利用全基因組重測序技術(shù)鑒定五指山豬GHR突變體轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)

魏強(qiáng)，奧巖，楊漫漫，陳濤，韓虎，張興舉，王然，夏秋菊，姜芳芳，李勇

利用全基因組重測序技術(shù)鑒定五指山豬突變體轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)

魏強(qiáng)1,2，奧巖3，楊漫漫1,2，陳濤1,2，韓虎1,2，張興舉1,2，王然1,2，夏秋菊1，姜芳芳1,2，李勇1,2

1. 深圳市華大農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究院，深圳 518120 2. 深圳華大生命科學(xué)研究院，深圳市動(dòng)物基因組輔助育種工程實(shí)驗(yàn)室，深圳 518083 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)及其側(cè)翼序列的分子特征對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品系培育和生物安全評(píng)價(jià)至關(guān)重要。(growth hormone receptor)顯性抑制突變體轉(zhuǎn)基因豬(T274)是本實(shí)驗(yàn)室前期制備的一種表型顯著的矮小癥模型，目前已形成了多世代群體，但該模型中外源突變體的插入位點(diǎn)尚未鑒定。本研究利用BGI-seq500測序平臺(tái)，對(duì)T274轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行全基因組重測序，獲得超過289 Gb的數(shù)據(jù)(106×)。以轉(zhuǎn)基因載體和豬基因組序列作為參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得該外源突變體的插入位點(diǎn)，并利用PCR擴(kuò)增和Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。所有的分析數(shù)據(jù)都支持外源顯性抑制突變體插入在五指山豬1號(hào)染色體269,513,538～269,514,371之間。序列保守性及功能元件分析表明，該插入位點(diǎn)可能位于轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的基因間區(qū)域。不同世代個(gè)體的7種組織中該外源突變體的表達(dá)水平和表達(dá)一致性都較高，說明該插入位點(diǎn)可以作為一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)基因“友好位點(diǎn)”。本研究表明全基因組重測序技術(shù)可以高效的鑒定轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)，該插入位點(diǎn)的獲得為后期轉(zhuǎn)基因豬新品系的培育奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為行業(yè)提供了一個(gè)可靠的基因組定點(diǎn)整合位點(diǎn)。

轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)；全基因組重測序；轉(zhuǎn)基因豬；遺傳穩(wěn)定性

轉(zhuǎn)基因是利用分子生物學(xué)方法將感興趣的目標(biāo)外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，且該外源基因能在宿主基因組中穩(wěn)定表達(dá)并遺傳給下一代，利用該方法獲得的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。自20世紀(jì)80年代以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了快速發(fā)展，目前已經(jīng)獲得了包括豬在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[1]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要用于基因功能研究，重要蛋白質(zhì)生產(chǎn)，人類疾病動(dòng)物模型制備等方面[2]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)于家畜品種改良、動(dòng)物疾病模型創(chuàng)制以及異種器官移植等方面的發(fā)展具有重要的推動(dòng)作用[3]。家豬()在遺傳、解剖和生理方面同人類有許多相似之處，被認(rèn)為是異種器官移植的合適供體，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制的疾病模型在人類疾病的治療中具有十分重要的作用[4]。此外，在農(nóng)業(yè)育種實(shí)踐中，由于傳統(tǒng)的家豬育種存在周期長、遺傳資源有限等弊端，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以快速突破物種限制，創(chuàng)制并培育符合人類健康需求的新品種(系)[5]。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雖然為解決這些問題提供了有效方法，但仍存在許多問題，其中外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)是最主要的制約因素之一，亟需開發(fā)更多轉(zhuǎn)基因友好位點(diǎn)來解決這方面的問題。轉(zhuǎn)基因友好位點(diǎn)是指在基因組中某些沒有特定生理功能的DNA序列，其缺失和插入外源基因都不會(huì)對(duì)周圍的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)產(chǎn)生影響，且可以保障外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)[6]。為了避免干擾內(nèi)源基因正常表達(dá)，理想的轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)應(yīng)該位于基因間區(qū)，且周圍序列處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)。在家豬基因組中，常見的友好位點(diǎn)包括等[7～9]，然而在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備過程中，外源基因的插入大多以隨機(jī)整合的方式進(jìn)行，而這類隨機(jī)整合常常導(dǎo)致表達(dá)的不可預(yù)測性和表型的不穩(wěn)定性[10]。因此，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中，很重要的一項(xiàng)工作就是鑒定外源基因在基因組中的插入位點(diǎn)，然后再根據(jù)插入位點(diǎn)在基因組中位置分布來確定位點(diǎn)整合的規(guī)律。

