小麥 TaWRKY51基因的克隆及其參與SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育過程的表達(dá)模式研究

吳國麗，魏霽桐，段江麗，盛呈澤，宋齊魯，郭佳林，張亞敏，牛 娜，王軍衛(wèi)，馬守才，張改生，宋瑜龍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢(shì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展和人口數(shù)量的持續(xù)增加，人們對(duì)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的需求進(jìn)一步加大，因此，在有限耕地面積不變的基礎(chǔ)上創(chuàng)新育種材料，挖掘小麥單產(chǎn)潛力，實(shí)現(xiàn)小麥單產(chǎn)的大幅度提升，對(duì)保障國家口糧安全顯得尤為重要[1]。利用雜種優(yōu)勢(shì)可提高作物單產(chǎn)，在玉米、水稻、油菜等作物中均已大面積應(yīng)用，且已經(jīng)取得了顯著效果。“化殺二系法”可誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生雄性不育系，實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)利用，因其具有操作簡(jiǎn)便、親本選配范圍廣、強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合出現(xiàn)幾率高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用的最有效途徑之一[2-4]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與響應(yīng)生物與非生物脅迫、激素信號(hào)傳導(dǎo)、葉片衰老以及雄性生殖器官發(fā)育等過程[5-8]。Lei等[9]以擬南芥花粉粒為材料，發(fā)現(xiàn)花粉特異性表達(dá)基因WRKY2、WRKY34和VQ20共同調(diào)控參與花粉發(fā)育、萌發(fā)以及花粉管伸長(zhǎng)過程，三者同時(shí)突變會(huì)引發(fā)花粉粒敗育。Mukhtar等[10]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)WRKY27會(huì)造成擬南芥花藥不能正常開裂，且花粉?；钚燥@著降低。張 娟[11]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OsWRKY51后，水稻株高極顯著降低，分蘗角度增大，花粉育性降低，單株結(jié)實(shí)數(shù)變少，且種子在開花期開裂。此外，關(guān)于小麥TaWRKY51功能的研究也有相關(guān)報(bào)道。Hu等[12]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TaWRKY51可造成乙烯合成關(guān)鍵基因ACS的表達(dá)量降低，內(nèi)源乙烯含量下降，側(cè)根數(shù)量減少。栗 穎[13]發(fā)現(xiàn)，TaWRKY51在低溫、氯化鈉、ABA等誘導(dǎo)后表達(dá)量均顯著上調(diào)，且具有較高的轉(zhuǎn)錄激活活性，可以與典型的W-box結(jié)合，行使轉(zhuǎn)錄因子功能。

SQ-1是由中國自主研發(fā)的具有高效、穩(wěn)定、廣譜等優(yōu)點(diǎn)的一類小麥化學(xué)雜交劑，其誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生雄性不育率可達(dá)95%以上，并對(duì)雌蕊無不良影響[14-15]，但其生產(chǎn)成本較高，是限制SQ-1大面積應(yīng)用的主要瓶頸。近年來，為了解析SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育的機(jī)理，服務(wù)于新型廉價(jià)、高效、安全、廣譜型小麥化學(xué)雜交劑的開發(fā)，本課題組圍繞SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育開展了系統(tǒng)研究。本研究擬利用從SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育系PHYMS(physiological male sterility)-1376及其對(duì)照CK-1376花藥差異表達(dá)基因中篩選到的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因片段，通過與小麥基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，克隆獲得了TaWRKY51，并對(duì)其生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位，及其在PHYMS-1376花藥中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，初步解析TaWRKY51與SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育的關(guān)系，以期揭示SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育機(jī)理，為開發(fā)新型化學(xué)雜交劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種西農(nóng)1376與化學(xué)雜交劑SQ-1均由西北農(nóng)林科技大學(xué)張改生教授實(shí)驗(yàn)室提供。2018年10月，將該品種種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)作一站，翌年3月，當(dāng)材料發(fā)育至Feek’s 8.5時(shí)期，將其分為兩組，一組用5 kg·hm-2的化學(xué)殺雄劑SQ-1處理(PHYMS-1376)，另一組用等量清水處理(CK-1376)。待花粉粒發(fā)育至四分體時(shí)期、單核早期、單核晚期、二核期和三核期時(shí)，分別在冰上采集PHYMS-1376的花藥，置于EP管中，液氮速凍，-80 ℃保存，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成

利用Trizol提取PHYMS-1376和CK-1376各時(shí)期花藥總RNA，并用DNase I進(jìn)行純化處理，隨后參照HiScript ll 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)試劑盒說明書(Vazyme，南京)，將純化后的花藥總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存，用于WRKY51擴(kuò)增及后續(xù)研究。

