裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位移植模型的建立

王卓，趙若琳，張立波

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，江蘇 南京 211198)

腦膠質(zhì)瘤(glioma) 是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，約占所有惡性腦腫瘤的80%,具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高和治愈率低等特點(diǎn)。目前膠質(zhì)瘤的治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療為主的綜合治療[1-2]。為了研究腦膠質(zhì)瘤生長、轉(zhuǎn)移及治療情況，通常采用動物腫瘤移植瘤模型和人腫瘤異體移植模型，腫瘤移植部位主要在皮下。然而，皮下移植瘤模型并不能模仿人腦膠質(zhì)瘤的生長環(huán)境及發(fā)生發(fā)展過程，也不能充分反映藥物的特性和療效。另外，常見的腦膠質(zhì)瘤模型通常需要處死荷瘤小鼠，這樣不能實(shí)時且準(zhǔn)確地反映腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長狀況。因此，需要建立理想的、可靠的、重復(fù)性好的腦原位膠質(zhì)瘤動物模型，以研究膠質(zhì)瘤顱內(nèi)生長特征及治療方法。

本文擬利用熒光素酶標(biāo)記的LN229膠質(zhì)瘤細(xì)胞，建立腦膠質(zhì)瘤原位移植瘤動物模型，并通過動物活體成像技術(shù)觀察腦膠質(zhì)瘤在裸鼠體內(nèi)的生長情況[3]。通過精細(xì)的術(shù)前準(zhǔn)備和術(shù)后護(hù)理技術(shù)，保證裸鼠顱內(nèi)原位接種手術(shù)成功，確保裸鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞原位移植模型的成功率及存活率，為膠質(zhì)瘤臨床研究提供理想的動物模型[4-5]，也為驗(yàn)證化合物的抗腦膠質(zhì)瘤作用提供有效而直觀的評價方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級BALB/c Nude小鼠，4～5周齡，雌性，9只，平均體重16～18 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0001。小鼠飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)新藥安全評價研究中心[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0019]，飼養(yǎng)室溫度：20～26 ℃，濕度：40%～70%；飼喂SPF級大小鼠生長維持飼料,自由攝取;飲水為實(shí)驗(yàn)動物飲用水,飲水瓶裝，自由攝取，飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，根據(jù)墊料情況不定期更換。

1.2 藥品與試劑 LN229-Luc細(xì)胞、熒光素酶底物均購自南京安米絡(luò)生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 小動物活體成像儀(美國PerkinElmer公司，型號：IVIS Spectrum)；二氧化碳培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號：3111]；全封閉組織脫水機(jī)(Saukura，型號：VIPTM5)；半自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號：美康HM340E]；全自動染色機(jī)(Saukura，型號：DRS2000)；正置生物顯微鏡(Olympus，型號：BX41)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 LN229-Luc細(xì)胞的培養(yǎng) T25培養(yǎng)瓶復(fù)蘇培養(yǎng)，生長一代后，傳代10 cm皿中，并加入puromycin(3 μg·mL-1) 進(jìn)行培養(yǎng)，對數(shù)生長期的LN229-Luc細(xì)胞計數(shù)后，取5 μL(10萬個細(xì)胞)進(jìn)行顱內(nèi)注射。

2.2 BALB/c Nude小鼠腦原位接種手術(shù)術(shù)前準(zhǔn)備 手術(shù)前將房間進(jìn)行紫外線照射消毒，手術(shù)物品提前高壓滅菌后放入超凈工作臺，不能滅菌的物品，如碘伏、莫匹羅星、縫合線、人工石蠟、保溫墊等酒精噴灑后經(jīng)傳遞窗紫外燈消毒后使用，將手術(shù)需要的物品及調(diào)試好的立體定位儀，一起放入超凈工作臺，手術(shù)前打開超凈工作臺的紫外燈照射15 min進(jìn)行消毒。

