高劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠糖代謝的影響

趙晴晴， 周金鑫， 潘 昱， 琚卉君， 朱麗穎， 劉 瑒， 張一帆

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200025）

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）因其高效的抗炎、抗過(guò)敏和免疫抑制作用，在臨床眾多領(lǐng)域中具有不可替代的作用，如多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤以及原發(fā)性免疫性血小板減少癥都需要應(yīng)用大劑量GC治療[1]。然而，過(guò)多的GC常易引發(fā)糖代謝紊亂[2]。研究顯示，無(wú)明確糖尿病史的患者在使用GC后，32.2%的患者出現(xiàn)血糖升高（隨機(jī)血糖＞11.1 mmol/L），嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，降低生存率[3]。

GC引起糖代謝紊亂的機(jī)制尚不清楚，主要認(rèn)為與胰島β細(xì)胞破壞和外周胰島素抵抗有關(guān)[4]。Ruzzin等[5]通過(guò)每天給予Wistar大鼠腹腔注射1 mg/kg的地塞米松12 d，建立骨骼肌胰島素抵抗模型，但大鼠血糖水平僅表現(xiàn)為輕度增高（5.5 mmol/L比5.1 mmol/L）。Ogawa等[6]研究顯示，通過(guò)每天腹腔注射5 mg/kg地塞米松，第15天時(shí)16%的Wistar大鼠發(fā)展為糖尿病。目前，高劑量GC對(duì)糖代謝的影響研究較少，GC引起糖代謝紊亂機(jī)制的研究局限于離體條件下，對(duì)活體條件下組織器官的葡萄糖代謝狀況尚不清楚。

18F-氟代脫氧葡萄糖（fluorodeoxyglucose，F(xiàn)DG）正電子發(fā)射體層成像 （positron emission tomography，PET）/CT顯像是利用18F-FDG與葡萄糖具有相似的生物化學(xué)特性，能通過(guò)細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，在己糖激酶的作用下磷酸化生成6-PO4-18F-FDG而滯留在細(xì)胞內(nèi)，從而可以在活體條件下反映組織器官葡萄糖的代謝水平[7]。本研究通過(guò)18F-FDG PET/CT顯像觀察Wistar大鼠在高劑量GC條件下，各組織器官的葡萄糖攝取狀況，了解高劑量GC對(duì)機(jī)體葡萄糖代謝的影響。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)并維持為無(wú)特定病原體的動(dòng)物。溫度控制在22～24°C，光照從早上7∶00開(kāi)始，12 h光照加12 h黑夜，食物（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）和水充足。該研究經(jīng)我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)責(zé)任機(jī)構(gòu)委員會(huì)的倫理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.不同劑量地塞米松實(shí)驗(yàn)分組：雄性Wistar大鼠200 g，30只，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為5組，每組6只。未注射地塞米松組為組1（對(duì)照組），另外4組腹腔注射不同劑量的地塞米松（0.01、0.02、0.1、1 mg/kg），分別為組2～5。5組大鼠每隔1 d監(jiān)測(cè)體重、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），每周進(jìn)行1次糖耐量試驗(yàn)（glucose tolerance test,GTT）。給藥9 d后，F(xiàn)BG結(jié)果提示給藥劑量梯度設(shè)置偏低，后將組2給藥濃度改為10 mg/kg，組3給藥濃度改為5 mg/kg，又觀察16 d。給藥21 d以后，血糖變化趨于穩(wěn)定，GTT僅測(cè)至第3周，后續(xù)未再進(jìn)行GTT實(shí)驗(yàn)。

2.高劑量地塞米松分組：30只雄性Wistar大鼠（250～300 g），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為2組。5只為對(duì)照組，每天腹腔注射相應(yīng)劑量的0.9%氯化鈉注射液。25只為實(shí)驗(yàn)組，每天腹腔注射地塞米松（10 mg/kg），其中5只用于眼眶采血，5只用于GTT，5只用于胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT），10只用于小動(dòng)物PET顯像。但由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中部分大鼠麻醉死亡、血液樣本發(fā)生溶血或顯像失敗等原因，眼眶采血、GTT、ITT大鼠為4只，PET顯像為5只。每隔1 d監(jiān)測(cè)體重和FBG變化，并在建模的第0、3、7、11、15天，進(jìn)行眼眶采血、GTT、ITT和PET顯像。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各5只，解剖取骨骼肌和肝臟，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色和過(guò)碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）染色。

三、FBG、胰島素、GTT和ITT

1.FBG和胰島素：大鼠禁食12 h后抽取大鼠尾尖血液，使用拜安進(jìn)自動(dòng)血糖儀（Contour TM TS,德國(guó)拜耳公司）檢測(cè)其FBG[8]。禁食12 h后，麻醉下進(jìn)行大鼠眼眶采血[9]，血液經(jīng)4°C 2 000×g離心20 min，取上清，-80°C冰箱保存。通過(guò)胰島素試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Crystal Chem公司）檢測(cè)血清胰島素[10]。

