白黎蘆醇體外對多房棘球蚴原頭節(jié)和微囊的作用研究

高海軍,龐華勝,張 妍,霍樂樂,姜 斌,莫筱瑾,雒艷萍,張 颋,,景 濤,徐 斌,馬興銘,胡 薇

多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球絳蟲幼蟲(多房棘球蚴)寄居于人或哺乳動物引起的一種人獸共患寄生蟲病[1]。AE主要分布于北半球,高流行區(qū)集聚于中亞及我國西北部,嚴重威脅著人體健康及畜牧業(yè)發(fā)展,被視為“蟲癌”[2]。多房棘球蚴具有獨特的組織器官趨向性,肝臟寄生占97%以上,呈類癌樣侵襲生長,可通過血液或淋巴液向肺腦等器官播散[3]。若未得到合理治療,AE患者10～15年生存率僅為10%左右[4-5]。目前,AE的臨床治療策略主要包括病灶切除、肝臟移植和藥物化療。目前,阿苯達唑(Albendazole,ABZ)作為臨床上最主要的棘球蚴病治療藥物,是通過抑制微管聚合和能量代謝進而發(fā)揮其抑蟲作用[6]。由于AE患者術后易出現(xiàn)復發(fā),ABZ口服吸收效果不佳及長期服用產(chǎn)生的毒副作用明顯等[7],因此,尋找新型AE治療藥物成為當前的研究熱點。

白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是一種含芪類結構的非黃酮多酚化合物,廣泛存在于葡萄科、百合科、豆科等植物中[8]。已有研究證實,RES具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化和抗血管生成等多種生物功能[9],還具有殺蟲(如血吸蟲[10]、利什曼原蟲[11]和錐蟲[12])作用。因此,本研究將探討RES體外對多房棘球蚴原頭節(jié)和微囊生長的作用,旨在為AE的臨床用藥提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及倫理 清潔級雄性長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)(體重約75 g)由首都醫(yī)科大學友情贈送。本實驗研究經(jīng)蘭州大學基礎醫(yī)學院動物倫理委員會和中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所倫理委員會同意(授權號:SCX-gan-2009-0004和IPD-2021-27)。

1.2 實驗材料

1.2.1 細胞及寄生蟲來源 永生化肝癌細胞(Hep G2細胞系)由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所保存;多房棘球蚴原頭節(jié)來自蘭州大學基礎醫(yī)學院的泡球蚴感染的長爪沙鼠。

1.2.2 試劑與儀器 二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),阿苯達唑亞砜(Albendazole sulfoxide,ABZ-SO),白藜蘆醇(Resveratrol,RES)購自阿拉丁化學試劑公司;基礎培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified eagle’s medium,DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)和青霉素-鏈霉素(Penicillin-streptomycin,P-S)等購自南京維森特生物技術有限公司和臺盼藍染液購買自北京索萊寶科技有限公司,堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase activity,ALP)活性檢測試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司;多功能酶標檢測儀由美國Bio Tek公司生產(chǎn),倒置光學顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn),掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡由日本電子株式會社生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 多房棘球蚴原頭節(jié)和微囊的分離培養(yǎng) 原頭節(jié)分離培養(yǎng)步驟參照文獻[7],即感染泡球蚴14個月的長爪沙鼠經(jīng)乙醚麻醉后脫頸處死,置入75%乙醇浸泡10 min,無菌分離泡球蚴組織并將其轉(zhuǎn)移至含20%P-S的無菌磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS),用組織剪去除泡球蚴表面殘留的宿主血管與結締組織,用含1%P-S的PBS漂洗3～4遍,將其剪碎充分釋放原頭節(jié),經(jīng)200μm和40μm無菌過濾后收集原頭節(jié),再用新鮮DMEM(含1%P-S)漂洗直至其存活率＞98%,最后用含1%P-S的DMEM將其充分重懸,置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)備用。

在完全培養(yǎng)體系(89% DMEM＋10% FBS＋1%P-S)中,待飼養(yǎng)細胞Hep G2長滿至平皿的85%左右,將原頭節(jié)緩緩加入(1 000 PSCs/皿)平皿繼續(xù)培養(yǎng),每隔3～4 d用PBS漂洗并置入新鮮培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng),約4周原頭節(jié)將發(fā)育成微囊,收集微囊備用。

