急性冠狀動脈綜合征患者外周血中CD45RA+調(diào)節(jié)性T細胞表達與血清脂蛋白(a)水平的相關(guān)性研究

呂彩霞 邵偉華 姚麗霞 王素星 趙景茹 霍甜甜 張飛飛 苑曉燁 張明明

052260 石家莊，河北省人民醫(yī)院老年病科(呂彩霞、邵偉華、姚麗霞、王素星、苑曉燁)，神經(jīng)內(nèi)科(趙景茹、霍甜甜)，心內(nèi)科(張飛飛)，檢驗科(張明明)

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的基本病理生理機制為不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊形成。近來研究認為免疫和炎癥是斑塊不穩(wěn)定的重要原因之一[1]。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)因其抗炎作用在動脈粥樣硬化斑塊的進展中發(fā)揮重要作用[2]，既往在ACS患者中發(fā)現(xiàn)Tregs減少及功能缺陷[3]。血清脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]是一類受遺傳調(diào)控的脂蛋白顆粒[4]，被認為是冠心病的獨立危險因素之一[5-8]；Lp(a)除促動脈粥樣硬化外，還具有促炎作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)Lp(a)參與動脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應(yīng)[9]。因此，本研究通過探討在ACS患者中血清Lp(a)水平與Tregs及其介導(dǎo)的免疫炎癥的相關(guān)性，旨在為Lp(a)參與ACS疾病進展提供免疫炎癥方面的可能依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

連續(xù)入選2019年10月至2020年12月在河北省人民醫(yī)院老年病科及心內(nèi)科住院的ACS患者70例，其中男性48例，女性22例，年齡60～75歲，平均(65.2±1.05)歲。入選標準：ACS根據(jù)《2015中國急診急性冠狀動脈綜合征臨床實踐指南》[10]中的診斷標準，包括不穩(wěn)定性心絞痛，非ST段抬高型心肌梗死和ST段抬高型心肌梗死。所有患者均行冠狀動脈造影或冠狀動脈CT檢查。排除標準：(1)合并其他炎癥性疾病、感染、惡性腫瘤或免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)異常者；(2)正在服用除阿司匹林以外的其他抗炎藥物者；(3)陳舊性心肌梗死及冠狀動脈支架置入術(shù)后者；(4)未檢測Lp(a)；(5)射血分數(shù)<40%；(6)年齡>75歲。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(倫理批號：2017科倫審第09號)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料采集 收集并記錄入選患者的性別、年齡、個人史、既往史、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)，冠狀動脈造影或冠狀動脈CT結(jié)果，以及入院24 h內(nèi)空腹抽血檢測的生化指標結(jié)果，包括糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、高敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和Lp(a)。根據(jù)《中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版)》[11]，以血清Lp(a)水平是否>300 mg/L為切點，分為Lp(a)正常組44例和Lp(a)升高組26例。

1.2.2 CD45RA+Tregs及相關(guān)炎癥指標的檢測 所有研究對象均于入院24 h內(nèi)自肘靜脈抽取外周靜脈血10 ml，肝素抗凝，將上層分離血漿保存于-80℃冰箱用于細胞因子檢測，下層細胞用人淋巴細胞分離液按Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)，用于CD45RA+Tregs檢測。

流式細胞術(shù)檢測各組外周血中CD4+T細胞、CD4+CD25+T細胞與CD45RA+Tregs亞群的表達。上述PBMCs用1640培養(yǎng)液孵育于37℃培養(yǎng)箱中過夜，貼壁去除單核巨噬細胞。取細胞懸浮液進行流式免疫熒光抗體(均購于美國eBioscience公司)標記，用FITC-CD4單克隆抗體、PE-CD25單克隆抗體及APC-CD45RA單克隆抗體于4℃避光孵育30 min，PBS洗滌，流式細胞儀(BD FACS檢測儀)檢測各細胞亞群比例。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清中Tregs相關(guān)細胞因子及炎癥細胞因子含量。取上述血漿依據(jù)試劑盒(均購于中國欣博盛生物有限公司)說明及要求分別檢測細胞因子白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量。最小可檢測人IL-10達1 pg/ml，TGF-β1達15 pg/ml與TNF-α達5 pg/ml。板內(nèi)及板間變異系數(shù)均<5%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