2.GTT：大鼠禁食不禁水過(guò)夜后，測(cè)量基礎(chǔ)體重及FBG值，腹腔注射50%葡萄糖溶液（1 g/kg）給予糖負(fù)荷。血糖儀測(cè)定糖負(fù)荷后30、60、90和120 min各點(diǎn)血糖值，繪制血糖變化曲線，計(jì)算血糖曲線下面積（area under curve，AUC）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.ITT：大鼠禁食不禁水過(guò)夜后，腹腔注射1 U/mL的胰島素（1 U/kg）。分別在胰島素注射的第0、15、30、60和90 min測(cè)量血糖值，并取自然對(duì)數(shù)，計(jì)算隨時(shí)間變化下降斜率，乘以100，得到KITT值[11]。

四、PET/CT顯像

將10只實(shí)驗(yàn)組大鼠在建模的第0、3、7、11、15天過(guò)夜禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉[購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，30 mg/kg]麻醉后，尾靜脈注射18F-FDG 7.4 MBq，30 min后，大鼠俯位固定于微PET/CT（Inveon MM Platform,Siemens Preclinical Solutions,Knoxville，美國(guó)）掃描床視野的中心位置，并于麻醉狀態(tài)下進(jìn)行掃描。PET/CT設(shè)備分辨率為1.5 mm，孔徑5.7 cm，軸向8.5 cm視野。微PET/CT設(shè)備采集工作站為Inveon Acquisition Workplace（IAW）1.5.0.28，數(shù)據(jù)采集前建立新的工作流（workflow），包含CT采集、重建，PET采集,PET直方圖 和PET重建。在80 kV電壓、500μA電流和1 100 ms曝光條件下CT掃描10 min，然后采集PET數(shù)據(jù)。采集的數(shù)據(jù)利用IAW軟件經(jīng)過(guò)衰減校正，通過(guò)三維有序子集最大期望值法（three-dimensional ordered subset expectation maximization，3DOSEM）重建冠狀面、橫斷面、矢狀面斷層圖像進(jìn)行分析。重建后的圖像利用西門子IRW 3.0獲取3D的感興趣區(qū)（regions of interest,ROI），骨骼肌選取兩上肢滑車上肘肌區(qū)[12]，肝臟選取右上葉，最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析并獲取ROI的%ID/g最大值[13]。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism Version 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖表繪制。所有計(jì)量資料以x±s表示；多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同劑量地塞米松對(duì)大鼠糖代謝的影響

地塞米松0.01、0.02 mg/kg 9 d時(shí)，大鼠體重分別為（242±13）g、（238±7）g，與組1[（251±13）g]相仿（均P＞0.05）；地塞米松0.1、1 mg/kg時(shí)，大鼠體重9 d時(shí)分別為（225±10）g、（196±9）g，較組1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003 8，P＜0.000 1）。第25天體重分別為（302±26）、（242±18）、（192±11）、（188±11）、（177±10）g，與組1相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（見(jiàn)圖1 A）。低劑量（0.01～0.1 mg/kg）地塞米松對(duì)大鼠FBG無(wú)明顯影響，僅0.02 mg/kg地塞米松第3天FBG[（3.4±0.3）mmol/L比（5.0±0.3）mmol/L]有所降低（P＜0.000 0）；組5給藥后FBG[（6.1±0.9）mmol/L]較給藥前[（4.9±0.6）mmol/L]輕微增高（P=0.001 5）。組3和組2后期（5 mg/kg和10 mg/kg地塞米松）干預(yù)后血糖升高，第20、23、25天血糖組2為（6.7±1.7）、（6.5±2.2）、（8.0±2.8）mmol/L，組3為（5.7±0.6）、（5.6±1.3）、（6.7±1.6）mmol/L，與給藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖1B）。7 d GTT多組間方差分析，F(xiàn)=14.97，P＜0.000 1。GTT組3（600±77）和組4（572±78）給藥7 d時(shí)與組1（756±46）相比AUC降低（P=0.001 6，P=0.000 5）（見(jiàn)圖1 C）；14 d GTT多組間方差分析，F(xiàn)=27.92，P＜0.000 1。給藥14 d組4（565±44）、組5（640±72）AUC較組1（758±38）低（P=0.000 09，P=0.008 3）；組2（869±64）、組3（1 117±194）較組1（758±38）高（P=0.006 1，P=0.005 6）（見(jiàn)圖1D）。21 d GTT多組間方差分析，F(xiàn)=13.08，P＜0.000 1，給藥21 d僅組2（1 169±233）較組1（753±71）高（P=0.006 1）（見(jiàn)圖1 E）。10 mg/kg地塞米松給藥14 d和21 d，AUC分別為（869±64）和（1 169±233），與5 mg/kg地塞米松給藥后相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.004 4和0.001 9）（見(jiàn)圖1D、E）。

