TLR4 mRNA和HO-1水平在ICVD病情及預(yù)后評估中的價值

樊明鶴， 林廣民， 黃瑞杰

（漯河市中心醫(yī)院檢驗科，河南 漯河 462000）

缺血性腦血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）是一類由供血功能障礙所致的腦組織壞死或功能喪失的腦血管疾病，患者因缺血、缺氧而出現(xiàn)不同程度的腦功能損傷，進而對認知功能、神經(jīng)功能等造成負面影響[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，ICVD占腦血管疾病的65%～85%，且發(fā)生率呈不斷上升趨勢[2-3]。動脈粥樣硬化是ICVD發(fā)生的主要原因，而炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的2個主要機制[4]。血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是血紅素降解過程中的限速酶，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[5-6]。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是病原體相關(guān)分子模式識別受體，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在動脈粥樣硬化易損斑塊的形成中起重要作用[7]。目前，關(guān)于HO-1及TLR4在評估ICVD患者預(yù)后中的報道較少見。因此，本研究擬通過探討TLR4 mRNA和HO-1水平在ICVD預(yù)后中的作用，為ICVD的治療及預(yù)后評估提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年2月—2019年12月漯河市中心醫(yī)院收治的324例ICVD患者（ICVD組），其中男190例、女134例，年齡（51.5±4.1）歲。選取同期漯河市中心醫(yī)院健康體檢者324名作為正常對照組，其中男195名，女129名，年齡（51.1±4.8）歲。2個組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)漯河市中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有對象均知情同意。

1.2 納入及排除標準

ICVD組納入標準：（1）符合全國第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的ICVD相關(guān)標準[8]；（2）首次發(fā)病且發(fā)病至入院時間≤24 h；（3）年齡≥18歲。

正常對照組納入標準：（1）近1個月內(nèi)體檢結(jié)果顯示無腦血管?。唬?）年齡≥18歲。

ICVD組及正常對照組排除標準：（1）合并惡性腫瘤；（2）并發(fā)心臟疾病并可能會導(dǎo)致腦栓塞；（3）并發(fā)嚴重認知功能障礙；（4）近1個月內(nèi)發(fā)生感染性疾病或感染癥狀；（5）近3個月內(nèi)服用過抗菌藥物、激素、免疫抑制劑等可能影響實驗結(jié)果的藥物；（6）合并其他嚴重疾病。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及檢測 采集ICVD患者入院當天、正常對照者體檢當天靜脈血6 mL，分為2管。1管1 007×g離心5 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測HO-1水平，試劑盒購自南京博研生物科技有限公司[靈敏度為＜5 pg/mL、檢測范圍為156～10 000 pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜9%，批間CV＜11%，標準曲線r=0.990]，檢測儀器為TECAN多功能酶標儀（瑞士帝肯公司）。另1管用于檢測外周血TLR4 mRNA。采用RNA提取試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）提取外周全血RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR046A，日本Takara公司）進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR RT-PCR試劑盒（貨號BSB22，杭州博日科技有限公司）進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，35個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法測定TLR4和β-actin基因的相對表達量。每份樣本重復(fù)檢測3次，取均值。引物由北京鼎國生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.3.2 頭顱多普勒超聲 對ICVD患者進行頭顱多普勒超聲檢查，并根據(jù)超聲結(jié)果進行分組。輕度狹窄組最大流速100～139 cm/s，聲頻、血流信號無明顯改變；中度狹窄組最大流速140～179 cm/s，血流信號表現(xiàn)為典型束腰狀，夾雜低頻雜音；重度狹窄組最大流速≥180 cm/s，聲頻信號呈波峰圓潤，血流信號發(fā)生色彩翻轉(zhuǎn)。

1.3.3 美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評分[9]采用NIHSS評分評估ICVD患者的神經(jīng)功能缺損程度，并分組。輕度損傷組NIHSS評分≤4分，中度損傷組NIHSS評分為4～20分，重度損傷組NIHSS評分＞20分。

1.3.4 隨訪 對ICVD患者隨訪6個月，依據(jù)改良Rankin量表（modified Rankin scale，MRS）[10]的得分情況及并發(fā)癥（認知功能障礙、癲癇發(fā)作、肺部感染等）發(fā)生情況進行分組。預(yù)后較好組MRS評分為0～2分，未出現(xiàn)并發(fā)癥；預(yù)后不良組MRS＞2分或出現(xiàn)并發(fā)癥。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)分析評估HO-1及TLR4 mRNA與NIHSS評分的相關(guān)性，采用Spearman相關(guān)分析評估HO-1及TLR4 mRNA與顱動脈狹窄程度的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后的價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICVD組與正常對照組一般資料比較

ICVD組與正常對照組之間吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、心臟疾病史、高脂血癥比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。

表2 ICVD組與正常對照組一般資料比較 例

2.2 ICVD組與正常對照組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較

ICVD組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量均高于正常對照組（P=0.000）。見表3。

表3 ICVD組與正常對照組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

表3 ICVD組與正常對照組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

注：空白表示無此項。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA ICVD組 324 4.18±2.52 1.21±0.57正常對照組 324 2.10±1.11 0.31±0.10 t值 10.369 27.994 P值 0.000 0.000

2.3 不同狹窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較

輕度狹窄組、中度狹窄組及重度狹窄組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同狹窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