1.3.2 原頭節(jié)和微囊的體外作用 將原頭節(jié)種入24孔 板(100 PSCs/孔),設 置PBS組、DMSO組(DMSO終濃度為0.1%)即溶媒對照組、ABZ-SO作用組(ABZ-SO終濃度為40μmol/L)即陽性對照組,RES作用組(RES終濃度分別為5、10、20、40、80、100、200和400μmol/L),每組設置4個復孔,每24 h觀察其形態(tài)變化并記錄存活率,持續(xù)觀察1周。培養(yǎng)至第6 d,吸取各孔培養(yǎng)上清液100μL進行ALP活性檢測。另外,收取PBS、DMSO、ABZSO和RES組原頭節(jié),采用0.4%臺盼藍染色觀察其形態(tài)變化;部分原頭節(jié)經(jīng)PBS漂洗3～4遍后,固定于4%戊二醛中,采用掃描和透射電子顯微鏡觀察其超微結構變化。

將收集的微囊種入24孔板(4個/孔),設置PBS組、DMSO組(DMSO終濃度為0.1%)即溶媒對照組、ABZ-SO作用組(ABZ-SO終濃度為40 μmol/L)即陽性對照組,RES作用組(RES終濃度為40μmol/L),每組設置3個復孔,每24 h觀察其活力和形態(tài)變化,持續(xù)觀察2周。2周后,收集培養(yǎng)上清并檢測其ALP活性。

1.3.3 堿性磷酸酶活性檢測 取原頭節(jié)或微囊培養(yǎng)上清(30μL)、檢測緩沖液(20μL)和顯色底物(50 μL)進行混勻,后置于37℃孵育15 min后,加入終止液(100μL)終止反應,測定A405nm值,參照試劑盒說明書建立標準曲線并計算ALP活性。

1.3.4 掃描和透射電鏡觀察 掃描電鏡制樣操作步驟參照文獻[2],即收集的原頭節(jié)用PBS漂洗3～4遍,置于4%戊二醛固定4 h,用1%鋨酸室溫避光進行后固定,經(jīng)梯度乙醇和乙酸異戊酯脫水,真空干燥及噴金后置于掃描電子顯微鏡下觀察。透射電鏡制樣操作步驟參照文獻[13],即原頭節(jié)經(jīng)4%戊二醛固定后用無菌PBS洗滌3～4遍,再經(jīng)1%鋨酸進行后固定、梯度濃度丙酮脫水,再經(jīng)Epon812環(huán)氧樹脂包埋后切片,鉛鈾電子染色,在透射電鏡下觀察并拍照。

2 結 果

2.1 白藜蘆醇體外對多房棘球蚴原頭節(jié)的作用效果 光學顯微鏡觀察顯示,5～400μmol/L RES體外持續(xù)作用7 d,原頭節(jié)死亡率呈劑量、時間依賴性升高,其中,400和200μmol/L RES體外分別作用至第1和3 d,原頭節(jié)死亡率均達100%。當RES濃度降至100、80和40μmol/L時,原頭節(jié)死亡率分別在第4、5和6 d達到100%,20μmol/L RES作用至第7 d原頭節(jié)全部死亡。而10和5μmol/L RES作用至第7 d,原頭節(jié)死亡率僅為(23.75±4.24)%和(20.75±2.83)%。截至第7 d,40μmol/L ABZSO作用組原頭節(jié)死亡率為(13.25±1.41)%,DMSO組為(6±0.71)%(圖1)。

圖1 白藜蘆醇體外對多房棘球絳蟲原頭節(jié)的作用效果Fig.1 Effect of RES on E.multilocularis PSCs in vitro

化學發(fā)光法顯示,不同濃度的RES作用至第6 d,PSCs培養(yǎng)上清中ALP活性呈劑量依賴性增高(F＝36.94,P＜0.001)。在PBS組中,ALP活性為(1.86±0.11)U/L,與DMSO組(1.97±0.18)間 差異無統(tǒng)計學意義(t＝0.775,P＝0.468)。與DMSO組比較,400和200μmol/L RES組中ALP活性明顯增高,分別為(6.13±0.22)U/L(t＝17.35,P＜0.001)和(59.93±0.27)U/L(t＝13.57,P＜0.001)。當RES濃度降至100、80、40和20μmol/L時,上清中ALP活性分別為3.73±0.32,3.35±0.54,2.95±0.10和2.72±0.24 U/L,與DMSO組間差異均有統(tǒng)計學意義(t＝5.253,P＝0.002;t＝2.509,P＝0.046;t＝7.066,P＝0.000和t＝2.94,P＝0.026),但10和5μmol/L RES作用后,ALP活性為(1.95±0.14)和(2.0±0.13)U/L,與DMSO組間差異無統(tǒng)計學意義(t＝0.116,P＝0.911和t＝0.013,P＝0.990)(圖2)。