2.3 BALB/c Nude小鼠腦原位移植瘤模型的建立 收集LN229-Luc細(xì)胞，接種于裸鼠腦右側(cè)尾狀核區(qū)。手術(shù)前一天，將裸鼠禁食，手術(shù)當(dāng)天，裸鼠稱重麻醉后，放在保溫墊上，頭部固定于立體定位儀上，用碘伏對頭部進(jìn)行消毒后，按照矢狀中線位置縱向切開皮膚，切口長度約1 cm，根據(jù)立體定位儀解剖圖譜確定對應(yīng)于右側(cè)尾狀核的位置：前囟點(diǎn)前1.0 mm，中線右1.0 mm，深度為硬膜下3.0 mm，以顱骨鉆鉆孔，勿損傷硬腦膜。使用10 μL微量注射器吸入5 μL含1×105LN229-Luc細(xì)胞懸液，注射細(xì)胞懸液3 min，留針2 min，鉆孔用人工石蠟封閉，用5號線縫合，切口涂莫匹羅星以防術(shù)后感染。

圖1 裸鼠顱內(nèi)LN229-Luc細(xì)胞原位接種系統(tǒng)

2.4 術(shù)后護(hù)理 裸鼠蘇醒后放入新更換的IVC鼠盒，并給予適當(dāng)保溫，每天觀察小鼠狀態(tài)，碘伏擦拭傷口，涂莫匹羅星，連續(xù)3 d，整個過程動作輕柔，保證充足的飲水和飼料。

2.5 檢測指標(biāo)

2.5.1 小動物活體成像觀察 荷瘤小鼠腹腔注射熒光素底物(150 mg·kg-1)，異氟烷麻醉5 min 后，放入小動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。裸鼠于腦內(nèi)接種后Day14、Day21、Day28、Day35、Day42進(jìn)行小動物活體成像檢查，監(jiān)測腦內(nèi)原位接種腫瘤生長情況。

2.5.2 體重變化觀察 接種前稱重一次，之后每周稱量一次，觀察體重變化。

2.5.3 BALB/c Nude小鼠原位移植瘤的病理形態(tài)學(xué)觀察 裸鼠于術(shù)后第42天活體成像監(jiān)測后進(jìn)行安樂死，解剖取出整個腦組織于福爾馬林中固定，HE染色后，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，觀察腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)及生長情況等。

3 結(jié)果

3.1 原位移植瘤模型小鼠觀察 BALB/c Nude小鼠腦內(nèi)原位接種LN229-Luc細(xì)胞14 d后，多數(shù)小鼠出現(xiàn)明顯的顱內(nèi)高壓癥狀，表現(xiàn)為食欲不振、精神萎靡、活動減退，體重下降明顯。接種21 d，裸鼠開始出現(xiàn)消瘦、弓背、膚色變暗，出現(xiàn)晚期癌癥患者的惡質(zhì)化現(xiàn)象。并于接種35 d后，小鼠開始出現(xiàn)死亡，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共死亡4只，其余大部分荷瘤鼠狀態(tài)欠佳。接種42 d，熒光信號達(dá)到最強(qiáng)，隨熒光信號逐漸增強(qiáng)，腫瘤體積迅速增長。

3.2 體重變化 圖2結(jié)果顯示，BALB/c Nude小鼠腦內(nèi)接種LN229-Luc細(xì)胞至21 d，體重呈現(xiàn)輕微的上升的趨勢；隨著時間延長，體重下降明顯。

圖2 荷瘤小鼠體重變化

3.3 活體成像結(jié)果 圖3顯示，通過活體成像系統(tǒng)觀察到BALB/c Nude小鼠腦內(nèi)原位接種LN229-Luc細(xì)胞第14天(Day14)具有明顯的熒光信號，隨著時間延長，裸鼠的熒光值逐漸增加，熒光信號逐漸增強(qiáng)，提示隨著時間的延長，腫瘤逐漸增大。結(jié)果說明裸鼠原位移植瘤模型建立成功。荷瘤小鼠每周活體成像結(jié)果(熒光信號值)見表1。

表1 熒光信號值數(shù)據(jù)

