miR-335-5p 通過靶向調(diào)控GRK4 對ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制

黃威 饒艷玲 （ 武漢市第三醫(yī)院老年病科,湖北 武漢 430060; 武漢市第五醫(yī)院中醫(yī)科）

血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）是血管壁的主要組成細(xì)胞，通過舒張和收縮改變血管直徑使血管保持適當(dāng)血壓，VSMCs 的衰老和DNA 氧化損傷是導(dǎo)致動脈粥樣硬化（AS）的重要因素，AS 又是導(dǎo)致大多數(shù)心臟病和腦卒中的主要原因〔1，2〕。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）主要由活性氧（ROS）生成增多并氧化修飾LDL 產(chǎn)生，可與多種受體結(jié)合造成脂質(zhì)聚積，形成泡沫細(xì)胞，還具有損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)VSMCs 增殖、遷移及炎性細(xì)胞因子釋放等作用，參與、促進(jìn)了AS 的發(fā)生和發(fā)展〔3〕。近年來發(fā)現(xiàn)miRNAs 參與心血管生理、病理過程的調(diào)控并且通過調(diào)節(jié)血管活性分子、細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)VSMC 細(xì)胞的功能，在血管損傷、重塑相關(guān)疾病中具有重要調(diào)節(jié)作用，是心血管疾病中的重要調(diào)控因子〔4〕。miR-335-5p 在敗血癥小鼠模型中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)的miR-335-5p 通過激活腺苷單磷酸激活蛋白激酶（AMPK）/自噬激活激酶（ULK）1 信號通路靶向脂肪酸合成酶（FASN）調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的促凋亡因子和抗細(xì)胞凋亡因子，促進(jìn)自噬，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，從而減輕膿毒癥小鼠模型的炎癥反應(yīng)〔5〕。G 蛋白耦聯(lián)受體激酶（GRK）4 屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，可通過調(diào)節(jié)膜蛋白受體而發(fā)揮多種生物學(xué)作用，研究發(fā)現(xiàn)GRK4 與VSMC 的功能調(diào)節(jié)有關(guān)，GRK4 在ox-LDL 刺激的VSMC 中高表達(dá)，干擾GRK4，平滑肌細(xì)胞增殖減弱〔6〕。但miR-335-5p 對ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMCs 損傷的影響及是否用過調(diào)控GRK4 影響平滑肌細(xì)胞損傷還尚未清楚。本實驗旨在研究miR-335-5p 對ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMCs 損傷的作用及其機(jī)制，為AS 的預(yù)防和治療提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人主動脈血管平滑肌細(xì)胞HA-VSMC購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Sigma公司；ox-LDL 購自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen 公司；Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio 公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RIPA 蛋白裂解液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)HAVSMC，每天換液一次，將融合至80%左右的細(xì)胞適量胰酶消化并重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×105個/ml，取100 μl 接種至96 孔板，加入終濃度為50 mg/ml的ox-LDL，然后在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞備用，作為ox-LDL 處理組，以不添加ox-LDL 培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照（Con）組。將miR-NC、miR-335-5p、anti-miR-NC、anti-miR-335-5p 分別轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的HA-VSMC 細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-335-5p 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-335-5p組。用含50 mg/ml ox-LDL、5% 胎牛血清的DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)HA-VSMC 細(xì)胞1 h，然后按照Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑說明書將miR-NC、miR-335-5p、si-NC、si-GRK4 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HA-VSMC 細(xì)胞中再培養(yǎng)24 h，分別記為ox-LDL+miR-NC 組、ox-LDL+miR-335-5p 組、ox-LDL+si-NC 組、ox-LDL+si-GRK4組。將miR-335-5p 分別與pcDNA、pcDNA-GRK4 共轉(zhuǎn)染至ox-LDL 處理的細(xì)胞中再培養(yǎng)24 h，分別記為ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 組、ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA-GRK4 組。每組設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測miR-335-5p 和GRK4 mRNA表達(dá)水平 提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔，循環(huán)條件為95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40 個循環(huán)；72℃延長5 min。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3 Western 印跡檢測蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解，4℃，10 000 r/min 離心15 min，收集蛋白上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗（1 ∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3 次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個蛋白樣品重復(fù)3 次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，PBS 漂洗2 次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm 處的熒光強(qiáng)度。實驗重復(fù)3 次。