圖1 不同劑量地塞米松對(duì)大鼠糖代謝的影響

二、高劑量地塞米松對(duì)大鼠糖代謝的影響

高劑量地塞米松干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組體重第0、3、7、11、15天為（261±8）、（226±8）、（192±10）、（172±10）、（156±10）g,與干預(yù)前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖2A）。FBG第0、3、7、11、15天為（4.3±0.8）、（14.4±5.2）、（8.3±2.6）、（9.8±4.4）、（9.8±4.9）mmol/L，與干預(yù)前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（見(jiàn)圖2B）?？崭挂葝u素與干預(yù)前[（0.8±0.2）μg/L]相比，第3天[(11.6±1.1)μg/L](P=0.000 4)、第7天[(9.2±1.0)μg/L](P=0.000 5)、第11天[(9.2±2.4)μg/L](P=0.009 0)和第15天[(13.5±2.1)μg/L](P=0.017 1)（見(jiàn)圖2C）。GTT結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠與干預(yù)前（858±26）相比，第3天（2 350±345）（P=0.003 1）、第7天（1 680±331）（P=0.015 4）、第11天（1 352±166）（P=0.008 6）和第15天（1 553±217）（P=0.007 2）血糖AUC明顯升高（見(jiàn)圖3 A）。ITT結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠與干預(yù)前（1.26±0.18）相比，第3天（0.51±0.09）（P=0.001 2）、第7天（0.91±0.18）（P=0.033 2）、第11天（0.77±0.16）（P=0.006 9）和第15天（0.50±0.16）（P=0.000 7）KITT值明顯降低（見(jiàn)圖3 B）。

圖2 高劑量地塞米松對(duì)大鼠糖代謝的影響

圖3 實(shí)驗(yàn)組大鼠GTT和ITT

三、PET/CT顯像中骨骼肌和肝臟FDG攝取

實(shí)驗(yàn)組大鼠PET/CT結(jié)果示，第3（0.15±0.03）（P=0.029 2）、7（0.20±0.02）（P=0.001 7）、11（0.28±0.02）（P=0.000 4）、15天（0.27±0.03）（P=0.000 5）骨骼肌葡萄糖攝取%ID/g最大值均高于第0天（0.10±0.01）（見(jiàn)圖4A）。肝臟葡萄糖攝取第0、3、7、11、15天%ID/g最大值分別為0.23±0.01、0.27±0.05、0.31±0.02、0.35±0.07、0.31±0.05，其中7天與第0天相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015 4）（見(jiàn)圖4B）。

圖4 實(shí)驗(yàn)組大鼠PET/CT顯像骨骼肌和肝臟葡萄糖攝?。?ID/g最大值）

四、免疫組化

實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌HE染色結(jié)果顯示骨骼肌肌纖維出現(xiàn)萎縮顯像，細(xì)胞核堆積（見(jiàn)圖5A、B）；PAS染色顯示糖原含量增加（見(jiàn)圖5C、D）。實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟HE染色結(jié)果顯示肝臟脂肪浸潤(rùn)增多（見(jiàn)圖5E、F）；PAS染色顯示肝臟糖原含量增加（見(jiàn)圖5G、H）。

圖5 大鼠骨骼肌和肝臟HE和PAS染色（100×）

討 論

不同劑量地塞米松腹腔注射對(duì)大鼠體重均有一定的影響，給藥劑量為1 mg/kg時(shí)，大鼠即表現(xiàn)為體重減輕、消瘦，給藥劑量越大，體重減輕越明顯。研究顯示，不同高劑量的地塞米松干預(yù)，大鼠均呈現(xiàn)一定程度的體重減輕[14-15]。不同劑量地塞米松干預(yù)可引起大鼠血糖的改變，其中高劑量地塞米松可引起血糖明顯升高，AUC明顯升高，糖處理能力下降，KITT值降低，外周胰島素抵抗明顯。本實(shí)驗(yàn)中選用10 mg/kg的地塞米松干預(yù)15 d以觀察高劑量地塞米松對(duì)大鼠糖代謝的影響。