1.2.2TaWRKY51基因的克隆

利用以PHYMS-1376和CK-1376花藥篩選到的差異表達(dá)基因TraesCS1D02G362900.1序列，與小麥基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲得TaWRKY51cDNA全序列，使用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)特異性引物TaWRKY51-F/R(表1)擴(kuò)增開放閱讀框，以cDNA為模板，使用2×TransStart FastPfu PCR SuperMix擴(kuò)增TaWRKY51，PCR擴(kuò)增體系：2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各2.5 μL，模板cDNA(100 ng· μL-1)5 μL，ddH2O 15 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨后用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工，上海)回收，連接至pEASY-Blunt Cloning Vector載體(TransGen，北京)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α ，挑陽性克隆，37 ℃培養(yǎng)16 h，送上海生工測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)該基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表1 本研究所用引物

1.2.3TaWRKY51的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)TaWRKY51蛋白的理化性質(zhì)，用NPS-SOPM在線軟件(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測(cè)TaWRKY51蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)TaWRKY51蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Protscale在線軟件(http://web.expasy.org/protscale)分析TaWRKY51蛋白的親/疏水性，并通過Cell-Ploc 2.0(http:www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2)中的Plant-mPLoc進(jìn)行TaWRKY51蛋白的亞細(xì)胞定位；通過Ensembl Plants在線網(wǎng)站(http://plants.ensembl.org)查找與TaWRKY51蛋白同源度較高的序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，并利用DNAMAN軟件對(duì)TaWRKY51蛋白與其同源蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)分析。用PlantCARE在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtods/plantcare/html)對(duì)TaWRKY51啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 TaWRKY51蛋白的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄活性分析

以CK-1376各時(shí)期混合花藥cDNA為模板，利用TaWRKY51-F1/R1引物擴(kuò)增TaWRKY51開放閱讀框，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目標(biāo)條帶(PCR擴(kuò)增體系和程序以及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和回收方法同1.2.2)，并將其重組到35S-EGFP(酶切位點(diǎn)為BstBⅠ)表達(dá)載體上。隨后，將35S-EGFP-TaWRKY51表達(dá)載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞并測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序正確的陽性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取35S-EGFP-TaWRKY51質(zhì)粒，利用凍融法將其轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)，之后采用注射法將重懸農(nóng)桿菌注射入4～6葉期健壯的本氏煙葉片中，培養(yǎng)48 h后取注射孔附近的葉片表皮置于載玻片上，在激光共聚焦熒光顯微鏡(Olympus，日本)下觀察熒光信號(hào)，并拍照。

以CK-1376各時(shí)期混合花藥cDNA為模板，利用TaWRKY51-F2/R2引物擴(kuò)增TaWRKY51開放閱讀框，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶回收后將其重組轉(zhuǎn)入酵母雙雜表達(dá)載體pGBKT7(酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ和BamHⅠ)。隨后，將pGBKT7-TaWRKY51重組載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并測(cè)序，將測(cè)序正確的陽性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，提取pGBKT7-TaWRKY51質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞，并擴(kuò)大培養(yǎng)，之后將其涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基上，挑陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并將3種不同稀釋度(100、10-1和 10-2)的酵母菌液接種于SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上觀察生長(zhǎng)情況。PCR反應(yīng)體系與程序同1.2.2。

1.2.5 小麥TaWRKY51基因的表達(dá)模式分析

設(shè)計(jì)TaWRKY51熒光定量引物TaWRKY51-F3/R3，以小麥Actin作為內(nèi)參基因，以SQ-1誘導(dǎo)的生理型雄性不育系PHYMS-1376及其對(duì)照可育系CK-1376四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥cDNA為模板，參照2×RealStar Green Fast Mixture(康潤(rùn)誠業(yè)，北京)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，置于QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國)上進(jìn)行反應(yīng)；qRT-PCR反應(yīng)程序： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析采用系統(tǒng)默認(rèn)值。運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，所獲數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件采用LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 TaWRKY51的克隆結(jié)果與結(jié)構(gòu)分析

以CK-1376花藥cDNA為模板，參照PHYMS-1376和CK-1376花藥差異表達(dá)基因TraesCS1D02G362900.1序列，設(shè)計(jì)TaWRKY51-F/R引物，擴(kuò)增獲得單一條帶(圖1)，膠回收后，將其連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑陽性單克隆測(cè)序，得到663 bp的序列，與TraesCS1D02G362900.1序列開放閱讀框一致，可編碼220個(gè)氨基酸。序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與TaWRKY51同源性為97%，屬于TaWRKY51同源基因。對(duì)TaWRKY51基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該基因5′-UTR區(qū)長(zhǎng)度為264 bp，3′-UTR區(qū)長(zhǎng)度為433 bp。