與Lp(a)正常組相比，Lp(a)升高組患者的hs-CRP水平明顯升高(5.59 mg/L比4.31 mg/L，P=0.006)，病程明顯延長(19年比12年，P=0.006)；兩組患者的性別、年齡、三支血管病變比例、吸煙、飲酒、高血壓患病率、BMI、HbA1c、TG、TC和LDL-C水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.2 兩組外周血Tregs的表達差異

如表1所示，兩組外周血CD4+T細胞和CD4+CD25+T細胞水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；而Lp(a)升高組CD45RA+Tregs細胞表達較Lp(a)正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.040)。

表1 兩組外周血Tregs的表達水平比較

2.3 兩組外周血細胞因子的水平比較

如表2所示，與Lp(a)正常組相比，Lp(a)升高組患者外周血中抗炎細胞因子IL-10含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1的含量在兩組患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Lp(a)升高組患者外周血中致炎細胞因子TNF-α的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041)。

表2 兩組外周血中相關(guān)細胞因子的水平比較

2.4 Lp(a)與CD45RA+Tregs細胞、炎癥指標及細胞因子的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，血清Lp(a)水平與CD45RA+Tregs(r=-0.400，P=0.043)和IL-10(r=-0.361，P=0.031)的表達呈負相關(guān)，與TNF-α(r=0.426，P=0.037)和hs-CRP(r=0.412，P=0.048)的表達呈正相關(guān)，與TGF-β1的表達無明顯相關(guān)性(r=-0.217，P=0.073)。

3 討論

ACS是心血管系統(tǒng)急危重癥，嚴重威脅人類生命健康。盡管目前經(jīng)過生活方式干預(yù)、藥物治療及血運重建等現(xiàn)代治療，仍有部分冠心病患者進展為ACS，因此在ACS的防控中，關(guān)注殘余心血管風(fēng)險是今后的重要研究方向之一[12-13]。

其中Lp(a)是殘余心血管風(fēng)險中研究及關(guān)注的熱點之一。Lp(a)是一種在肝臟產(chǎn)生的致動脈粥樣硬化的脂蛋白，由ApoB100、ApoA及氧化磷脂(oxidized phospholipids，OxPL)組合而成，Lp(a)水平不受飲食及運動的影響[8]。大量流行病學(xué)證據(jù)顯示，Lp(a)與冠心病、主動脈瓣膜鈣化等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[14]。Lp(a)主要通過促動脈粥樣硬化、促血栓形成及促炎介導(dǎo)冠狀動脈斑塊的進展[8]。Lp(a)升高的患者中冠狀動脈血管仍呈現(xiàn)高炎癥狀態(tài)[9]。在Lp(a)升高的受試者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)較多的致炎因子，另一方面卻發(fā)現(xiàn)具有抗炎作用的細胞因子明顯減少[15]。基于上述研究結(jié)果，我們推測Lp(a)的升高可能與冠心病患者體內(nèi)的免疫反應(yīng)失衡相關(guān)。