目前在轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)鑒定研究中，外源基因整合位點(diǎn)鑒定的方法包括熒光原位雜交、反向PCR、半隨機(jī)引物PCR、交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR以及基因組測序方法等[11～14]。近年來，測序技術(shù)已成為解決生物學(xué)問題的熱門技術(shù)，利用全基因測序技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物插入位點(diǎn)的報(bào)道越來越多[15～20]。盡管如此，利用全基因組重測序技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因豬插入位點(diǎn)尚未見報(bào)道。

本研究對(duì)手工克隆(handmade cloning, HMC)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因五指山豬進(jìn)行了全基因組重測序，經(jīng)過序列比對(duì)與分析，獲得了外源基因的插入位點(diǎn)(五指山豬1號(hào)染色體269,513,538～269,514,371之間)；并發(fā)現(xiàn)在F1、F2代中該位點(diǎn)可以穩(wěn)定遺傳、穩(wěn)定表達(dá)，提示該位點(diǎn)是一個(gè)潛在轉(zhuǎn)基因友好位點(diǎn)。對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行鑒定、穩(wěn)定性表達(dá)研究，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育及應(yīng)用具有一定的推動(dòng)作用。

1 材料和方法

1.1 樣本及基因組測序

顯性抑制突變體(dominant-negativemutation,GHR)轉(zhuǎn)基因豬(T274)是本實(shí)驗(yàn)室前期制備的1頭表型顯著的矮小癥模型豬，其簡要制備方法如下：構(gòu)建pCAG-GHR-IRES--neo載體，轉(zhuǎn)染到雄性五指山豬胎兒成纖維細(xì)胞系，用G418篩選出單克隆并進(jìn)行傳代、鑒定和保存。利用手工克隆技術(shù)，將去核的卵母細(xì)胞胞質(zhì)體與陽性細(xì)胞進(jìn)行融合，培養(yǎng)5～6 d后的重構(gòu)胚經(jīng)手術(shù)移植到代孕母豬體內(nèi)，懷孕112 d后分娩，獲得經(jīng)PCR鑒定的陽性個(gè)體。由于該顯性抑制突變體可以與野生競爭結(jié)合體內(nèi)生長激素，抑制生長激素的下游通路，從而使個(gè)體出現(xiàn)矮小的癥狀[21]。后代群體以T274為系祖來構(gòu)建(圖1)，具體方法如下：首先利用T274與野生五指山母豬配種獲得F1代，F(xiàn)1代經(jīng)PCR鑒定獲得陽性留種個(gè)體；隨后利用陽性F1半同胞互配獲得F2代，對(duì)F2代同樣經(jīng)PCR鑒定進(jìn)行選留。

采集T274個(gè)體血液，提取DNA后采用MGIEasyTMDNA文庫制備試劑盒(深圳華大智造科技有限公司)進(jìn)行文庫構(gòu)建，在BGIseq500平臺(tái)進(jìn)行PE100測序。F1代和F2代樣本進(jìn)行DNA提取后 –20℃保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 T274及其后代系譜分析圖

表1 插入位點(diǎn)鑒定引物信息

1.2 插入位置鑒定

將測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾，去除：(1) N堿基含量超過5%的reads；(2)質(zhì)量值低于20且比例超過30%的reads。利用SOAP1.5.0軟件將過濾后的reads與豬參考基因組(sus11.1)進(jìn)行比對(duì)，提取不完全比對(duì)的reads，再比對(duì)到pCAG-GHR載體序列上。提取既能比對(duì)到參考基因組又能比對(duì)到載體上的reads進(jìn)行BLAST分析，確定插入位點(diǎn)的位置。

1.3 插入位點(diǎn)驗(yàn)證

根據(jù)截?cái)鄏eads的比對(duì)模式，結(jié)合其對(duì)應(yīng)的PE reads，對(duì)插入序列進(jìn)行拼接和比對(duì)，并根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)引物用于插入位點(diǎn)的鑒定。引物設(shè)計(jì)的原則是跨拼接區(qū)域：左側(cè)鑒定引物的上游位于參考基因組上，下游位于載體序列上；右側(cè)鑒定引物的上游位于載體序列上，下游位于參考基因組上。引物具體信息見表1。通過瓊脂糖凝膠電泳和Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證，檢測T274及其陽性后代的序列插入情況。

1.4 外源基因的表達(dá)驗(yàn)證

隨機(jī)選取T274后代F1、F2各3頭，提取肝、心、腎、肺、肌肉、睪丸、附睪組織總RNA，利用TIANScript RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過RT-PCR檢測野生型生長激素受體基因(wild type, W)和轉(zhuǎn)入突變型生長激素受體基因(GHR)表達(dá)情況。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物序列和PCR產(chǎn)物大小見表2。

