新型多功能化金納米棒的合成與表征

吳克勤，許海艷，吳遠(yuǎn)波，彭珊珊，張 鴻，張瑜娟

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；2a.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部2019級(jí)；2b.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，江西 南昌30063)

引言

惡性腫瘤也稱癌癥，在全球范圍內(nèi)，癌癥是引起人類死亡的三大殺手之一，如何提高癌癥的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，改善患者的生活質(zhì)量成為癌癥治療的世界性問題。癌癥的治療主要有手術(shù)、放療和化療，其中化學(xué)藥物治療(化療)已經(jīng)成為癌癥治療的首選。然而化療靶向性差，毒副作用嚴(yán)重，而且長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐藥性，極大地限制了其治療劑量從而阻礙了藥物的使用和療效。腫瘤靶向藥物傳遞系統(tǒng)可以改善治療效果和全身毒性問題。因此，通過設(shè)計(jì)高效的藥物靶向輸送系統(tǒng)，來改善化療對(duì)癌癥的治療效果[1-3]。

金納米棒(Gold nanorod，GNR)是尺度從幾納米到幾百納米的棒狀金顆粒。GNR具有良好的可控的表面化學(xué)性質(zhì)和可修飾性，通過表面修飾不同的靶向部分和運(yùn)載各種藥物分子(如siRNA等)，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的攝取從而加強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的殺滅效果[4，5]。作為納米材料，金納米棒有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、表面多功能修飾性、化學(xué)惰性以及良好的生物相容性，已經(jīng)廣泛用于藥物載體、細(xì)胞成像、腫瘤診斷、光熱治療等研究中[6，7]。

甘露糖受體在部分腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，在正常細(xì)胞中卻較少，因此癌細(xì)胞表面高表達(dá)的甘露糖受體為抗腫瘤靶向藥物提供了新靶點(diǎn)。將甘露糖分子修飾到藥物載體表面能夠識(shí)別癌細(xì)胞表面高表達(dá)的甘露糖受體從而實(shí)現(xiàn)靶向藥物輸送[8，9]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)中所使用的藥品和溶劑均為分析純級(jí)別，無需進(jìn)一步純化。十六烷基溴化銨(CTAB)，硼氫化鈉(NaBH4)，氯金酸(HAuCl4·3H2O)，聚乙烯亞胺(PEI)，巰基十一酸(MUA)和甘露糖均為國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。用四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)，重水作為溶劑，使用Bruker AVANCE NEO 500 MHz FT-NMR Spectrometer(500 MHz)光譜儀來進(jìn)行NMR光譜圖的記錄。馬爾文公司ZETASIZER NANO測(cè)量了修飾后金納米棒表面電位。日本電子公司JEM-210003040700測(cè)量金納米棒尺寸。安捷倫科技有限公司Cary10003040425進(jìn)行紫外-可見吸收光譜圖的記錄。

1.2 合成部分

1.2.1 GNR-CTAB的制備

根據(jù)經(jīng)典的金種子溶液生長(zhǎng)法，合成研究所需的金納米棒溶液。種子溶液的制備：取7.5 mL CTAB溶液于瓶中，向其中加入250 μLHAuCl4·3H2O(10 mM)，控制體系溫度在28 ℃左右。吸取600 μL提前制好、-20 ℃預(yù)冷的NaBH4(10 mmol/L)慢慢加入到上述HAuCl4溶液中，溶液逐漸變?yōu)椴枭?，即為種子溶液，將種子溶液放到28 ℃水浴鍋中靜置2 hrs。生長(zhǎng)溶液的制備：取單口圓底燒瓶，加入100 mL CTAB水溶液(100 mmol/L)，置于30 ℃水浴鍋中，繼續(xù)加入4.25 mL HAuCl4·3H2O(10 mM)攪拌1 min，后加入0.625 mL AgNO3(10 mmol/L)，恒溫?cái)嚢? min，溶液顏色不變。向上述溶液中加入抗壞血酸0.675 mL(100 mmol/L)，無顏色變化，呈透明，恒溫?cái)嚢? min。取0.5 mL種子溶液慢慢加入到上述溶液中，溶液由透明漸漸加深至紫黑色，恒溫?cái)嚢?4 hrs，即得金納米棒(GNR-CTAB)溶液。

GNR-CTAB的表征：將合成的金納米棒溶液12000 rpm，10 min，離心2遍，用三蒸水重懸，用于測(cè)GNR-CTAB的TEM。

1.2.2 MUA-PEI(水溶液)的制備

稱取0.6540 g MUA于30 mL氯仿中攪拌溶解；加入0.5751 g EDC，攪拌15 min，后加入0.3450 g NHS攪拌15 min；加入5.4 g PEI攪拌24 hrs后，向其中加入30 mL三蒸水，攪拌1 hrs，靜置萃取上清液。