GC引起糖代謝紊亂的機(jī)制主要與胰島β細(xì)胞功能改變及外周胰島素抵抗有關(guān)[16-17]。體外研究顯示，GC引起胰島β細(xì)胞凋亡[18]，及抑制胰島素生物合成和釋放[19]。然而，體內(nèi)研究顯示GC干預(yù)后，由于機(jī)體的代償作用會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能和質(zhì)量增加[20]。本研究中高劑量地塞米松干預(yù)后，大鼠呈現(xiàn)明顯高胰島素血癥。Fine等[21]通過(guò)可的松（200 nmol/L）或皮質(zhì)醇（20 nmol/L）處理小鼠離體胰島48 h，結(jié)果顯示生理劑量的GC通過(guò)上調(diào)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）促進(jìn)胰島素分泌。Courty等[20]研究顯示，長(zhǎng)期GC干預(yù)后，由于機(jī)體的代償作用會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能和質(zhì)量增加。Protzek等[11]研究通過(guò)1 mg/kg地塞米松連續(xù)干預(yù)5 d，大鼠和小鼠均表現(xiàn)為β細(xì)胞功能增強(qiáng)（葡萄糖刺激的胰島素分泌增多）和數(shù)目增加（胰島β細(xì)胞代償性增生）?？梢?jiàn)，高劑量GC干預(yù)會(huì)引起胰島素分泌增加。

Rafacho等[22]通過(guò)Wistar大鼠1 mg/kg地塞米松干預(yù)1～5 d，發(fā)現(xiàn)地塞米松以時(shí)間依賴性引起胰島素抵抗，胰島β細(xì)胞增生和胰島素分泌；通過(guò)連續(xù)5 d使用不同劑量（0.1～1 mg/kg）的地塞米松，發(fā)現(xiàn)地塞米松呈劑量依賴性引起高胰島素血癥和胰島素抵抗，而不伴明顯的高血糖現(xiàn)象[23]。本研究中高劑量地塞米松干預(yù)后，大鼠血糖明顯升高，AUC升高，KITT值降低，胰島素抵抗?？梢?jiàn)，高劑量的GC干預(yù)會(huì)引起胰島素抵抗。

本研究通過(guò)PET/CT顯像觀察到實(shí)驗(yàn)大鼠組織器官葡萄糖代謝狀況，骨骼肌葡萄糖攝取逐漸增加，肝臟葡萄糖攝取變化不明顯。在骨骼肌，胰島素介導(dǎo)超過(guò)80%的葡萄糖攝取[24]。研究顯示過(guò)量GC可直接干擾骨骼肌細(xì)胞中的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上，減少骨骼肌胰島素刺激的葡萄糖攝取和糖原合成[25-26]。本研究中ITT結(jié)果也顯示外周存在胰島素抵抗，然而骨骼肌FDG攝取增加，可能與胰島素分泌增多有關(guān)。Nicod等[27]給予健康非肥胖患者2 mg/d地塞米松干預(yù)2 d，通過(guò)治療前后葡萄糖鉗夾試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)給予地塞米松后，胰島素代償性分泌增多補(bǔ)償了骨骼肌胰島素抵抗。Burén等[28]研究發(fā)現(xiàn)1 mg/kg地塞米松干預(yù)11 d后，大鼠骨骼肌胰島素刺激的葡萄糖攝取減少，而不伴有基礎(chǔ)葡萄糖攝取減少。Ruzzin等[5]研究顯示1 mg/kg地塞米松干預(yù)12 d可引起大鼠骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生，但骨骼肌和肝臟糖原含量增加。本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌和肝臟糖原含量增加，說(shuō)明高劑量GC引起的高胰島素血癥補(bǔ)償了骨骼肌胰島素抵抗。

肝臟在調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。GC可以引起肝臟脂肪沉積，胰島素抵抗，本研究中也觀察到高劑量地塞米松干預(yù)后脂肪含量增加。高劑量地塞米松可引起明顯的高胰島素血癥，盡管胰島素不直接刺激肝細(xì)胞攝取葡萄糖，但其通過(guò)調(diào)節(jié)糖原合成和糖異生維持血糖穩(wěn)定。本研究中觀察到肝臟FDG攝取變化不明顯，可能原因一是肝臟攝取葡萄糖通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2，不依賴于胰島素[29-30]；二是過(guò)量GC可促進(jìn)肝臟糖異生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶及葡萄糖-6-磷酸酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致肝臟葡萄糖輸出增加[31]。但同時(shí)血糖升高時(shí)，會(huì)反饋抑制肝細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸酶的活性，使已經(jīng)被己糖激酶磷酸化后的6-磷酸-FDG不能及時(shí)脫去磷酸釋放入血而滯留于肝臟內(nèi)[32]。因此，肝臟葡萄糖攝取變化不明顯，提示高劑量GC引起的高胰島素血癥不能完全補(bǔ)償肝臟葡萄糖代謝缺陷。

綜上所述，高劑量GC會(huì)引起大鼠體重減輕，血糖和胰島素水平升高，糖耐量異常，胰島素抵抗發(fā)生。高劑量GC引起的高胰島素血癥補(bǔ)償了骨骼肌胰島素抵抗，但由于GC引起肝臟內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生，不能完全補(bǔ)償肝臟葡萄糖代謝缺陷。