瑞舒伐他汀對(duì)心肌梗死大鼠心功能及心肌纖維化的影響及可能機(jī)制

周肖龍 茍春霞 成文娜 張金杰 汪秀華

（1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部,山東 濱州 256601;2 山東省博興縣人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科）

心肌梗死（MI）是由于冠狀動(dòng)脈缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生壞死的一類疾病，有發(fā)病急、病情兇險(xiǎn)、病死率高的特點(diǎn)〔1〕。MI 還往往伴有心力衰竭、心源性休克、心肌梗死灶形成附壁血栓、心臟破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥，因此給予積極有效的治療有重要的臨床意義〔2〕。目前，臨床治療MI 多應(yīng)用他汀類藥物，該類藥物有多向性效應(yīng)，能調(diào)節(jié)血脂，還有抑制炎癥因子釋放、改善血管內(nèi)皮功能、抑制血小板聚集、抑制心臟纖維化等多種作用〔3〕。瑞舒伐他汀是他汀類藥物中的代表性藥物，能抑制心肌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)心肌肥大，重塑心室肌細(xì)胞，對(duì)心肌有保護(hù)作用，有高選擇性、低代謝率的優(yōu)點(diǎn)，然而其作用機(jī)制尚不明確〔4〕。本研究探討瑞舒伐他汀對(duì)MI 心功能及心肌纖維化的影響及可能調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar 大鼠，雄性，體重（221.46 ±20.15）g，購(gòu)自濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證為:2015-0004。上海碧云天提供Western 印跡所需細(xì)胞裂解液、蛋白上樣緩沖液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗、ECL 發(fā)光液等各種試劑；PowerPac 300 型電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；Bio-Rad 凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。瑞舒伐他汀購(gòu)自阿斯利康藥業(yè)有限公司，規(guī)格10 mg/片，生產(chǎn)批號(hào) 152618；大鼠白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-10 及腫瘤壞死因子（TNF）-α 的多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)為20151022、20150817、20 151130；Vevo2100 型超高分辨率小動(dòng)物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)FUJIFILM VisualSonics 公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將60 只Wistar 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、假手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組，每組各20 只。

1.2.2 MI 大鼠模型構(gòu)建 用40 mg/kg 的戊巴比妥鈉對(duì)各組進(jìn)行腹腔麻醉，然后口腔氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸比為2 ∶1，呼吸頻率為60～65 次/min，潮氣量為30 ml/kg。各組均去除胸毛，待大鼠呼吸平穩(wěn)后，沿著胸骨左側(cè)縱向切開(kāi)胸腔以充分暴露心臟，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠用7 號(hào)絲線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支并結(jié)扎，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，清除瘀血并排除氣體后逐層關(guān)閉胸腔，縫合胸腔。結(jié)扎后肉眼能看到結(jié)扎局部和左心室的前壁呈現(xiàn)出灰白色到紫紺色，心電圖顯示Ⅱ肢體導(dǎo)聯(lián)ST 段弓背向上抬高15 min 以上，表明心肌梗死結(jié)扎成功，提示MI 大鼠模型構(gòu)建成功。

1.2.3 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第1 天開(kāi)始給予瑞舒伐他汀，灌胃，2 mg/kg，1 次/d；模型組和假手術(shù)組均給予等劑量的0.9%的氯化鈉溶液，灌胃，1 次/d。3 組均干預(yù)4 w。

1.2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 干預(yù)結(jié)束后，用彩色多普勒超聲診斷儀對(duì)大鼠進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)，記錄左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）及左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）。干預(yù)結(jié)束后，大鼠均行眼球采血，然后斷頭法處死大鼠后摘取心臟，采集基底部梗死區(qū)、間質(zhì)心肌組織及心內(nèi)膜下區(qū)組織。對(duì)獲得的組織進(jìn)行石蠟切片，然后進(jìn)行HE 染色。用MiVnt圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各區(qū)域心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），CVF=心肌膠原面積/視野面積×100%，計(jì)算3 次取平均值。將各組心肌組織進(jìn)行研磨勻漿，提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量，然后取其中的50 μg 進(jìn)行檢測(cè)。采用Western 印跡檢測(cè)心肌組織IL-1β、IL-10、TNF-α 蛋白表達(dá)。將各組大鼠的心肌組織置于組織勻漿器，以1 ∶5比例加細(xì)胞裂解液進(jìn)行勻漿，以12 000 r/min 的離心速率，離心5 min，離心半徑15 cm，取上清液與2 倍稀釋的上樣緩沖液等量混勻，100℃水浴加熱3 min，冷卻后取15 μl 上樣，做十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的PBS 溶液室溫封閉2 h，用相應(yīng)大鼠多克隆抗體4℃反應(yīng)過(guò)夜，將膜取出，PBS 液洗滌3次，加入二抗溶液（羊抗兔/兔抗鼠IgG）搖床孵育1 h，洗膜后加入ECL 發(fā)光液，應(yīng)用Bio-Rad 凝膠成像分析系統(tǒng)成像，并用Image Lab 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3 組心功能比較 3 組LVEF 比較:假手術(shù)組＞實(shí)驗(yàn)組＞模型組（均P＜0.05）；3 組LVESD、LVEDD 比較:模型組＞實(shí)驗(yàn)組＞假手術(shù)組（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 3 組CVF 比較 3 組梗死區(qū)、心內(nèi)膜下區(qū)及間質(zhì)組織CVF 比較:模型組＞實(shí)驗(yàn)組＞假手術(shù)組（均P＜0.05）。見(jiàn)表1，圖1。

