穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物在我國分析檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展*

徐仲杰， 張 雨， 雷 雯， 胡祖明

(1.東華大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院化纖與高分子材料改性國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201620；2.上?；ぱ芯吭河邢薰炯夹g(shù)開發(fā)中心 上海 200062)

近年來，隨著同位素稀釋質(zhì)譜法在檢測中的普遍應(yīng)用，對作為其內(nèi)標(biāo)試劑的穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物的需求日益增長，促使穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)迅猛發(fā)展。目前以代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床質(zhì)譜為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展迅速，同時(shí)越來越多的生物技術(shù)引入醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，使得生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程明顯加快。在生物工程、生命科學(xué)及新藥研發(fā)等領(lǐng)域，以同位素示蹤技術(shù)為核心的代謝組學(xué)獲得廣泛應(yīng)用。

當(dāng)前穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜法在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛，這是由于穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)在特定環(huán)境污染源中的結(jié)構(gòu)特殊，同時(shí)具有在遷移及反應(yīng)過程中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、檢測結(jié)果精密度高和準(zhǔn)確度好等特點(diǎn)，已被大量應(yīng)用于環(huán)境污染物來源分析以及環(huán)境污染事件仲裁。

十八大以來，我國為保障人民“舌尖上的安全”，進(jìn)而更好地保證人體健康，對食品安全問題高度重視，將其提升到國家戰(zhàn)略的高度。為響應(yīng)國家發(fā)展戰(zhàn)略，越來越多的檢測標(biāo)準(zhǔn)、科學(xué)研究傾向于選擇靈敏度高、準(zhǔn)確性好的檢測方法，應(yīng)用于食品中農(nóng)獸藥殘留、違禁添加劑等的檢測，穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜法以其獨(dú)特的優(yōu)勢發(fā)揮了巨大的作用。

1 穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物主要作為示蹤劑追蹤生物體內(nèi)能量、糖類、脂質(zhì)等特定代謝通路，得到機(jī)理信息，或作為內(nèi)標(biāo)試劑應(yīng)用于蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量及代謝相關(guān)疾病的診斷。

1.1 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是新興組學(xué)技術(shù)，是在基因組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)后發(fā)展起來的。近年來，基于同位素示蹤技術(shù)的代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用在生物工程、生命科學(xué)及藥物研發(fā)領(lǐng)域。通過引入帶有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的示蹤劑，追蹤生物體內(nèi)特定代謝通路及代謝物的情況，從而為合成生物學(xué)、疾病致病機(jī)理研究、藥物代謝及作用機(jī)理研究提供依據(jù)。

付慧等[1]以氘或13C標(biāo)記的穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物為內(nèi)標(biāo)，采用液液萃取-高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜法對人體尿中8種多環(huán)芳烴代謝物同時(shí)進(jìn)行定量分析，檢測時(shí)加入的同位素內(nèi)標(biāo)試劑為1-羥基萘-D7、2-羥基芴-D9、3-羥基芴-D9、13C12-2,3,3′,4,4′-五氯聯(lián)苯等，多環(huán)芳烴代謝物的檢出限可達(dá)0.006～0.042 μg/L。

張秀堯等[2]以穩(wěn)定同位素標(biāo)記去甲地西泮-D5為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對人血漿和尿液中42種精神藥物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了快速準(zhǔn)確檢測，其中巴比妥類藥物的檢出限為20～100 mg/L，其余藥物的檢出限為0.05～2.0 mg/L。

朱婧等[3]以同位素標(biāo)記苯巰基尿酸-D2、N-乙?；?S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸-13C,D3、N-乙?；?S-苯基-L-半胱氨酸-13C6等為內(nèi)標(biāo)試劑，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿中苯系物以及三氯乙烯代謝產(chǎn)物，方法的檢出限低至0.035 0～1.75 μg/L。