表2 表達(dá)穩(wěn)定性檢測引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組測序結(jié)果

T274經(jīng)過全基因組重測序后，共產(chǎn)生3067.8 Mb reads，通過SOAP1.5.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，獲得clean data 289.5 Gb，Q20為96.85%，Q30為88.16%，結(jié)果顯示測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。通過比對(duì)豬參考基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組比對(duì)率和覆蓋率分別為98.19%和98.53%，GC含量為42.43%，測序深度約為106×。

2.2 插入位點(diǎn)鑒定

根據(jù)與參考基因組和載體的比對(duì)結(jié)果，再結(jié)合BLAST分析，本研究初步確定載體的插入位點(diǎn)位于五指山豬1號(hào)染色體269,513,538～269,514,371之間(圖2A)。根據(jù)截?cái)鄏eads的比對(duì)模式，結(jié)合其對(duì)應(yīng)的PE reads，對(duì)插入后的序列進(jìn)行拼接和比對(duì)(圖2：B，C)，用于后續(xù)分析。

序列分析結(jié)果表明該插入?yún)^(qū)域位于豬(immediate early response 5 like)基因上游57,972 bp處，(chromosome 1homolog)基因下游 294,575 bp處，序列保守性分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域序列保守性較低(圖3)。通過比對(duì)UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/)，發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)與基因之間存在大量的候選順式調(diào)控元件(candidate-regulatory elements, cCREs)，如promoter- like signature、proximal enhancer-like signature、distal enhancer-like signature等，及豐富的表觀修飾標(biāo)記(圖3)。這些結(jié)果說明該區(qū)域是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，有利于外源基因的高效穩(wěn)定表達(dá)。

2.3 插入位點(diǎn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證T274轉(zhuǎn)基因序列的準(zhǔn)確插入位置，本研究在插入位點(diǎn)兩側(cè)各設(shè)計(jì)1對(duì)引物：左側(cè)斷點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物長度459 bp，右側(cè)1732 bp；野生型預(yù)期僅能擴(kuò)增出基因組序列1298 bp (表1)。電泳結(jié)果顯示，T274左右兩側(cè)斷點(diǎn)擴(kuò)增長度與預(yù)期一致，并能夠擴(kuò)增出基因組序列，說明T274是轉(zhuǎn)基因雜合型；野生型個(gè)體未能擴(kuò)增左右兩側(cè)斷點(diǎn)，僅能擴(kuò)增出基因組序列，與預(yù)期一致(圖4A)。隨后，本研究對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行Sanger測序，進(jìn)一步將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該區(qū)域豬基因組發(fā)生834 bp的缺失，載體兩端序列也發(fā)生了部分缺失，其中左側(cè)的基因缺失944 bp，右側(cè)PBR322_ori區(qū)域發(fā)生153 bp的缺失(圖4：B，C)。這些結(jié)果證實(shí)基因組隨機(jī)斷裂和外源基因插入過程中基因組序列和外源載體序列都發(fā)生了部分丟失。

2.4 外源插入片段遺傳穩(wěn)定性分析

為了檢測該插入位點(diǎn)的遺傳穩(wěn)定性，選擇T274的F1代、F2代個(gè)體利用斷點(diǎn)檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中左側(cè)斷點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為459 bp，右側(cè)為1732 bp；野生型為1298 bp (圖5紅色箭頭所示)。電泳結(jié)果顯示，9個(gè)F1代個(gè)體(M103、M116、M131、M150、M151、M167、M169、M171、M172)左、右側(cè)斷點(diǎn)以及野生型檢測引物都可以擴(kuò)增出目標(biāo)片段(圖5)，說明9個(gè)F1個(gè)體都獲得了單等位基因插入。隨后，本研究利用同樣的方法對(duì)10個(gè)F2代個(gè)體(M611、M612、M614、M620、M631、M635、M640、M647、M651、M652)進(jìn)行插入位點(diǎn)檢測。電泳結(jié)果顯示，10個(gè)F2代個(gè)體左側(cè)、右側(cè)斷點(diǎn)以及野生型都能擴(kuò)增出片段(圖5)。所有轉(zhuǎn)基因陽性后代的插入位點(diǎn)均與T274個(gè)體一致，說明該位點(diǎn)插入的外源基因可以穩(wěn)定遺傳。

圖2 跨越基因組與載體融合位置的測序reads

圖3 插入位點(diǎn)周圍區(qū)域序列保守性及功能分析

圖4 轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)左右斷點(diǎn)鑒定及Sanger測序結(jié)果

