miR-612 通過調(diào)控TMPRSS4 表達(dá)抑制IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的機(jī)制

譚真 邱曉麗 孫建

（1 臨沂市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院病理科,山東 臨沂 276023;2 臨沂市人民醫(yī)院;3 臨沂市河?xùn)|區(qū)人民醫(yī)院）

研究表明腫瘤環(huán)境中炎癥因子對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲具有一定促進(jìn)作用，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未完全闡明〔1〕。研究報(bào)道指出白細(xì)胞介素（IL）-17 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲〔2〕，但I(xiàn)L-17 對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的作用機(jī)制尚未闡明。微小RNA-612（miR-612）在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-612 可抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔3〕。miR-612 在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)miR-612 可抑制癌細(xì)胞增殖及遷移〔4〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-612 表達(dá)可促進(jìn)膽管癌發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程〔5〕。但miR-612 在胃癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未可知，通過Targetscan預(yù)測顯示Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS）4 可能是miR-612 的靶基因，TMPRSS4 在胃癌組織中高表達(dá)，抑制TMPRSS4 表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲〔6〕。TMPRSS4 可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移〔7〕。TMPRSS4過表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力〔8〕。但miR-612 是否可通過調(diào)控TMPRSS4 表達(dá)而抑制IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的促進(jìn)作用尚未可知。因此，本研究采用IL-17 作用于胃癌MKN-45 細(xì)胞，觀察IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探究miR-612、TMPRSS4 與IL-17 在胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胃癌細(xì)胞株MKN-45 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素均購自美國Hyclone 公司；重組人IL-17 購自美國PEPROTECH 公司；MTT 購自美國Sigma 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；基質(zhì)膠購自美國BD 公司；Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；蛋白提取試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗TMPRSS4 抗體購自美國Abcam 公司；兔抗細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）D1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、p21 抗體購自美國Santa Cruz 公司；miR-612 mimic 及陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-612 抑制劑（anti-miR-612）及其對(duì)照（anti-miRNC）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 胃癌MKN-45 細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（100 U/ml青霉素、100 U/ml 鏈霉素），放入37℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。收集對(duì)數(shù)生長期MKN-45 細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液（3 ×104個(gè)/ml），按照200 μl/孔的密度接種于6 孔板，細(xì)胞隨機(jī)分為Con 組（未經(jīng)任何處理的細(xì)胞）、IL-17組（50 ng/ml 的重組人IL-17 作用于細(xì)胞48 h）〔9〕、anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）、anti-miR-612 組（anti-miR-612 轉(zhuǎn)染入MKN-45 細(xì)胞）、pcDNA 組（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MKN-45 細(xì)胞）、pcDNA-TMPRSS4 組（TMPRSS4 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MKN-45 細(xì)胞）、IL-17+miR-NC 組（miR-NC 轉(zhuǎn)染入MKN-45 細(xì)胞48 h，用50 ng/ml 的重組人IL-17 作用于細(xì)胞48 h）、IL-17+miR-612 組（miR-612 mimics 轉(zhuǎn)染入MKN-45 細(xì)胞48 h，用50 ng/ml 的重組人IL-17 作用于細(xì)胞48 h）。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細(xì)胞中miR-612、TMPRSS4 mRNA 表達(dá)水平 用PBS 清洗MKN-45 細(xì)胞，加入Trizol，按照Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測RNA 濃度，取200 ng RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件:37℃60 min，85℃5 s，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA 稀釋至100 μl，取1 μl cDNA、miR-612、TMPRSS4 上下游引物各1 μl，SYBR 熒光染料混合物12.5 μl，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μl，充分混合，轉(zhuǎn)移至8 聯(lián)PCR 管，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，應(yīng)用熒光定量PCR 儀檢測，反應(yīng)程序:95℃2 min（循環(huán)1 次），95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s（循環(huán)40 次）。miR-612U6 為內(nèi)參，TMPRSS4 以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算胃癌細(xì)胞中miR-612、TMPRSS4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長期MKN-45 細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整濃度為5 ×104個(gè)/ml，以每孔體積100 μl 接種于96 孔板，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，IL-17 組、IL-17+miR-NC 組、IL-17+miR-612 組分別在IL-17 作用24 h、48 h、72 h 時(shí)每孔加入20 μl MTT溶液，同時(shí)anti-miR-NC 組、anti-miR-612 組、pcDNA組、pcDNA-TMPRSS4 組分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)每孔加入20 μl MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔中加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻，利用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm 處各孔吸光度（OD）值。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移及侵襲 取各組對(duì)數(shù)生長期MKN-45 細(xì)胞，按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于上層未鋪設(shè)基質(zhì)膠的Transwell 小室以檢測細(xì)胞遷移能力，同時(shí)MKN-45 細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度種植于上層平鋪基質(zhì)膠的Transwell 小室以檢測細(xì)胞侵襲能力，Transwell 小室的上室使用不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，Transwell 小室的下室使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，用濕棉簽擦去未轉(zhuǎn)移及侵襲的細(xì)胞，多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫溶液染色5 min，顯微鏡下觀察遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-612 靶基因 用Targetscan 預(yù)測軟件對(duì)miR-612 的靶基因進(jìn)行預(yù)測，采用雙熒光素酶報(bào)告進(jìn)一步確認(rèn)Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果，將胃癌細(xì)胞分成4 組，分別轉(zhuǎn)染miR-612 mimics+野生型WT-TMPRSS4、miR-NC+野生型WT-TMPRSS4、miR-612 mimics+突變型WTTMPRSS4、miR-NC+突變型WT-TMPRSS4，各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度種植于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入100 μl 細(xì)胞裂解液，收集上清液，取上清液加入40 μl 螢火蟲熒光素底物，充分混合后測定熒光強(qiáng)度，取剩余上清液加入40 μl 海腎熒光素酶底物，充分混合后測定熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值）。