陳躍等[4]使用甲基苯丙胺-D5、嗎啡-D3、O6-單乙酰嗎啡-D3為內(nèi)標(biāo)，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對人體唾液中3種毒品(甲基苯丙胺、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡)及其代謝物進(jìn)行檢測，3種毒品的檢出限為0.02～0.05 μg/L。

王佳曼等[5]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以20種穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物做內(nèi)標(biāo)，對特應(yīng)性皮炎患者中氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸等物質(zhì)的代謝情況進(jìn)行研究，所使用的內(nèi)標(biāo)包括12種氨基酸，分別為甘氨酸-15N，13C、丙氨酸-D4、纈氨酸-D8、亮氨酸-D3、蛋氨酸-D3、苯丙氨酸-D5、酪氨酸-13C6、天冬氨酸-D3、谷氨酸-D3、瓜氨酸-D2、鳥氨酸-D2、精氨酸-D4,13C；8種?；鈮A內(nèi)標(biāo)，分別為游離肉堿-D9、乙酰肉堿-D3、丙酰肉堿-D3、丁酰肉堿-D3、異戊酰肉堿-D9、辛酰肉堿-D3、肉豆蔻酰肉堿-D9、棕櫚酰肉堿-D3。

凌家俊等[6]以氘代尼古丁為內(nèi)標(biāo)，利用穩(wěn)定同位素微透析采樣技術(shù)，對尼古丁經(jīng)皮制劑的整體及大腦局部的藥代動力學(xué)進(jìn)行了相關(guān)研究，為新型給藥系統(tǒng)的體內(nèi)過程研究提供了新的思路和研究方法。

楊旭等[7]以紅霉素-D6為內(nèi)標(biāo)，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對血漿中琥乙紅霉素及其活性代謝產(chǎn)物紅霉素進(jìn)行了同時(shí)測定，并在比格犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究中也進(jìn)行了應(yīng)用，血漿中琥乙紅霉素及紅霉素的定量下限分別為4、2 ng/mL。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)

有定量蛋白質(zhì)組學(xué)“化學(xué)標(biāo)簽”之稱的穩(wěn)定同位素(如2H、13C、15N和18O)標(biāo)記的多肽及氨基酸，在生物樣品的測試及示蹤等領(lǐng)域的應(yīng)用愈加普遍。由于穩(wěn)定同位素特異肽段的理化性質(zhì)與目標(biāo)肽段完全一致，因此其色譜-質(zhì)譜行為也一致，能有效校正由復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)可能引起的檢測響應(yīng)值的波動。

杜鵑等[8]采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法，對乳清蛋白粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)行了測定，使用同位素特異肽VGI*NYWL*AHK和I*DAL*NENK作為內(nèi)標(biāo)，在預(yù)處理之前加到被測樣品中。試驗(yàn)結(jié)果表明，選用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段不但能降低基質(zhì)效應(yīng)，還能校正樣品前處理過程的誤差。

胡蓓等[9]以同位素內(nèi)標(biāo)肽LSQSKVL*PV*PQK(L*：Leu-OH-13C6，15N；V*：Val-OH-13C5，15N)做內(nèi)標(biāo)，對嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量進(jìn)行了定量分析，該方法的定量下限可達(dá)10 mg/kg。

任文華等[10]以13C、氘標(biāo)記糖化賴氨酸及賴氨酸為內(nèi)標(biāo)，對血清糖化白蛋白進(jìn)行測定。該方法在相關(guān)性、精密度、正確性等方面都優(yōu)于常規(guī)酶法，被推薦為我國糖化白蛋白測定的候選參考方法。

李佳樂等[11]采用13C5-脯氨酸、13C9-苯丙氨酸、13C5-纈氨酸為內(nèi)標(biāo)，對人血清白蛋白純品含量采用超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜(HPLC-IDMS)測定。該方法作為純品人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法，對保證臨床檢驗(yàn)中測定結(jié)果的量值溯源性具有重要的意義。