1.2.5 ELISA 檢測白細(xì)胞介素（IL）-1β 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 的表達(dá) 取各組細(xì)胞，離心取上清，然后按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-335-5p 對GRK4 的靶向調(diào)控 TargetScan 數(shù)據(jù)庫顯示GRK4 3＇UTR 區(qū)域有miR-335-5p 結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)GRK4 的3＇UTR-熒光素酶表達(dá)載體（WT-GRK4 和MUT-GRK4），取對數(shù)生長期血管平滑肌細(xì)胞接種于24 孔板（5×104個/孔），待細(xì)胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-GRK4 和MUT-GRK4 組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNC 和miR-335-5p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla 活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL 處理對HA-VSMC 細(xì)胞中miR-335-5p和GRK4 表達(dá)的影響 與Con 組相比，ox-LDL 組細(xì)胞中miR-335-5p 的表達(dá)水平顯著降低，GRK4 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.001）。見圖1，表1。

表1 ox-LDL 處理對HA-VSMC 細(xì)胞中miR-335-5p 和GRK4 表達(dá)的影響(,n=9)

表1 ox-LDL 處理對HA-VSMC 細(xì)胞中miR-335-5p 和GRK4 表達(dá)的影響(,n=9)

圖1 GRK4 蛋白表達(dá)

2.2 miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 與Con 組相比，ox-LDL組miR-335-5p 的表達(dá)水平顯著降低；與ox-LDL+miRNC 組相比，ox-LDL+miR-335-5p 組miR-335-5p 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與Con 組相比，ox-LDL組IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)水平顯著升高；與ox-LDL+miR-NC 組相比，ox-LDL+miR-335-5p 組IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及凋亡的影響(,n=9)

表2 miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及凋亡的影響(,n=9)

與Con 組比較:1）P＜0.05；與ox-LDL+miR-NC 組比較:2）P＜0.05

2.3 miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HAVSMC 細(xì)胞凋亡的影響 與Con 組相比，ox-LDL 組Bcl-2 表達(dá)水平及凋亡率顯著降低，Bax、cleavedcaspase3 表達(dá)水平顯著升高；與ox-LDL+miR-NC 組相比，ox-LDL+miR-335-5p 組Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高，Bax、cleaved-caspase3 表達(dá)水平及凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表2、圖3。

圖2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 細(xì)胞凋亡流式圖

2.4 抑制GRK4 表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞損傷的影響 與ox-LDL+si-NC 組相比，ox-LDL+si-GRK4 組Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高，Bax、cleaved-caspase3、GRK4 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、IL-1β、IFNα 水平均顯著降低（P＜0.05）。見表3、圖4。

圖4 GRK4 和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 抑制GRK4 表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

表3 抑制GRK4 表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞損傷的影響(,n=9)

與Con 組比較:1）P＜0.05；與ox-LDL+si-NC 組比較:2）P＜0.05

2.5 miR-335-5p 靶向調(diào)控GRK4 的表達(dá) 通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到GRK4 與miR-335-5p 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖5）。熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果（表4）顯示，相較于miR-NC 組，miR-335-5p 組WTGRK4 熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；MUTGRK4 熒光素酶活性差異不顯著。相較于miR-NC組，miR-335-5p GRK4 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（0.46±0.04 vs 0.23±0.02，P＜0.05）；相較于antimiR-NC 組，miR-335-5p 組GRK4 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（0.44±0.04 vs 0.94±0.08，P＜0.05）。見圖6。

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

表4 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

圖5 GRK4 的3′UTR 中含有與miR-335-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列

圖6 GRK4 蛋白表達(dá)

2.6 GRK4 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞損傷的作用 與ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 組相比，ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA-GRK4 組Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，Bax、cleaved-caspase3、GRK4 表達(dá)水平、凋亡率、IL-1β、TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05）。見圖7、表5。

圖7 GRK4 和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表5 GRK4 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞損傷的作用(,n=9)

表5 GRK4 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL 誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞損傷的作用(,n=9)