表4 不同狹窄程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

注：與輕度狹窄組比較，*P＜0.05；與中度狹窄組比較，#P＜0.05；空白表示無此項。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA輕度狹窄組 93 3.06±1.80 0.87±0.41中度狹窄組 152 4.11±2.32* 1.11±0.50*重度狹窄組 79 5.89±2.19*# 1.36±0.44*#F值 56.836 22.012 P值 0.000 0.000

2.4 不同神經(jīng)功能損傷程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較

輕度損傷組、中度損傷組及重度損傷組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 不同神經(jīng)功能損傷程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

表5 不同神經(jīng)功能損傷程度ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

注：與輕度損傷組比較，*P＜0.05；與中度損傷組比較，#P＜0.05；空白表示無此項。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA輕度損傷組 88 3.02±1.90 0.80±0.39中度損傷組 153 4.48±2.30* 1.18±0.58*重度損傷組 83 5.88±2.32*# 1.56±0.30*#F值 31.098 39.024 P值 0.000 0.000

2.5 ICVD組HO-1及TLR4 mRNA與狹窄程度、NIHSS評分的相關(guān)性

ICVD組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量與顱動脈狹窄程度、NIHSS評分均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表6。

表6 ICVD組HO-1及TLR4 mRNA與顱動脈狹窄程度和NIHSS評分的相關(guān)性

2.6 不同預(yù)后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較

預(yù)后較好組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量均低于預(yù)后不良組（P＜0.05）。見表7。

表7 不同預(yù)后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

表7 不同預(yù)后ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量的比較 ±s

注：空白表示無此項。

組別 例數(shù) HO-1/（ng/mL） TLR4 mRNA預(yù)后較好組 229 3.44±1.30 0.84±0.43預(yù)后不良組 95 6.30±2.21 1.76±0.64 t值 11.726 10.909 P值 0.000 0.000

2.7 HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后的價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后不良的最佳臨界值分別為4.364 ng/mL、0.989，曲線下面積（95%可信區(qū)間）分別為0.800（0.751～0.852）、0.815（0.754～0.860），敏感性分別為81.4%、85.1%，特異性分別為72.4%、73.5%。見圖1。

圖1 HO-1及TLR4 mRNA判斷ICVD預(yù)后不良的ROC曲線

3 討論

ICVD主要由腦動脈血栓形成導(dǎo)致，但其發(fā)病機制目前尚不清楚。氧化應(yīng)激反應(yīng)可能在ICVD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因與ICVD發(fā)病風險密切相關(guān)[11]。HO-1作為細胞內(nèi)的關(guān)鍵抗氧化酶，可通過降解血紅素來產(chǎn)生膽綠素、一氧化碳及鐵離子等，膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進一步生成膽紅素。有研究結(jié)果顯示，HO-1、膽紅素及一氧化碳組成的內(nèi)源性保護系統(tǒng)在氧化應(yīng)激損傷及抗炎反應(yīng)中起重要作用[12]。膽紅素及膽綠素可抑制脂質(zhì)過氧化，清除體內(nèi)的活性氧。一氧化碳可抑制內(nèi)皮細胞凋亡，促進損傷區(qū)周圍的內(nèi)皮細胞修復(fù)和增殖，從而降低氧化應(yīng)激損傷。動物實驗結(jié)果顯示，通過上調(diào)HO-1表達可抑制大鼠動脈粥樣硬化，而抑制HO-1表達則可加重動脈粥樣硬化[13]。還有研究結(jié)果顯示，HO-1對炎癥相關(guān)的腦損傷具有保護作用[14]。本研究結(jié)果顯示，ICVD患者血清HO-1水平顯著升高，與文獻報道[14]基本一致。原因可能是患者發(fā)生ICVD時，腦組織急性缺血缺氧，引發(fā)炎性介質(zhì)的大量釋放，從而誘導(dǎo)HO-1表達的增加。

TLR是一類Ⅰ類跨膜受體，廣泛分布于內(nèi)皮細胞、上皮細胞、樹突細胞及巨噬細胞等細胞中，并被認為是哺乳動物中唯一一類可將細胞外抗原識別信息傳遞至細胞內(nèi)，進而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的跨膜蛋白[15]。TLR4是TLR分子家族中的一員，可與多種外源性或內(nèi)源性配體結(jié)合，進而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[16]。炎癥是動脈粥樣硬化的主要基礎(chǔ)之一。TLR可通過促進炎癥因子，如白細胞介素6、腫瘤壞死因子α等的表達來調(diào)控血管內(nèi)皮炎性損傷[17-18]。本研究結(jié)果顯示，ICVD組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量顯著高于正常對照組（P=0.000），且顱動脈狹窄或神經(jīng)功能損傷越嚴重，HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量越高，這提示TLR4及HO-1可能參與了ICVD的發(fā)生、發(fā)展。但本研究未對TLR4 mRNA及HO-1的變化機制進行研究，TLR4及HO-1參與ICVD的上游、下游關(guān)鍵分子及具體機制仍有待深入研究。

本研究還探討了HO-1及TLR4 mRNA在ICVD患者預(yù)后評估中的價值。結(jié)果顯示，預(yù)后較好組HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量均低于預(yù)后不良組（P＜0.05）。這表明TLR4及HO-1可作為評估患者預(yù)后的輔助指標。但本研究的隨訪時間僅為6個月，因此相關(guān)結(jié)論仍需樣本量更大、隨訪時間更長的研究結(jié)果加以驗證。

綜上所述，ICVD患者HO-1水平及TLR4 mRNA相對表達量顯著升高，且與病情嚴重程度及預(yù)后相關(guān)，因此HO-1及TLR4或可作為ICVD患者病情評估及預(yù)后判斷的有效指標。