沈蕾等[12]以13C5-纈氨酸、13C9,15N-苯丙氨酸為內(nèi)標(biāo)，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，成功實(shí)現(xiàn)人重組蛋白胱抑素C的準(zhǔn)確定量。

齊開倫等[13]以同位素標(biāo)記肽段做內(nèi)標(biāo)，對雞蛋中3種主要致敏蛋白溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白進(jìn)行了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。該方法用于測定烘焙食品中3種致敏蛋白，其定量限為0.4～10.0 μg/g。所使用的同位素標(biāo)記特異肽段分別為：HG[13C-15N-L]DNYR、FESN[13C-15N-F]NTQATNR、GTDVQAW[13C-15N-I]R、KDSN[13C-15N-V]NWN-NLK、Y[13C-15N-F]GYTG-ALR、[13C-15N-I]RDLLER、AFKDEDTQAMP[13C-15N-F]R、LTEWTSSN[13C-15N-V]MEER、ISQA[13C-15N-V]HAAHAEINEAGR。

2 穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

目前，以穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑為內(nèi)標(biāo)的同位素稀釋質(zhì)譜法已廣泛應(yīng)用于環(huán)境中抗生素殘留、揮發(fā)性有機(jī)物、環(huán)境激素等的檢測及相關(guān)研究；同時(shí)，由于同位素稀釋質(zhì)譜法在檢測中的優(yōu)勢作用，我國針對環(huán)境中有害物質(zhì)的檢測所發(fā)布的一系列標(biāo)準(zhǔn)，越來越傾向于采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑做內(nèi)標(biāo)。

2.1 環(huán)境檢測研究

陳磊等[14]以穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)，采用QuEChERS前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對土壤中19種氟喹諾酮類抗生素殘留進(jìn)行快速測定，方法檢出限為0.2～1.0 μg/kg，操作簡單，準(zhǔn)確度高。

趙超群等[15]以磺胺地索辛-D6、磺胺喹噁啉-13C6、磺胺甲基嘧啶-13C6、磺胺甲噁唑-D4為內(nèi)標(biāo)，采用固相萃取凈化富集結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對飲用水中17種磺胺類藥物殘留進(jìn)行定量分析，17種磺胺類藥物的定量限均低于0.025 3 μg/L。

曾玉珠等[16]采用固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，測定了4種不同水體(地表水、廢水、飲用水源水及生活用水)中6種環(huán)境激素類污染物——雌三醇、17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、雌酮、炔雌醇、己烯雌酚的含量。該方法采用雌三醇-D3、17-β-雌二醇-D2、己烯雌酚-D8做內(nèi)標(biāo)，多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行分析，方法的定量限為1.08～1.78 ng/L。

劉星等[17]采用13C標(biāo)記PCB28、PCB111、PCB178、PCB141做內(nèi)標(biāo)，利用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法，建立了海洋沉積物中28種痕量多氯聯(lián)苯的檢測方法，方法的線性范圍為0.1～50 ng/mL，定量范圍為0.009～0.052 μg/kg，方法的靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)。

秦威振等[18]建立了室內(nèi)灰塵中5種有機(jī)磷酸酯阻燃劑的定量分析方法。該方法使用穩(wěn)定同位素氘標(biāo)記有機(jī)磷酸酯做內(nèi)標(biāo)，通過超聲輔助提取，同時(shí)結(jié)合固相萃取的方式進(jìn)行樣品的前處理，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測，方法的檢出限為1.8～36.0 ng/g，定量限為5.9～120.0 ng/g，所使用同位素內(nèi)標(biāo)分別為磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯-D15、磷酸三(2-氯丙基)酯-D18、磷酸三苯酯-D15等。

2.2 環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)

目前，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境中有害物質(zhì)的檢測，我國針對水質(zhì)、土壤、固體廢物、空氣中有害物質(zhì)的檢測也發(fā)布了一系列的環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)。近幾年應(yīng)用同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行有害物質(zhì)檢測的環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)匯總見表1。

