小兒支氣管哮喘與信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3等位基因相關(guān)性分析

薛向東，吳迎爽，馬 君，程淵博，王利紅，楊素娟

張家口市第一醫(yī)院 1.兒科；2.泌尿外科；3.腎內(nèi)科，河北 張家口075000

支氣管哮喘是小兒呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病之一，14歲以下兒童發(fā)病率約為4%。支氣管哮喘可嚴重影響患兒學習、運動、飲食，甚至睡眠[1]。目前，支氣管哮喘的病因及具體發(fā)病機制仍未完全闡明，其可能與多種復雜因素有關(guān)，除環(huán)境因素誘發(fā)外，包括基因多態(tài)性在內(nèi)的遺傳因素也是導致該病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)3屬于核轉(zhuǎn)錄因子，與生理功能、感染及腫瘤發(fā)生有關(guān)，同時，其基因多態(tài)性可能影響多種免疫系統(tǒng)疾病的易感性[3-4]。本研究旨在探討小兒支氣管哮喘發(fā)病與STAT3等位基因的相關(guān)性?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2018年1月至2021年1月于張家口市第一醫(yī)院就診的86例小兒支氣管哮喘患兒納入哮喘組。另選取同期體檢的100例健康兒童納入健康組。哮喘組中，男性46例，女性40例；年齡4～9歲，平均年齡(6.30±1.35)歲。健康組中，男性55例，女性45例；年齡5～8歲，平均年齡(6.19±1.27)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。所有研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 哮喘組患兒納入標準：符合兒童變應性哮喘診斷及分度標準[5]；年齡≤14歲；自愿加入研究；臨床資料完整。哮喘組患兒排除標準：川崎??；炎癥性腸??；其他免疫系統(tǒng)疾病。健康組納入標準：年齡≤14歲；于我院體檢證實健康無疾??；近4周無感染或發(fā)熱；自愿加入研究；臨床資料完整。健康組排除標準：近4周使用激素或免疫抑制劑；過敏體質(zhì)；其他免疫系統(tǒng)疾病史。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取及引物設(shè)計 抽取研究對象外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，吸取200 μl提取目標DNA，-80℃保存；引物設(shè)計和引物設(shè)計合成均由Invitrogen公司完成，包含基因多態(tài)性位點質(zhì)控正向引物和通用反向引物。

1.3.2 SSP-PCR檢測 SSP-PCR反應體系包括模板DNA 2 μl、2×PowerTaq Master Mix 12.5 μl、特異性引物0.5 μl、質(zhì)控正向引物0.5 μl及通用反向引物1 μl，以dd H2O補足25 μl。內(nèi)含子11 rs2293152位點擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s連續(xù)8個循環(huán)，60℃退火45 s，73℃延伸45 s；94℃變性30 s連續(xù)25個循環(huán)，52℃退火45 s，73℃延伸45 s，73℃延伸5 min。內(nèi)含子23 rs957970位點擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s連續(xù)35個循環(huán)，50℃退火45 s，73℃延伸45 s，73℃延伸5 min。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠(15 g/L)中加入PCR產(chǎn)物5 μl，電泳電壓和時間分別設(shè)置為110 V、35 min。電泳完成后切取目標條段經(jīng)凝膠成像儀顯像。

1.3.4 PCR產(chǎn)物測序及驗證 STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點和內(nèi)含子23 rs957970位點隨機抽樣3份樣本，完成包含上述位點產(chǎn)物擴增，產(chǎn)物測序和驗證均由英濰捷基完成直接測序，將測序SNP位點基因型結(jié)果和SSP-PCR檢測結(jié)果對比驗證。

1.3.5 血清炎癥因子水平檢測 抽取晨起空腹外周靜脈血3 ml，離心(3 000 r/min、10 min)后采用ELISA法測定血清白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-5、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)水平。

2 結(jié)果

2.1 H-W遺傳平衡檢驗分析 H-W遺傳平衡檢驗分析顯示，健康組STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點基因型分布頻率和內(nèi)含子23 rs957970位點基因型分布頻率均符合H-W平衡(χ2值分別為0.700、0.255，P>0.05)；哮喘組STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點基因型分布頻率和內(nèi)含子23 rs957970位點基因型分布頻率均符合H-W平衡(χ2值分別為0.279、1.211，P>0.05)。證實納入兒童具有人群代表性。

2.2 兩組內(nèi)含子11 rs2293152 C/G基因型及等位基因分布比較 哮喘組與健康組內(nèi)含子11 rs2293152位點CC基因型、等位基因(C、G)比例比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。存在C等位基因的小兒支氣管哮喘發(fā)生風險為G等位基因的1.62倍(比值比=1.62，95%可信區(qū)間1.10～2.89)。

表1 兩組內(nèi)含子11 rs2293152 C/G基因型及等位基因分布比較/例(百分率/%)

2.3 兩組內(nèi)含子23 rs957970 C/T基因型及等位基因分布比較 兩組內(nèi)含子23 rs957970位點基因型(CC、CT、TT)及等位基因(C、T)比例比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組內(nèi)含子23 rs957970 C/T基因型及等位基因分布比較/例(百分率/%)