1.2.3 MUA-MAN(水溶液)的制備

取10 mLMUA-PEI溶液于瓶中，加入3 mL PBS緩沖液(10 mM，pH=7.4)攪拌1 min，然后加入0.1801 g甘露糖，再劇烈攬拌1 min后，該混合溶液在90 ℃下攪拌40 min。最后，通過透析袋(MWCO=1000 Da)，將合成的MUA-MAN溶液透析72 hrs后，收集透析袋內(nèi)的溶液，并在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 GNR-PEI和GNR-MAN的合成

取10 mg冷凍干燥后的GNR-CTAB粉末溶于10 mL水溶性PEI-MUA復(fù)合物中，在室溫下超聲攪拌24 h后，CTAB被更強(qiáng)的Au-S鍵取代后得到GNR-PEI；10 mg冷凍干燥后的GNR-CTAB粉末溶于10 mL水溶性MUA-MAN復(fù)合物中，在室溫下攪拌24 hrs后，CTAB被更強(qiáng)的Au-S鍵取代后得到GNR-MAN。將上述溶液以12，000 rpm離心15 min后去除多余的上清液，并將沉淀物用蒸餾水洗滌2次。通過冷凍干燥制備GNR-PEI和GNR-MAN粉末，稱重并溶解在非核酶水中備用。

GNR-PEI的表征檢測(cè)：采用zeta電位分析檢測(cè)GNR-PEI的電荷量。

GNR-MAN的表征檢測(cè)：采用透射電子顯微鏡檢測(cè)GNR-MAN大小和分散性；采用zeta電位分析檢測(cè)GNR-MAN的電荷量；核磁共振氫譜檢測(cè)GNR-MAN修飾的官能團(tuán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GNR-CTAB的TEM圖

圖1是GNR-CTAB的TEM圖，從中看出，GNR-CTAB的長(zhǎng)度約為30 nm，直徑約為10 nm，分散性較好。

圖1 GNR-CTAB的TEM圖

2.2 MUA-PEI的核磁共振氫譜

MUA-PEI的核磁共振氫譜如圖2所示。在MUA-PEI的核磁共振氫譜中，除了在2.50 ppm處出現(xiàn)PEI的特征峰，還出現(xiàn)了MUA的特征峰，說明MUA-PEI合成成功。

圖2 MUA-PEI的核磁共振氫譜

2.3 MUA-MAN的表征

2.3.1 MUA-MAN的UV/Vis吸收光譜表征

MUA-PEI，MAN和MUA-MAN在水溶液中的UV/Vis吸收光譜如圖3所示。在300 nm以上，MUA-PEI和甘露糖溶液都沒有吸收，但是MUA-MAN溶液在350 nm處有一個(gè)新的吸收峰出現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10]。

圖3 在水溶液中MAN、MUA-PEI和MUA-MAN的UV/Vis吸收光譜

2.3.2 MUA-MAN的核磁共振氫譜表征

MUA-MAN的核磁氫譜如圖4所示。MUA-MAN在8.0 ppm處出現(xiàn)的新峰，這是C=N鍵的特征峰，而MUA-PEI在該位置并沒有此峰，MUA-MAN中有席夫堿的形成，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10]。

圖4 MUA-MAN的核磁共振氫譜

2.4 GNR-MAN的表征

2.4.1 GNR-MAN的TEM

GNR-MAN的TEM如圖5所示，其長(zhǎng)度約為30 nm，直徑約為10 nm，在化學(xué)綴合甘露糖后，GNR的尺寸無明顯變化，并且仍然具有良好的分散性。

圖5 GNR-MAN的TEM圖

2.4.2 GNR-MAN的核磁共振氫譜

GNR-MAN的核磁共振氫譜如圖6所示。在8.4 ppm處出現(xiàn)了C=N鍵的特征峰，說明巰基(-SH)和金原子之間有很強(qiáng)的親和力，帶巰基的化合物可以與晶種生長(zhǎng)法所合成的GNR表面的CTAB進(jìn)行相對(duì)直接的置換，MUA-MAN取代了CTAB，從而達(dá)到修飾GNR的目的。

圖6 GNR-MAN的核磁共振氫譜

2.4.3 GNR-MAN的zeta電位分析

GNR-MAN的zeta電位分析如圖7所示。zeta電位分析表明，當(dāng)分別用MUA-PEI或MUA-MAN修飾GNR時(shí)，GNR的表面電荷從35.6 mV增加到42.7 mV或41.3 mV，表明GNR-MAN具有很強(qiáng)的結(jié)合自身帶負(fù)電荷的siRNA的能力。

圖7 GNR-MAN的zeta電位分析

3 結(jié)論

本項(xiàng)目建立新型的基于納米材料GNR的新型多功能納米載藥系統(tǒng)(GNR-Man)，其長(zhǎng)度約為30 nm，直徑約為10 nm，在化學(xué)綴合甘露糖后，GNR的尺寸無明顯變化，并且仍然具有良好的分散性。GNR-MAN表面電荷為41.3 mV，具有很強(qiáng)的結(jié)合siRNA的能力，該系統(tǒng)能在體內(nèi)攜帶siRNA靶向腫瘤組織，從而增強(qiáng)抗腫瘤的治療效果，為基于金納米棒的靶向載藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。