圖2 白藜蘆醇體外對多房棘球蚴原頭節(jié)ALP活性的影響Fig.2 Changes of ALP activity in E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

2.2 白藜蘆醇體外對多房棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)的影響 光鏡顯示,作用至第6 d時,PBS和DMSO組原頭節(jié)結構完整,透光性良好,大量鈣顆粒排列整齊,而40～400μmol/L RES組中原頭節(jié)活力喪失、透光性降低,并被0.4%臺盼藍染成藍色,蟲體表皮發(fā)生大面積潰爛,培養(yǎng)液中有大量小鉤散落,且小鉤數(shù)量隨藥物濃度升高而增高。然而,10和5μmol/L RES、40μmol/L ABZ-SO、DMSO和PBS組中均未觀察到有明顯散落的小鉤且原頭節(jié)均未能被臺盼藍著色(圖3)。

圖3 白藜蘆醇體外作用后多房棘球蚴原頭節(jié)的形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

掃描電鏡觀察顯示,在PBS和DMSO組中,頂突外翻原頭節(jié)的小鉤排列整齊,腹部吸盤結構完整,體表被覆有大量微絨毛。40μmol/L ABZ-SO作用后,原頭節(jié)除體表產(chǎn)生空泡外,體壁無其它顯著變化,排泄孔結構清晰;而40μmol/L RES作用后,原頭節(jié)頂突、吸盤和體壁等基本結構完全被破壞殆盡。透射電鏡觀察表明,PBS和DMSO組中原頭節(jié)體壁超微結構完整,例如合胞體層被覆大量向外生長的微絨毛,并被一層過碘酸雪夫染色陽性(Periodic acid-Schiff stain,PAS)物質(zhì)包繞,內(nèi)部可見纖維束、肌肉束和圓形或橢圓形的實質(zhì)細胞等。40μmol/L ABZ-SO治療組中,原頭節(jié)合胞體層和PAS物質(zhì)層變薄、微絨毛變短變少,而RES作用后,原頭節(jié)基本結構完全被破壞,包括合胞體層、PAS物質(zhì)和微絨毛明顯缺失,實質(zhì)細胞皺縮,胞漿內(nèi)可見大量空泡與凋亡小體(圖4)。

圖4 白藜蘆醇體外作用后多房棘球蚴原頭節(jié)超微結構的變化Fig.4 Ultrastructural alterations in E.multilocularis PSCs after treatment with RES in vitro

2.3 白藜蘆醇體外對多房棘球蚴微囊的作用效果光鏡顯示,DMSO組多房棘球蚴微囊的角質(zhì)層和生發(fā)層結構完整,透光性良好,內(nèi)有大量新生原頭蚴。40μmol/L ABZ-SO作用2周后,微囊發(fā)育較DMSO組遲緩,角質(zhì)層和生發(fā)層形態(tài)未發(fā)生顯著變化,但40μmol/L RES作用后,微囊透光性明顯降低,微囊生發(fā)層皺縮并與角質(zhì)層分離(圖5)。

化學發(fā)光法檢測表明,40μmol/L ABZ-SO體外作用后,培養(yǎng)上清中ALP活性為(2.29±0.14)U/L,與DMSO組(2.08±0.09)U/L間差異無統(tǒng)計學意義(t＝1.271,P＝0.273),而40μmol/L RES作用后ALP活性增高,為(2.74±0.15)U/L(t＝3.83,P＝0.019)(圖5)。

圖5 白藜蘆醇體外對多房棘球蚴微囊的作用效果Fig.5 Effect of RES on E.multilocularis microcysts in vitro

3 討 論

多房棘球蚴好寄生于人類和高原鼠兔等中間宿主的肝臟(占97%以上),嚴重威脅著人體健康與畜牧業(yè)發(fā)展[4,14]。目前,AE患者經(jīng)臨床藥物ABZ治療后復發(fā)率高,ABZ口服吸收差且長期服用副作用嚴重等,嚴重限制了其藥效的進一步發(fā)揮[15-16]。因此,尋找新型有效的殺蟲藥物來預防和治療多房棘球蚴病成為當前的研究熱點。