1.2.6 蛋白免疫Western 印跡檢測TMPRSS4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21 蛋白表達(dá) 分別收集各組轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，利用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，吸取上清，采用BCA 法檢測蛋白濃度，取30 μg 蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入蛋白一抗（稀釋比1 ∶1 000），一抗置于4℃振蕩孵育24 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，加入二抗（稀釋比1 ∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，加入ECL 試劑，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)及Quantityone 軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 IL-17 組48 h、72 h 胃癌細(xì)胞活力顯著高于Con 組（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），而p21 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖1、圖2、表1。

圖1 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表1 IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

表1 IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

2.2 IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞中miR-612 和TMPRSS4 表達(dá)的影響 IL-17 組胃癌細(xì)胞中miR-612 表達(dá)水平與Con 組相比顯著降低（P＜0.05），TMPRSS4 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖3、表2。

圖3 TMPRSS4 免疫印跡

表2 IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞中miR-612 和TMPRSS4 表達(dá)的影響(,n=9)

表2 IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞中miR-612 和TMPRSS4 表達(dá)的影響(,n=9)

2.3 miR-612 靶向調(diào)控TMPRSS4 的表達(dá) Targetscan 軟件預(yù)測miR-612 的靶基因，結(jié)果顯示miR-612 與TMPRSS4 的3＇UTR 區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與WT-TMPRSS4、miR-NC 共轉(zhuǎn)染組相比，WT-TMPRSS4、miR-612 mimics 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而MUT-TMPRSS4、miR-NC 共轉(zhuǎn)染組與MUT-TMPRSS4、miR-612 mimics 共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性比較差異不顯著，見表3。表明miR-612 可靶向結(jié)合TMPRSS4。Western 印跡檢測結(jié)果顯示，相對(duì)于miR-NC 組（0.43±0.04），miR-612 組胃癌細(xì)胞內(nèi)TMPRSS4 蛋白表達(dá)水平顯著降低（0.21±0.02；P＜0.05）；與anti-miR-NC 組（0.40±0.04）比較，antimiR-612 組胃癌細(xì)胞內(nèi)TMPRSS4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（0.84±0.08；P＜0.05），見圖5。

圖4 TMPRSS4 的3′UTR 中含有與miR-612 互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=9)

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(,n=9)

圖5 Western 印跡檢測TMPRSS4 蛋白表達(dá)

2.4 抑制miR-612 表達(dá)對(duì)48 h、72 h 胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 相較于anti-miR-NC 組，antimiR-612 組胃癌細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），p21 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖6、表4。