圖3 荷瘤小鼠活體成像圖片

3.4 腦膠質(zhì)瘤病理形態(tài)組織學(xué)觀察 大體形態(tài)觀察腫瘤呈橢圓形、梨形，大腦半球中部，邊界輪廓稍模糊，切開后腫瘤為實(shí)質(zhì)性，可見血塊。鏡下觀察腫瘤占據(jù)右側(cè)腦大部分(見圖4A、B)，與正常腦組織分界明顯(見圖4C)；膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長活躍，呈假柵欄狀或珊瑚狀排列，密集成群，并向正常腦組織浸潤生長(見圖4D)?？梢娔[瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形、橢圓形、柱狀、多角形、不規(guī)則形狀等，細(xì)胞異型性高，核大，核質(zhì)深染；偶見瘤巨核細(xì)胞，核分裂象明顯(見圖4E)；細(xì)胞無明顯排列方向，間質(zhì)血管豐富，未見炎細(xì)胞浸潤；腫瘤可見出血、腫瘤中心壞死，腫瘤周邊腦組織細(xì)胞輕度水腫(見圖4F)，未見轉(zhuǎn)移。

A.腦膠質(zhì)瘤整體觀HE;B.腦膠質(zhì)瘤整體觀HE;C.腦膠質(zhì)瘤邊界尚清×100 HE;D.腦膠質(zhì)瘤浸潤性生長×100 HE;E.膠質(zhì)瘤細(xì)胞×200 HE;F.腫瘤周邊腦組織細(xì)胞水腫×40HE

4 結(jié)論

近年來腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率逐漸升高，腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究及抗腫瘤藥物的臨床前藥效學(xué)評價通常采用皮下移植瘤模型，因?yàn)檠X屏障的緣故，該模型不能準(zhǔn)確評價藥物的抗腦瘤作用，也不能有效反映體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展，如血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移。隨著影像技術(shù)的發(fā)展，原位移植瘤模型已逐漸用于評價能透過血腦屏障的抗腫瘤藥物。在本研究中，荷瘤小鼠通過小動物活體成像實(shí)時監(jiān)測腫瘤生長情況。小動物活體成像技術(shù)是近期發(fā)展起來的一種新型影像檢測技術(shù)，是檢測動物體內(nèi)分子及細(xì)胞事件的強(qiáng)有力手段。利用生物發(fā)光成像(BLI) 可以對活體病灶的大小進(jìn)行無損傷直觀準(zhǔn)確檢測[6]，具有極高的檢測靈敏度。生物發(fā)光優(yōu)點(diǎn)在于安全、實(shí)時、準(zhǔn)確，為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程和抗腫瘤藥效動物實(shí)驗(yàn)提供了科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)[7]。因此被廣泛用于腫瘤轉(zhuǎn)移、基因治療、干細(xì)胞示蹤等相關(guān)研究[8]。

本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢在于在已有的腦膠質(zhì)瘤原位模型的構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，對接種部位的坐標(biāo)定位及術(shù)后護(hù)理進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。將LN229-Luc細(xì)胞接種于BALB/c Nude小鼠大腦右側(cè)尾狀核，坐標(biāo)為前囟點(diǎn)前1.0 mm，中線右1.0 mm，深度為硬膜下3.0 mm，選擇此注射點(diǎn)目的是保證將LN229-Luc細(xì)胞準(zhǔn)確的移植到尾狀核內(nèi)，從而保證腫瘤的生長，本研究中9只裸鼠造模后全部成瘤，成功率100%；結(jié)合精細(xì)的術(shù)后護(hù)理，存活率100%。顱內(nèi)腫瘤生長穩(wěn)定，荷瘤裸鼠體重在早期呈現(xiàn)輕微的上升的趨勢，但是裸鼠在接種21 d后，體重下降明顯；同時，從小動物活體成像結(jié)果看出，裸鼠接種21 d后，腫瘤的體積開始迅速增長。HE染色可觀察到膠質(zhì)瘤呈假柵欄狀或珊瑚狀排列，密集成群，并向正常腦組織浸潤生長，膠質(zhì)瘤瘤細(xì)胞生長活躍，異型性明顯，其生長特性和病理特性與人腦膠質(zhì)瘤相似。本實(shí)驗(yàn)9只裸鼠均于接種LN229-Luc細(xì)胞后14 d即可見腦膠質(zhì)瘤形成，隨后腫瘤生長明顯加快，21 d時，裸鼠出現(xiàn)消瘦、弓背、激惹、癲癇等神經(jīng)癥狀，35 d后開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡。

本實(shí)驗(yàn)建立的裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位移植模型較已有模型小鼠存活率和成瘤率高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，是一種研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、探索各種實(shí)驗(yàn)性治療方法以及抗腫瘤藥的藥效學(xué)評價理想的動物模型。