)果顯示，Hc-NAS-31蛋白主要分布于蟲體的上皮細胞合胞體中（圖5）。

圖5 L3全蟲間接免疫熒光分析Fig.5 Indirect immunofluorescence analysis of whole worm of L3

2.6 Hc-NAS-31 在成蟲體內(nèi)的分布

制備捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲切片，通過免疫組織熒光染色觀察Hc-NAS-31 蛋白在成蟲體內(nèi)的表達情況。結(jié)果表明：Hc-NAS-31蛋白主要分布于雄性成蟲的生殖腺（性腺）、腸道和肌肉中（圖6），雌性成蟲的腸道、性腺和蟲卵早期胚胎中也有較高水平的表達（圖7），而陰性對照無熒光信號。

圖6 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-NAS-31在雄性成蟲中的表達分布Fig.6 Expression locations of Hc-NAS-31 in male adults of H.contortus

圖7 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-NAS-31在雌性成蟲中的表達分布Fig.7 Expression locations of Hc-NAS-31 in female adults of H.contortus

3 討論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵隨宿主糞便排出體外，在適宜的條件下孵化并發(fā)育至披鞘的感染性3 期幼蟲（L3），該時期的幼蟲在外界環(huán)境下一般可存活3 個月，對惡劣環(huán)境具有較強的抵抗能力，并可通過休眠延長存活時間，最長可達1 年[25-26]，是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲防治的重點和難點。對該寄生蟲L3 期高表達基因的功能進行研究，尋找可能的藥物靶點，降低感染性幼蟲在外界環(huán)境中的存活率，可能成為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病防控的新思路。

本實驗對Hc-nas-31在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各時期的轉(zhuǎn)錄豐度進行熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)該基因在除蟲卵以外的其他自由生活階段的轉(zhuǎn)錄水平均高于寄生階段（L4和成蟲），其中L3期的轉(zhuǎn)錄水平最高，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致[11]。該基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3 中的大量轉(zhuǎn)錄可能與蟲體抵抗惡劣的外界環(huán)境有關(guān)，也可能與感染性幼蟲入侵宿主有關(guān)。

Hc-nas-31基因編碼538個氨基酸，功能域預測分析結(jié)果顯示，該蛋白具有1 個蝦紅素樣蛋白結(jié)構(gòu)域、1個CUB結(jié)構(gòu)域和1個SXC結(jié)構(gòu)域，在分類上屬于蝦紅素樣金屬肽酶，N 端信號肽的存在說明Hc-NAS-31合成后可被分泌至細胞外。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲與秀麗隱桿線蟲在進化關(guān)系上同屬于第5 分支，很多研究證明這2種線蟲的同源基因可能發(fā)揮類似的生物學功能[20,27-28]。而在秀麗隱桿線蟲中，蝦紅素樣蛋白參與的功能包括蟲卵孵化、表皮成分合成與加工、蛻皮等[18-21]。眾所周知，蛋白質(zhì)的表達特性對于進一步研究基因的生物學功能至關(guān)重要，為探究Hc-NAS-31是否也參與以上生命過程，本研究對該基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中的表達特性進行了分析。

通過RACE 和融合PCR 擴增，得到Hc-nas-31的編碼區(qū)序列，構(gòu)建了Hc-NAS-31 的原核表達載體，并經(jīng)誘導及純化得到重組蛋白，將其免疫新西蘭大白兔以制備多克隆抗體。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：獲得的抗體可以特異性結(jié)合Hc-NAS-31的重組蛋白和天然蛋白，可用于免疫熒光分析該蛋白在蟲體內(nèi)的表達情況。對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲脫鞘3期幼蟲和成蟲切片進行間接免疫熒光分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Hc-NAS-31 主要表達于L3 蟲體的上皮細胞合胞體中，而上皮細胞是表皮組成成分及蛻皮期間參與皮質(zhì)溶離的蛋白合成的重要場所[29]，說明Hc-NAS-31跟某些蝦紅素樣蛋白一樣可能參與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的蛻皮過程[20,27]；L3需要面臨復雜的外界環(huán)境，其表皮成分可能與其他時期的表皮成分不同，Hc-NAS-31也有可能參與特殊表皮成分的合成過程。在雌性成蟲中，該蛋白主要表達于腸道、性腺、早期蟲卵中，而在雄性成蟲體內(nèi)，該蛋白主要分布于腸道、生殖腺以及肌肉組織中。Hc-NAS-31 在幼蟲和成蟲體內(nèi)的表達情況存在差異，說明該蛋白可能具有多種生物學功能，在幼蟲時期參與皮質(zhì)層合成、蟲體的蛻皮，當蟲體發(fā)育至成蟲時，蛻皮不再發(fā)生，但表皮在成蟲生長發(fā)育的過程中仍會不斷變大[30]，此時上皮組織中并無Hc-NAS-31 表達，說明該蛋白不參與成蟲表皮的合成，而在腸道、性腺（生殖腺）、早期蟲卵及肌肉組織中檢測到綠色熒光，表明該蛋白可能還參與了食物消化、能量轉(zhuǎn)化、生殖系統(tǒng)發(fā)育、蟲卵形成等生物過程。另外，Hc-NAS-31在雄蟲肌肉中的表達可能與交配行為有關(guān)[31]。

4 結(jié)論

本研究通過實時熒光定量PCR檢測Hc-nas-31在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲不同時期的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，該基因可能是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3 生存和入侵的關(guān)鍵基因。間接免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，Hc-NAS-31主要表達于L3上皮細胞合胞體和成蟲的性腺（生殖腺）、早期蟲卵、腸道中，在肌肉中也有少量表達。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲鋅金屬蛋白酶NAS-31的表達特性分析結(jié)果對進一步解析該基因在蟲體生長發(fā)育及宿主入侵過程中發(fā)揮的功能具有重要意義，為Hc-nas-31之后的功能研究指明了方向。