2.4 內(nèi)含子11 rs2293152位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較 內(nèi)含子11 rs2293152位點CC、CG基因型患者血清IL-4、IL-5水平高于GG患者，血清IFN-γ水平低于GG患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。內(nèi)含子11 rs2293152位點CC基因型患者血清IL-4、IL-5水平高于CG患者，血清IFN-γ水平低于CG患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 內(nèi)含子11 rs2293152位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較

2.5 內(nèi)含子23 rs957970位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較 內(nèi)含子23 rs957970位點CC、CT、TT基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 內(nèi)含子23 rs957970位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較

3 討論

近年來，支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，已逐漸成為全球性公共衛(wèi)生問題[6]。支氣管哮喘常會對兒童正常的生長發(fā)育及身心健康造成負面影響。學齡前兒童常因喘息癥狀就診，根據(jù)進展階段，臨床將喘息分為一過性、持續(xù)性及遲發(fā)性喘息或哮喘3類[7]。遲發(fā)性喘息患兒如僅合并特應性因素，進展成為支氣管哮喘風險較高。針對此類患兒，早期診治有助于預防支氣管哮喘發(fā)病，但如何實現(xiàn)早期準確的預測仍無合適的指標[8]。支氣管哮喘可能屬于多基因相關(guān)遺傳性疾病，患兒直系親屬發(fā)病比例最高接近75%[9]。近年來，候選基因定位克隆研究不斷深入，已成為分析疾病易感基因的主要方法，而支氣管哮喘發(fā)病的候選基因超過200個，包括人類白細胞抗原Ⅱ、腫瘤壞死因子α及IL等，涉及到機體炎癥反應、免疫識別及信號傳導等多方面生物學改變[10-11]。

STAT3屬于DNA結(jié)合蛋白，廣泛表達于人體內(nèi)多種組織及細胞，其能夠在無功能狀態(tài)下接收胞外信號刺激后磷酸化。磷酸化的STAT3能夠進入細胞核內(nèi)結(jié)合特異DNA片段，調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達，影響細胞增殖分化，腫瘤及感染的發(fā)生、進展等[12-13]。有研究報道，敲除模型動物呼吸道上皮平滑肌細胞STAT3基因，經(jīng)塵螨抗原刺激后，呼吸道反應性顯著下降，提示STAT3可能在支氣管哮喘呼吸道高反應性中發(fā)揮著一定作用[14-16]。

SSP-PCR檢測技術(shù)用于基因多態(tài)性位點檢測結(jié)果與直接測序法檢測基本一致，且具有檢測效率高，價格較為低廉等優(yōu)勢[17-18]。本研究通過SSP-PCR法檢測STAT3基因多態(tài)性，并進一步分析該基因多態(tài)性與小兒支氣管哮喘易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，小兒支氣管哮喘患兒STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點和內(nèi)含子23 rs957970位點均存在基因多態(tài)性，但內(nèi)含子11 rs2293152位點基因型分布頻率與既往研究[19]報道不一致，原因可能與納入患兒種族和地區(qū)差異有關(guān)。

本研究中，哮喘組內(nèi)含子11 rs2293152位點CC基因型、C等位基因比例顯著高于健康組(P<0.05)，存在C等位基因的小兒支氣管哮喘發(fā)生風險為G等位基因的1.62倍，進一步說明內(nèi)含子11 rs2293152位點C/G基因型中的C等位基因可能是小兒支氣管哮喘發(fā)生的易感基因，針對此類人群，早期干預有助于降低支氣管哮喘發(fā)生風險。但兩組內(nèi)含子23 rs957970位點基因型和等位基因比例比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可基本排除內(nèi)含子23 rs957970位點基因多態(tài)性對小兒支氣管哮喘發(fā)病風險的影響。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)含子23 rs957970位點CC、CT、TT基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；內(nèi)含子11 rs2293152位點CC、CG基因型患者血清IL-4、IL-5高于GG患者，血清IFN-γ低于GG患者(P<0.05)，CC基因型患者血清IL-4、IL-5高于CG患者，血清IFN-γ低于CG患者(P<0.05)，提示基因多態(tài)性與哮喘患者的氣道炎癥有關(guān)，CC基因型患者的氣道炎癥最為嚴重。有研究報道，STAT3可通過誘導細胞因子、趨化因子等介導哮喘患者的氣道炎癥反應，因此，STAT3基因多態(tài)性與哮喘患者氣道炎癥反應嚴重程度有較大的相關(guān)性[20]，與本研究結(jié)果一致。STAT3基因多態(tài)性對STAT3信號通路的調(diào)控作用不同，內(nèi)含子11 rs2293152位點上的C等位基因可通過對STAT3信號通路較強的激活作用介導氣道結(jié)構(gòu)細胞或氣道炎癥細胞浸潤，從而加重哮喘患者病情，因此，CC基因型患者的氣道炎癥相對更嚴重[21]。

綜上所述，小兒支氣管哮喘發(fā)病與STAT3基因多態(tài)性有關(guān)，內(nèi)含子11 rs2293152位點的C等位基因?qū)儆谝赘谢?，且該位點的基因多態(tài)性會影響哮喘患者氣道炎癥反應。