RES常被認為是一個多靶點化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗寄生蟲等多種生物學作用[9,12]。報道顯示,RES能通過下調(diào)表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)和胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor,IGF-1)等多個信號抑制癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[8-9]。另外,RES可促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活物1-α的表達進而緩解血吸蟲感染引起的小鼠肝臟纖維化[10],還能下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)信號表達改善博來霉素誘導的大鼠肺臟纖維化[17]。肝纖維化是AE致病的關鍵環(huán)節(jié),且上述的信號通路在多房棘球蚴的免疫逃逸、侵襲性增殖與轉(zhuǎn)移過程中均起著重要作用[14,18]。因此,本實驗探討了RES體外對多房棘球蚴PSCs和微囊生長發(fā)育的影響,希望為RES在AE治療中的應用提供依據(jù)。

本實驗發(fā)現(xiàn),RES體外對多房棘球蚴原頭節(jié)具有明顯的抑制作用,且呈時間、劑量依賴性。RES(400μmol/L)作用24 h后原頭節(jié)死亡率可達100%,當RES濃度降至40μmol/L時,原頭節(jié)在第6 d全部死亡,但在等條件下,ABZ-SO(40μmol/L)作用后原頭節(jié)死亡率僅為(13.25±2.83)%,可見,等量的RES殺蟲效果明顯優(yōu)于ABZ-SO。另外,ALP含量常被認為判斷多房棘球蚴受損傷程度的重要指標[16],本實驗發(fā)現(xiàn),多房棘球蚴原頭節(jié)培養(yǎng)上清中ALP活性隨著RES作用濃度的增高而升高,且等濃度的RES作用后上清中ALP活性較ABZ-SO高,進一步支持了RES殺蟲效果比ABZSO更佳。此外,原頭節(jié)表皮與其營養(yǎng)攝取(葡萄糖等)和免疫逃逸等密切相關[14],而本實驗中,RES能破壞其表皮結構,因此,RES殺蟲作用可能與IGF-1信號通路下調(diào)有關,有待深入研究。

在多房棘球絳蟲生活史中,原頭節(jié)具有雙向發(fā)育的潛能,即在終末宿主內(nèi)進行有性繁殖向成蟲發(fā)育,在中間宿主內(nèi)進行無性類腫瘤樣侵襲性增殖[19]。原頭節(jié)寄居于人類肝臟的早期,以單個囊泡(微囊)形式存在,即外層為薄的角質(zhì)層和內(nèi)被覆的生發(fā)層(含大量的貯糖細胞、貯脂細胞和未分化或分化的實質(zhì)細胞等),并向外以出芽方式呈侵襲性生長,其內(nèi)部可新生大量的原頭蚴,進而形成典型的多囊結構[4,19]。本實驗體外模擬了多房棘球絳蟲原頭節(jié)的早期發(fā)育過程,即在含飼養(yǎng)細胞(HepG2)的體系中培養(yǎng)至第4周,原頭節(jié)發(fā)育成含角質(zhì)層和生發(fā)層的單微囊,待第6周微囊內(nèi)有大量新生原頭蚴,與Wang的發(fā)現(xiàn)類似[4]。ABZ-SO作為ABZ殺蟲的活性成分,作用2周后微囊的生長發(fā)育受到抑制(體積縮小和發(fā)育遲緩等),進一步佐證了ABZ可限制多房棘球蚴的出芽生長[20]。已有研究表明,RES可抑制TGF-β1的表達發(fā)揮抗纖維化作用[17],而TGF-β1信號通路在原頭節(jié)的增殖與微囊的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[20-21]。本實驗研究表明,RES體外作用后,微囊活性完全喪失,即生發(fā)層皺縮且與角質(zhì)層分離,其是否與TGF-β1表達下調(diào)相關,仍需進一步驗證。

RES具有毒副作用小、安全性高的特性,即HK-2和L02細胞分別經(jīng)RES作用72 h,IC50均大于150μmol/L[22],而 本 研 究 中RES對PSCs的IC50僅約為80μmol/L,且40μmol/L RES的殺蟲率也較等濃度的ABZ-SO高,顯示RES有一定的成藥潛力,但仍需進一步開展體內(nèi)殺蟲效果和細胞毒性等研究。

綜上所述,白藜蘆醇體外對多房棘球絳蟲原頭節(jié)表現(xiàn)出顯著的殺蟲作用,對微囊生長發(fā)育也具有明顯的抑制作用,是潛在的AE治療藥物。

利益沖突:無

引用本文格式:高海軍,龐華勝,張妍,等.白黎蘆醇體外對多房棘球蚴原頭節(jié)和微囊的作用研究[J].中國人獸共患病學報,2021,37(12):1057-1063.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.157