表1 應(yīng)用同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行有害物質(zhì)檢測的環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)匯總

3 穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用

在食品安全領(lǐng)域，穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑主要應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留檢測，非法及濫用添加劑、遷移污染物、毒素等的檢測。杜曉寧等[36]對同位素稀釋質(zhì)譜法在食品中有害物質(zhì)檢測的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，并介紹了其在檢測以及國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用情況。

廖朝選等[37]采用同位素稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對豆制品中16種喹諾酮類藥物殘留進(jìn)行了測定。該方法使用的同位素內(nèi)標(biāo)有諾氟沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、恩諾沙星-D5，16種喹諾酮類藥物的檢出限為0.5 μg/kg，平均回收率為80.7%～107.1%。

邱福保等[38]使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對谷物制品中18種真菌毒素進(jìn)行了檢測，方法的檢出限和定量限分別為0.03～4 μg/kg和0.25～15 μg/kg，所使用的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑分別為U-[13C17]-黃曲霉毒素B1、U-[13C17]-黃曲霉毒素B2、U-[13C17]-黃曲霉毒素G1、U-[13C17]-黃曲霉毒素G2、U-[13C17]-黃曲霉毒素M1、U-[13C20]-赭曲霉毒素A、U-[13C34]-伏馬毒素B2、U-[13C34]-伏馬毒素B3、U-[13C24]-T-毒素、U-[13C22]-HT-2毒素、U-[13C34]-伏馬毒素B1、U-[13C15]-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、U-[13C15]-3-乙?；撗跹└牭毒┐?、U-[13C15]-瓜萎鐮刀菌烯醇、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮。

韓超等[39]采用同位素稀釋氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，測定了動物源食品中克霉唑殘留量。該方法使用克霉唑-D5做內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，校正了目標(biāo)物的損失，提高了測量結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，保證方法有較好的回收率和精密度。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，定量限為2.0 μg/kg，回收率為82.6%～116.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～13.5%，能夠滿足豬肉、雞肉、牛肉、魚肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎中克霉唑殘留量的確證和定量分析，為保障食品安全提供技術(shù)支持。

廖艷華等[40]以氘代甲醛DNPH-3,5,6-D3為內(nèi)標(biāo)建立了測定水產(chǎn)品中甲醛的檢測方法，方法的檢出限為1.0 μg/kg。

王艷等[41]建立了奶粉及保健食品中左旋肉堿含量的檢測方法。該方法以左旋肉堿-D3為內(nèi)標(biāo)，樣品經(jīng)溶解、蛋白沉淀、超聲提取、離心、過濾后，采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法進(jìn)行測定，使用同位素內(nèi)標(biāo)避免了外標(biāo)法定量時(shí)基質(zhì)的干擾，方法的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg。

毛思浩等[43]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)結(jié)合全自動固相萃取技術(shù)，測定了蜂蜜中4種硝基呋喃代謝物。該方法以AMOZ-D5、AHD-13C3、AOZ-D4、SEM-15N213C1為內(nèi)標(biāo)定量，方法檢出限為0.04～0.08 μg/kg，在0.25、1.25、2.50 μg/kg水平進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，平均回收率為100.6%～102.3%。

4 展望

由于同位素稀釋質(zhì)譜法在痕量分析中消除基質(zhì)干擾方面具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢，在檢測及科研中的應(yīng)用日益廣泛，對內(nèi)標(biāo)試劑的需求也隨之飛速增長，目前國內(nèi)檢測及科研中所使用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑大多數(shù)從國外進(jìn)口。隨著我國對科研用高端試劑的日益重視，越來越多的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑將進(jìn)入市場，助力我國生物醫(yī)藥、環(huán)境科學(xué)、食品安全等領(lǐng)域的科研及檢測工作。