圖5 T274后代插入位點(diǎn)遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

2.5 插入位點(diǎn)表達(dá)穩(wěn)定性分析

對(duì)插入位點(diǎn)周圍序列分析表明，該位點(diǎn)位于潛在的基因表達(dá)激活區(qū)域，有利于外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)。為了驗(yàn)證外源基因在不同世代、不同組織的表達(dá)穩(wěn)定性，本研究在F1和F2代中隨機(jī)選取雜合子，設(shè)計(jì)RT-PCR引物，檢測內(nèi)源基因(W)和插入基因(GHR)的表達(dá)情況，以作為內(nèi)參，內(nèi)源W作為對(duì)照，擴(kuò)增片段大小分別為243 bp，201 bp和252 bp (圖6，紅色箭頭所示)。結(jié)果顯示，GHR在F1和F2后代的不同組織中均可穩(wěn)定表達(dá)，且GHR的表達(dá)量要高于內(nèi)源W(圖6)，后代個(gè)體的表達(dá)模式與T274類似。本研究結(jié)果與Ji等[19]研究結(jié)果一致。

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家豬新品種培育以及生物醫(yī)學(xué)模型制備等方面應(yīng)用越來越廣泛，特別是近年來與基因編輯技術(shù)的結(jié)合，進(jìn)一步提升了轉(zhuǎn)基因豬的制備效率。然而早期的轉(zhuǎn)基因豬大多是通過顯微注射或轉(zhuǎn)基因克隆方法制備的，這些方法最大的劣勢是插入位置的隨機(jī)性，需要通過后代群體大規(guī)模的篩選才能獲得穩(wěn)定遺傳的種群[22]。因此，插入位點(diǎn)的鑒定是后期轉(zhuǎn)基因新品系培育的關(guān)鍵，同時(shí)友好插入位點(diǎn)的獲得也有利于制備基因編輯介導(dǎo)的定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本研究利用全基因組重測序技術(shù)對(duì)先前研究獲得GHR轉(zhuǎn)基因豬(T274)進(jìn)行插入位點(diǎn)鑒定，在106×測序深度下獲得跨越基因組與載體的reads，說明高深度測序能捕獲跨越斷點(diǎn)的reads來滿足位點(diǎn)鑒定需求。不過從經(jīng)濟(jì)性角度看，可以降低測序深度，一般來說10×以上就足夠鑒定到插入位點(diǎn)，如轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果顯示8×以上測序深度都可以鑒定到插入位點(diǎn)[18,19]。