在介導(dǎo)免疫平衡的眾多機制中，Tregs因具有免疫調(diào)節(jié)功能而備受關(guān)注，其通過細胞間接觸及分泌細胞因子發(fā)揮免疫抑制作用[16]。大量研究表明，Tregs參與了動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生及發(fā)展，在冠心病特別是ACS患者中，Tregs的表達數(shù)量減少及免疫抑制功能明顯降低。其中，CD45RA+Tregs稱為“初始Treg(na?ve Treg)”，CD45RA的表達差異可能因先天性胸腺產(chǎn)生過程中的差異，也可能是后天接受抗原的長期刺激而改變，普遍認為CD45RA的表達變化是衡量人群潛在免疫功能的重要指標之一[17]。最近研究表明，表達CD45RA的Tregs能較穩(wěn)定發(fā)揮免疫抑制功能，既往我們在ACS患者中發(fā)現(xiàn)CD45RA+Tregs的減少，導(dǎo)致了ACS患者體內(nèi)免疫失衡進而參與疾病的進展[18]；然而在ACS患者體內(nèi)誘導(dǎo)CD45RA+Tregs減少的原因尚不得而知，因此本研究旨在篩查誘導(dǎo)ACS患者CD45RA+Tregs減少的危險因素，特別是非傳統(tǒng)危險因素，為未來更深入研究提供方向。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Lp(a)升高的ACS患者體內(nèi)，CD45RA+Tregs的表達較Lp(a)正常的患者明顯減少，表明Lp(a)可能介導(dǎo)ACS患者體內(nèi)的CD45RA+Tregs的減少，我們推測Lp(a)中的OxPL通過誘導(dǎo)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)進而使CD45RA+Tregs消耗性減少。進一步觀察Treg相關(guān)細胞因子IL-10、TGF-β1的變化發(fā)現(xiàn)，Lp(a)的升高與IL-10減少相關(guān)，這與既往的研究結(jié)果一致。IL-10、TGF-β1是Tregs分泌的具有抗炎作用的細胞因子[19]，我們認為是升高的Lp(a)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過度進而導(dǎo)致抗炎因子的消耗過多。因此進一步驗證發(fā)現(xiàn)，在高Lp(a)的ACS患者體內(nèi)致炎細胞因子TNF-α的表達含量升高，同時檢測非特異性炎癥指標hs-CRP發(fā)現(xiàn)，Lp(a)與hs-CRP呈正相關(guān)。hs-CRP具有促進單核細胞釋放炎性介質(zhì)的作用，如TNF-α等，能促進單核巨噬細胞的吞噬功能，直接或間接促進血栓形成，從而促進冠心病的發(fā)展[1]。以上表明Lp(a)升高伴隨ACS患者體內(nèi)的高炎癥狀態(tài)，結(jié)合既往研究中Lp(a)可刺激冠狀動脈內(nèi)皮細胞的促炎反應(yīng)，滅活一氧化氮，誘導(dǎo)免疫細胞的促炎基因表達和致炎基因凋亡，所有這些特性都加劇了動脈粥樣硬化病變的失穩(wěn)[15]。這與我們研究中發(fā)現(xiàn)的Lp(a)升高的患者中存在免疫炎癥失衡理論上相一致。

本研究不足：本研究所受影響因素較多，其中的混淆因素并未得到很好糾正；另外，本研究樣本量偏少，且尚缺乏患者入院前用藥信息，無法完全排除患者用藥對Lp(a)的影響；即便如此，我們?nèi)钥梢钥吹絃p(a)與CD45RA+Tregs及相關(guān)炎癥水平存在相關(guān)性。

綜上所述，我們推測Lp(a)與ACS患者體內(nèi)的免疫炎癥失衡相關(guān)，然而關(guān)于Lp(a)如何參與炎癥反應(yīng)機制尚不十分明確，仍需進一步探討。本研究發(fā)現(xiàn)，Lp(a)可能介導(dǎo)ACS患者體內(nèi)發(fā)揮免疫抑制作用的CD45RA+Tregs表達減少，為Lp(a)調(diào)控ACS中免疫炎癥反應(yīng)提供研究方向；但目前尚無靶向降低Lp(a)的藥物應(yīng)用于臨床，靶向干預(yù)Lp(a)的RNAi藥物正處于臨床試驗階段，因此未來對于Lp(a)的探索可能會更加深刻。

利益沖突：無