M：DL2000；1～4： TaWRKY51的PCR產(chǎn)物。

2.2 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam分析TaWRKY51蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其分子量為23.34 kD，等電點(diǎn)為6.42，序列中有20個(gè)氨基酸(Arg+Lys)帶正電荷，有21個(gè)氨基酸(Asp+Glu)帶負(fù)電荷，不穩(wěn)定系數(shù)為52.69，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂溶性指數(shù)為57.82。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，TaWRKY51蛋白中含有28.18%的α-螺旋，10.42%的β-轉(zhuǎn)角，16.82%的延伸鏈，以及44.55%的無規(guī)卷曲(圖2a)。利用SWISS-MODEL分析TaWRKY51蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其C端具有與擬南芥AtWRKY1蛋白相同的晶體結(jié)構(gòu)，且序列一致性高達(dá)56.76%(圖2b)。利用Protscale在線軟件對(duì)TaWRKY51蛋白質(zhì)的氨基酸序列親/疏水性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)得分為負(fù)值的氨基酸數(shù)量大于得分為正值的氨基酸數(shù)量，且最大值為1.956，最小值為-3.067，表明TaWRKY51蛋白屬于親水性蛋白(圖2c)。Plant-mPLoc在線預(yù)測(cè)TaWRKY51蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。

a：TaWRKY51蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，藍(lán)色代表α-螺旋，綠色代表β-轉(zhuǎn)角，紅色代表延伸鏈，紫色代表無規(guī)則卷曲；b：TaWRKY51蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；c：TaWRKY51蛋白的親/疏水性。

利用NCBI Blast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對(duì)，篩選與TaWRKY51親緣關(guān)系較近的基因序列，利用MEGA 7.0繪制進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥TaWRKY51蛋白與節(jié)節(jié)麥(XP020192531.1)親緣關(guān)系最近(圖3)。利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，小麥TaWRKY51的同源基因較多，第一同源群染色體與第二同源群染色體同源基因編碼的蛋白質(zhì)序列存在明顯差異，但其均具有WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)，且高度保守，屬于第二類WRKY家族(圖4)。

圖3 TaWRKY51蛋白的進(jìn)化樹分析

圖4 TaWRKY51蛋白的同源序列比對(duì)

為了進(jìn)一步解析TaWRKY51的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，利用PlantCARE在線軟件，對(duì)TaWRKY51啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaWRKY51啟動(dòng)子區(qū)含有與光響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)等相關(guān)的7類順式作用元件(表2)，表明TaWRKY51可能受光、內(nèi)源激素及其他非生物脅迫調(diào)控。

表2 TaWRKY51基因上游調(diào)控區(qū)順式作用元件

2.3 TaWRKY51蛋白的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄激活活性分析

對(duì)TaWRKY51蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，35S-EGFP-TaWRKY51融合蛋白僅能在細(xì)胞核內(nèi)檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，而35S-EGFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均能檢測(cè)到，表明TaWRKY51定位于細(xì)胞核，屬于核表達(dá)基因，該結(jié)果與Plant-mPLoc在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。為了進(jìn)一步明確TaWRKY51是否具有自激活效應(yīng)，將TaWRKY51連接到pGBKT7載體，并將pGBKT7-TaWRKY51和pGBKT7載體分別轉(zhuǎn)入酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞。隨后，將帶有pGBKT7和pGBKT7-TaWRKY51載體的酵母菌株涂布在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上，置于30 ℃條件下培養(yǎng)，結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入pGBKT7載體的酵母菌落只能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)入pGBKT7-TaWRKY51載體的酵母菌落既可以在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，也能在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明TaWRKY51轉(zhuǎn)錄因子具有自激活活性。

圖5 TaWRKY51蛋白的亞細(xì)胞定位

100、10-1和10-2為3種不同稀釋度的酵母菌液。

2.4 TaWRKY51基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)雄性不育系PHYMS-1376及其對(duì)照可育系CK-1376花藥四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥中TaWRKY51的表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，CK-1376在花藥四分體時(shí)期至單核晚期，TaWRKY51表達(dá)量呈持續(xù)降低，二核期至三核期表達(dá)量明顯提高。與CK-1376相比， PHYMS-1376中TaWRKY51的表達(dá)量在花藥四分體時(shí)期、單核晚期、二核期和三核期均極顯著高于 對(duì)照。