圖6 GHR突變體在T274個(gè)體后代不同組織的表達(dá)情況

本研究利用比對(duì)reads的序列信息推測斷點(diǎn)區(qū)域的融合序列，并利用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。序列分析結(jié)果顯示該突變體的插入位點(diǎn)位于五指山豬1號(hào)染色體269,513,538～269,514,371之間，該區(qū)域位于豬基因約58 kb上游，屬于基因間區(qū)域，物種間保守性較低。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，插入?yún)^(qū)域基因組序列發(fā)生了834 bp的缺失，而載體兩端的序列也發(fā)生了部分缺失。有趣的是，線性化載體的左側(cè)原核抗性片段基因完全缺失，但保留了完整的外源基因表達(dá)框。這些缺失的形成在轉(zhuǎn)基因小鼠中也很常見[19,23,24]。外源基因的隨機(jī)插入主要是由于某些基因組區(qū)域的雙鏈斷裂(double- strand break, DSB)修復(fù)而形成，修復(fù)的過程會(huì)導(dǎo)致基因組區(qū)域InDel產(chǎn)生和外源基因片段的丟失[25]。此外，表觀遺傳沉默仍然是外源基因表達(dá)抑制的主要因素[26]。Yin等[27]的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的變異受到整合位點(diǎn)的影響，位置效應(yīng)變異可引起表觀遺傳修飾的差異，例如DNA甲基化和組蛋白乙?；Ｒ话銇碚f，原核序列越少插入片段的遺傳穩(wěn)定性越高；此外，插入在富含簡單重復(fù)序列的基因組區(qū)域常常會(huì)導(dǎo)致外源基因的表達(dá)沉默[28]。本研究發(fā)現(xiàn)盡管插入位置的基因組序列保守性較低，但插入?yún)^(qū)域周圍50 kb的基因組富含潛在的順式調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的表觀修飾標(biāo)記H3K27Ac。這說明該插入點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，有利于外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。最后，外源基因的插入也有可能導(dǎo)致基因組調(diào)控元件的刪除或染色質(zhì)三維空間構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響插入位點(diǎn)周圍內(nèi)源基因的表達(dá)，如轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中，即使內(nèi)源基因距離插入位點(diǎn)超過500 kb，依然會(huì)受到外源插入表達(dá)框的影響，導(dǎo)致內(nèi)源基因表達(dá)的下調(diào)[29]。本研究中，也發(fā)生了834 bp基因組片段的丟失，但該序列物種間保守性很低(數(shù)據(jù)未展示)，參與表達(dá)調(diào)控的可能性較低。盡管如此，該外源插入基因?qū)^(qū)域染色質(zhì)三維空間構(gòu)象和附近內(nèi)源基因表達(dá)的影響還需要后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究通過PCR方法檢測了T274后代F1和F2代的左右兩側(cè)斷點(diǎn)序列，發(fā)現(xiàn)外源突變體在不同世代可以穩(wěn)定遺傳。同時(shí)，RT-PCR的結(jié)果也表明GHR表達(dá)框在該區(qū)域可以高效、穩(wěn)定表達(dá)，且不同組織的表達(dá)一致性較高。轉(zhuǎn)基因豬T274個(gè)體是通過CAG強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GHR表達(dá)，該啟動(dòng)子是普遍型表達(dá)[30]，這與本研究獲得的不同組織表達(dá)效率結(jié)果一致。與目前已鑒定到的“友好位點(diǎn)”類似，不同組織間外源基因表達(dá)的效率相對(duì)一致[5]。此外，該區(qū)域高效表達(dá)GHR可以抑制內(nèi)源性W的功能，從表達(dá)水平看，突變體表達(dá)高于野生型，這也是T274及其后代體重在15～30 kg之間的原因[21]。遺傳穩(wěn)定性和高效表達(dá)的數(shù)據(jù)顯示該區(qū)域與序列分析預(yù)測的類似，屬于較為理想的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，可以作為候選的轉(zhuǎn)基因友好位點(diǎn)。未來，結(jié)合基因編輯技術(shù)，人們可以將各種感興趣的目的基因定點(diǎn)插入到該位點(diǎn)，獲得穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的轉(zhuǎn)基因或基因修飾豬，避免隨機(jī)整合帶來的諸多問題。

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Identification of genomic insertion of dominant-negativemutation transgenes in Wuzhishan pig using whole genome sequencing method

Qiang Wei1,2, Yan Ao3, Manman Yang1,2, Tao Chen1,2, Hu Han1,2, Xingju Zhang1,2, Ran Wang1,2, Qiuju Xia1, Fangfang Jiang1,2, Yong Li1,2

Molecular characterization of sequences flanking the transgenic insertion site is essential for safety assessment and breeding a novel strain of transgenic animal.The growth hormone receptor (GHR) dominant-negative mutant transgenic pig (T274) is a Laron syndrome model, which was previously established in our laboratory and maintained in multi-generational populations. However, the insertion site of the exogenous mutant in the genome of this model has not yet been identified. In this experiment, the BGI-seq500 sequencing platform was used to re-sequence the whole genome of the T274 model. More than 289 Gb of data (106×) was obtained. Then, the transgenic vector and porcine genome sequences were used as references for alignment analysis, and the insertion site of the exogenousmutant was obtained, and verified by PCR amplification and Sanger sequencing. The results showed that the insertion site of the exogenous mutant was located in chromosome 1 (269,513,538-269,514,371) of the Wuzhishan pig. Conservation and functional element analysis indicated that the insertion site could be located in the intergenic region associated with transcription activation. The expression levels of the exogenous mutant in seven tissues of offspring in different generations are high, indicating that the insertion site can be used as a potential safe site for transgene targeting. This study shows that whole-genome resequencing can efficiently identify transgenic insertion sites. The insertion site identified in T274 could be useful in establishing and breeding new transgenic pig lines, as well as a reliable safe site for transgenic pig research.

transgenic insertion site; whole genome sequencing; transgenic pig; genetic stability

2021-06-24;

2021-08-30

廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2018B020203002)和廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目(編號(hào)：2019B1515210028)資助[Supported by the Science and Technology Innovation Strategy Projects of Guangdong Province (No. 2019B020203002) and Guangdong Province Basic and Applied Basic Research Fund (No. 2019B1515210028)]

魏強(qiáng)，碩士，工程師，研究方向：動(dòng)物基因編輯，動(dòng)物遺傳育種。E-mail: weiqiang@genomics.cn

李勇，博士，副研究員，研究方向：動(dòng)物基因編輯，動(dòng)物遺傳育種。E-mail: liyong3@genomics.cn

10.16288/j.yczz.21-221

2021/10/19 12:23:31

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20211019.0935.002.html

(責(zé)任編委: 李明洲)