與ox-LDL+miR-NC 組比較:1）P＜0.05；與ox-LDL+miR-335-5p+pcDNA 組比較:2）P＜0.05

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷等所導(dǎo)致的分泌功能失調(diào)和平滑肌細(xì)胞的異常增殖而引起的血管腔狹窄和痙攣是多種血管疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)〔7〕；AS 是一種脂質(zhì)代謝與炎癥性血管疾病，炎癥在AS 發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到廣泛關(guān)注，有報道發(fā)現(xiàn)ox-LDL可以通過觸發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AS 的發(fā)生、形成〔8〕。TNF-α 和IL-1β 是與AS 有關(guān)的炎性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)血管炎癥發(fā)生〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1β 和TNF-α 在ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMCs 中mRNA 水平大大提高，苦參堿在抑制它們的表達(dá)后抑制了VSMCs 增殖和凋亡〔10〕。TNF-α 和IL-1β 下調(diào)表達(dá)，可減弱炎癥反應(yīng)，延緩慢性牙周炎發(fā)展〔11〕。本研究結(jié)果顯示在ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中TNF-α 和IL-1β 下均高表達(dá)，ox-LDL 促進(jìn)VSMC 細(xì)胞的凋亡。而VSMC的凋亡和增殖失衡促進(jìn)AS 的發(fā)生發(fā)展〔12〕。

miRNA 參與調(diào)控血脂代謝、血管炎癥、血管內(nèi)皮細(xì)胞及VSMCs 與AS 發(fā)病機(jī)制相關(guān)〔13〕。研究表明，miR-335-5p 在骨關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，可能是骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)基因〔14〕。高糖狀態(tài)下，miR-335-5p 表達(dá)水平下調(diào)，高表達(dá)通過抑制DKK1 的蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)在ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中miR-335-5p 低表達(dá)，過表達(dá)miR-335-5p 炎癥因子TNF-α、IL-1β 釋放減少，細(xì)胞凋亡率降低。說明過表達(dá)miR-335-5p 可保護(hù)ox-LDL 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷。

GRK4 是GRK 家族的一員，廣泛存在于各種組織，能特異地磷酸化G 蛋白耦聯(lián)受體（GPCRs）使其脫敏，從而使受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)消失或者降低，且還能介導(dǎo)炎性介質(zhì)所致細(xì)胞損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，GRKs 磷酸化GPCR 在炎癥誘導(dǎo)細(xì)胞損傷過程中起一定調(diào)控作用〔16〕。GRK4 通過對內(nèi)皮素B 型受體的異常調(diào)節(jié)，參與了原發(fā)性高血壓發(fā)生與發(fā)病〔17〕。GRK4 還可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老〔18〕。GRK4 能夠調(diào)控大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞AT 受體蛋白表達(dá)及其磷酸化狀態(tài)，影響心血管相關(guān)疾病〔19〕。GRK4上調(diào)腎臟AT1 受體表達(dá)，增加了腎臟氧化應(yīng)激水平和腎小管細(xì)胞凋亡，加重了腎臟缺血再灌注損傷〔20〕。本研究中ox-LDL 能促進(jìn)HA-VSMC 細(xì)胞中GRK4 表達(dá)，抑制表達(dá)GRK4 炎癥因子TNF-α、IL-1β釋放減少，細(xì)胞凋亡率降低。說明且GRK4 低表達(dá)可以保護(hù)ox-LDL 引起的血管平滑肌細(xì)胞損傷。且本研究還發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 靶向調(diào)控GRK4 的表達(dá)，GRK4 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-335-5p 過表達(dá)對ox-LDL誘導(dǎo)的HA-VSMC 細(xì)胞損傷的作用。提示，miR-335-5p可能通過調(diào)控GRK4 進(jìn)而影響炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞損傷的作用。

綜上所述，miR-335-5p 通過抑制GRK4 的表達(dá)和TNF-α、IL-1β 的分泌對ox-LDL 能夠誘導(dǎo)HAVSMC 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用?？蔀锳S 及VSMCs損傷導(dǎo)致的相關(guān)心血管疾病的預(yù)防和治療提供新思路和新靶點(diǎn)。