表4 抑制miR-612 表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

表4 抑制miR-612 表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

圖6 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白免疫印跡圖

2.5 TMPRSS4 過表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-TMPRSS4 組48 h、72 h 胃癌細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），p21 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見表5、圖7。

圖7 TMPRSS4 和增殖、遷移侵襲相關(guān)Western 印跡

表5 TMPRSS4 過表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

表5 TMPRSS4 過表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

2.6 miR-612 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 相較于IL-17+miR-NC 組，IL-17+miR-612 組胃癌細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），p21 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖8、表6。

圖8 TMPRSS4 和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 miR-612 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用(,n=9)

表6 miR-612 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用(,n=9)

與Con 組比較:1）P＜0.05；與IL-17+miR-NC 組比較:2）P＜0.05

3 討論

胃癌轉(zhuǎn)移及侵襲與多種基因異常表達(dá)有關(guān)，腫瘤炎癥微環(huán)境可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲〔10〕。IL-17 是一種促炎細(xì)胞因子，其主要由Th17 細(xì)胞亞群及中性粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生，研究表明IL-17 高表達(dá)量與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)，但關(guān)于其促進(jìn)胃癌遷移及侵襲的機(jī)制研究尚未完全闡明〔11〕。IL-17 在乙型肝炎病毒（HBV）感染或炎癥性腸病等多種炎癥相關(guān)性腫瘤中均呈高表達(dá)〔12〕。本研究結(jié)果顯示IL-17作用胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似〔13〕。提示IL-17 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

本研究進(jìn)一步研究顯示，IL-17 干預(yù)胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯升高，而p21 蛋白表達(dá)水平顯著降低，已有研究報(bào)道指出p21 蛋白表達(dá)水平升高可抑制CyclinD1與CDK2 結(jié)合，抑制胃癌細(xì)胞增殖，MMP-2、MMP-9與胃癌細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)，其表達(dá)水平升高可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力〔14〕。提示IL-17 可抑制p21 表達(dá)及促進(jìn)CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，IL-17 能夠抑制胃癌細(xì)胞中miR-612 表達(dá)，提示IL-17 增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力可能與miR-612 表達(dá)水平降低有關(guān)。研究表明miR-612 在卵巢癌中呈低表達(dá)，LncRNA LUCAT1 通過調(diào)節(jié)miR-612/HOXA13 而促進(jìn)卵巢癌的惡性進(jìn)展〔15〕。LncRNA H19 通過競爭性結(jié)合miR-612 而調(diào)控靶基因HOXA10 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展〔16〕。miR-612 過表達(dá)可通過靶向抑制Espin表達(dá)而抑制黑素瘤細(xì)胞增殖、侵襲〔17〕。本研究結(jié)果表明抑制miR-612 表達(dá)后，胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)，提示miR-612 過表達(dá)可能成為胃癌新的分子干預(yù)靶點(diǎn)。

生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-612 的靶基因，結(jié)果顯示TMPRSS4 可能是miR-612 的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及Western 印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-612 可靶向負(fù)性調(diào)控TMPRSS4 的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TMPRSS4 過表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，研究表明TMPRSS4 在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)，其高表達(dá)量與患者臨床病理特征及預(yù)后不良密切相關(guān)〔18〕。TMPRSS4 在胃癌組織中表達(dá)水平升高，其表達(dá)水平與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶呈正相關(guān)，提示TMPRSS4 可能參與胃癌轉(zhuǎn)移過程〔19〕。干擾TMPRSS4表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞浸潤及遷移能力，TMPRSS4 過表達(dá)可增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移及侵襲能力〔20〕。本研究結(jié)果提示IL-17 可能通過抑制miR-612 表達(dá)及促進(jìn)TMPRSS4 表達(dá)從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究深入分析發(fā)現(xiàn)，miR-612 過表達(dá)可通過抑制TMPRSS4 表達(dá)而逆轉(zhuǎn)IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的促進(jìn)作用。提示miR-612 過表達(dá)可減弱IL-17 介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，其主要通過抑制TMPRSS4 表達(dá)而實(shí)現(xiàn)目的。

綜上所述，IL-17 可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，miR-612 過表達(dá)可通過調(diào)控TMPRSS4 表達(dá)而抑制IL-17 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的促進(jìn)作用，為揭示炎癥與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可為胃癌分子靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。