圖1 三組心肌膠原染色(HE,×200)

表1 3 組心功能、CVF、心肌組織IL-1β、IL-10 及TNF-α 蛋白相對(duì)表達(dá)比較(,n=20)

表1 3 組心功能、CVF、心肌組織IL-1β、IL-10 及TNF-α 蛋白相對(duì)表達(dá)比較(,n=20)

與模型組比較:1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較:2）P＜0.05

2.3 3 組心肌組織IL-1β、IL-10 及TNF-α 蛋白表達(dá)比較 3 組心肌組織IL-1β、TNF-α 比較:模型組＞實(shí)驗(yàn)組＞假手術(shù)組（均P＜0.05）；而3 組IL-10 比較:假手術(shù)組＞實(shí)驗(yàn)組＞模型組（均P＜0.05）。見(jiàn)表1，圖2。

圖2 3 組心肌組織中IL-1β、IL-10、TNF-α 蛋白表達(dá)

3 討論

近年來(lái)，MI 的發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康〔5〕。目前，MI 的臨床治療主要以減小梗死面積、保護(hù)心肌功能、挽救瀕死心肌及治療各種并發(fā)癥為原則，多采用鎮(zhèn)靜止痛、調(diào)整血容量、抗心律失常、溶栓、冠狀動(dòng)脈介入等措施，由于MI病情兇險(xiǎn)，治療效果一直并不理想〔6，7〕。瑞舒伐他汀是一種新型的他汀類藥物，屬于選擇性HMG-CoA還原酶抑制劑，主要通過(guò)抑制HMG-CoA 的合成來(lái)減少膽固醇的生成，在臨床上多用于高脂血癥和高膽固醇血癥的治療〔8〕。研究報(bào)道，瑞舒伐他汀對(duì)心功能損傷、心室肌細(xì)胞重構(gòu)、心肌梗死后細(xì)胞凋亡等都有明顯的改善作用〔9〕，然而對(duì)于其作用機(jī)制仍然不明確。

本研究結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組心功能有明顯改善，心肌纖維化明顯延緩。研究表明，MI 會(huì)導(dǎo)致心肌局部血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血缺氧，心功能下降，心臟血流動(dòng)力學(xué)改變，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)被激活從而引發(fā)心室重構(gòu)，而心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)為心肌纖維化〔10，11〕。因此，對(duì)心功能和心肌纖維化改善指標(biāo)的評(píng)價(jià)能用于評(píng)估MI 預(yù)后。有研究報(bào)道，瑞舒伐他汀有多方面的作用，能調(diào)節(jié)血脂水平，還能抑制炎癥遞質(zhì)釋放、抑制血小板聚集、穩(wěn)定斑塊、抑制心臟纖維化及改善血管內(nèi)皮功能等〔12，13〕。瑞舒伐他汀能通過(guò)調(diào)節(jié)血管的內(nèi)皮功能來(lái)發(fā)揮保護(hù)心臟作用，從而減小梗死范圍擴(kuò)大，減輕再灌注導(dǎo)致的損傷〔14〕。有研究報(bào)道，瑞舒伐他汀可能通過(guò)抑制RhoA/ROCK 活化和介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)發(fā)揮療效〔15〕。本研究結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組體內(nèi)的炎癥反應(yīng)受到明顯的抑制。研究表明，再灌注損傷是AMI患者致死的主要原因，再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)炎癥因子水平明顯升高，炎癥因子增加又會(huì)進(jìn)一步加重缺血性損傷，導(dǎo)致可逆性的缺血性損傷轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嫘缘膿p傷〔16〕。另外有文獻(xiàn)報(bào)道〔17〕，IL-6 會(huì)引起TNF-α 的生成，兩者血清水平與炎癥反應(yīng)正相關(guān)，TNF-α 會(huì)導(dǎo)致血管功能的紊亂和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，其參與心肌纖維化的整個(gè)過(guò)程。IL-1β 是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在MI 初期就會(huì)明顯增加，其血清水平與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)。IL-10 是一種由Th2 細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞生成的因子，能抑制前炎癥細(xì)胞因子的生成，增強(qiáng)天然免疫功能。研究報(bào)道，瑞舒伐他汀下調(diào)IL-1β、TNF-α 的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)，可能與其阻滯多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（PARP）-1 的活化，從而阻滯心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)〔18〕。

綜上，瑞舒伐他汀能改善MI 大鼠的心功能，延緩心肌纖維化改變，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。