表3 TaWRKY51在CK-1376和PHYMS-1376不同時(shí)期花藥中的表達(dá)量

3 討 論

本研究以化學(xué)雜交劑SQ-1誘導(dǎo)的小麥雄性不育系及其對(duì)照可育系為材料，篩選到一個(gè)顯著差異表達(dá)基因TaWRKY51，其編碼蛋白具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域。WRKYGQK是WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子的標(biāo)志序列，主要位于蛋白的N端，且C端有Cys(2)-His(2)型或Cys(2)-HisCys型鋅指結(jié)構(gòu)[16]。有研究表明，N端具有WRKYGQK結(jié)構(gòu)域且C端具有鋅指結(jié)構(gòu)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，才可以正常行使生物學(xué)轉(zhuǎn)錄功能，其中C端鋅指結(jié)構(gòu)可引導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因特異性結(jié)合，因此，僅存在WRKY結(jié)構(gòu)域而無鋅指結(jié)構(gòu)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子不能發(fā)揮其生物學(xué)調(diào)控作用[17-19]。然而，WRKYGQK結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列并非完全保守，其中W、Q和K會(huì)出現(xiàn)不同頻次的變異，尤其是Q位點(diǎn)變異頻率最高[20]。Dong等[21]和Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥和水稻W(wǎng)RKY家族WRKYGQK結(jié)構(gòu)域中的Q會(huì)變異為K或E，且不同序列的轉(zhuǎn)錄活性存在一定程度差異。上述研究結(jié)果在本研究中也得到了證實(shí)，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TaWRKY51的N端含有WRKY保守結(jié)構(gòu)域，C端含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，且WRKYGQK序列中的Q變異為K。Eulgen等[16]研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子專一識(shí)別(T)(T)TGAC(C/T)序列，其中核心序列為TGAC，屬于W-box結(jié)構(gòu)，具有此類結(jié)構(gòu)域的基因主要參與植物防御反應(yīng)、衰老、生殖發(fā)育及其他非生物脅迫(干旱、高鹽等)的應(yīng)答反應(yīng)。本研究對(duì)TaWRKY51基因啟動(dòng)子順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)TaWRKY51基因啟動(dòng)子區(qū)含有與光響應(yīng)、激素應(yīng)答(茉莉酸、脫落酸響應(yīng))、脅迫應(yīng)答(干旱和厭氧響應(yīng))等相關(guān)的7類順式作用元件，表明TaWRKY51參與植物生長(zhǎng)發(fā)育，可以響應(yīng)多種逆境應(yīng)答。這與前人研究結(jié)果一致。

Zhang等[23]對(duì)陸地棉不育系及其保持系進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析，鑒定到4個(gè)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，且都在不育系花藥中上調(diào)表達(dá)；Hu等[24]利用基因芯片技術(shù)對(duì)3個(gè)秈稻不育系D62A(D型)、ZS97A(WA型)和XQZ-A(DA型)的花藥轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)WRKY家族基因WRKY76和WRKY104，并且都在不育系中上調(diào)表達(dá)；李 莎[25]對(duì)K型小麥雄性不育系 KTM3315A及其近等基因系KTM3315R二核期的花藥進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定到WRKY2、WRKY51等14個(gè)差異表達(dá)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，其中WRKY51等13個(gè)基因在不育系花藥中上調(diào)表達(dá)。上述研究結(jié)果在本研究中也進(jìn)一步得到了證實(shí)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CK-1376花藥四分體時(shí)期至單核晚期，TaWRKY51的表達(dá)量呈持續(xù)降低，二核期至三核期表達(dá)量明顯提高。與CK-1376相比， PHYMS-1376花藥中TaWRKY51的表達(dá)量在花藥四分體時(shí)期、單核晚期、二核期、三核期均極顯著高于對(duì)照，表明TaWRKY51與雄性花粉敗育密切相關(guān)。此外，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，TaWRKY51位于細(xì)胞核內(nèi)，這與小麥中的TaWRKY2和TaWRKY19定位結(jié)果一致[26]。轉(zhuǎn)錄激活活性研究結(jié)果表明，TaWRKY51具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，這一研究結(jié)果與粟 穎[13]研究結(jié)果一致。

綜上所述，TaWRKY51具有WRKY基因家族特征，定位于細(xì)胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，且與SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育密切相關(guān)，但其具體生物學(xué)功能與花粉敗育之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。