黃葵膠囊通過抑制Notch 信號通路減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷

黃麗麗 吳強 石偉榮 閆超

（福建中醫(yī)藥大學 1 附屬第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科,福建 福州 350003;2 附屬人民醫(yī)院傳統(tǒng)病房）

糖尿病腎病是指糖尿病引起的腎臟微血管并發(fā)癥，其特點是蛋白尿和腎功能進行性減退，最終進展到終末期腎病，已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一〔1〕。黃葵膠囊的主要成分是黃蜀葵花，具有利尿通淋、消腫解毒的作用〔2〕。有研究證明，黃葵膠囊可降低糖尿病腎病循環(huán)系統(tǒng)免疫復合物，此外還可利水消腫和降低尿蛋白〔3〕。但黃葵膠囊對糖尿病腎病的作用和機制尚未完全闡明。本研究使用高糖刺激腎小管上皮細胞模擬糖尿病腎病體外模型，旨在探究黃葵膠囊對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株:人腎小管上皮HK-2 細胞，購自美國ATCC。藥品與試劑:黃葵膠囊，規(guī)格:0.34 g/粒，生產(chǎn)批 號:20012909，國藥準 字:Z19990040。江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)。DMEM 低糖液體培養(yǎng)基、DMEM 高糖液體培養(yǎng)基和CCK-8 試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；胎牛血清，美國ThermoFisherScientific 公司生產(chǎn)；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-6、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，欣博盛生物科技有限公司生產(chǎn)；一抗兔多克隆抗體神經(jīng)源性位點缺口同源蛋白（Notch）1，兔單克隆抗體Hes1，兔單克隆抗體蛋白鋸齒（Jagged）1，兔多克隆抗體GAPDH，二抗山羊抗兔IgG H&L，英國Abcam 公司生產(chǎn)。儀器:PR4100 酶標儀，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；EVOS 熒光顯微鏡，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 細胞分組與培養(yǎng) 將1 g 黃葵膠囊粉末溶于1 ml生理鹽水中，制備成濃度為1 g/ml 的混懸液。根據(jù)參考文獻〔4〕方法操作，將HK-2 細胞接種于含低糖（5.6 mmol/L D-葡萄糖）DMEM 的培養(yǎng)基中，在37℃，含5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合達80%時，加入0.25%胰酶消化4 min，然后取1×106個細胞接種于新的培養(yǎng)基，將HK-2 細胞隨機分成對照組（含5.6 mmol/L D-葡萄糖）、高糖組（含25 mmol/L D-葡萄糖）、實驗組（含25 mmol/L D-葡萄糖和1 g/ml 黃葵膠囊粉末混懸液）。

1.3 以ELISA 測定HK-2 細胞TNF-α 和IL-6 含量 根據(jù)參考文獻〔5〕的方法，收集各組細胞上層清液，置于EP 管中，然后離心，將上清液移至新的EP管中。按ELISA 說明書要求設(shè)置空白孔、標準孔和待測樣品孔。封板后于37℃孵育箱孵育，90 min 后甩干，每孔加入350 μl 洗滌液，30 s 后甩干，重復5 次。除空白孔，其余孔加入酶結(jié)合物稀釋液100 μl，于37℃孵育箱孵育避光15 min 后，向每孔加入終止液100 μl，用酶標儀測量各孔450 nm 處的吸光度，根據(jù)標準曲線得出各組上清液IL-6 和TNF-α 的濃度。

1.4 以CCK-8 實驗檢測HK-2 細胞存活率〔6〕取各組HK-2 細胞用胰蛋白酶消化后計數(shù)，以每孔5 000個細胞的密度接種于96 孔板上，隨后于每孔加入10 μl CCK-8 溶液，另設(shè)置空白孔，將96 孔板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后，用酶標儀測量450 nm處OD 值，根據(jù)公式計算細胞存活率。細胞存活率=〔（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）〕×100%

1.5 以TUNEL 法檢測HK-2 細胞凋亡率 根據(jù)參考文獻〔7〕的方法，將HK-2 細胞接種于48 孔板，24 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，棄去PBS，用免疫染色固定液固定30 min，30 min 后棄去細胞固定液，PBS 洗滌，用Triton 孵育5 min，PBS 洗滌，隨后用TUNEL 工作液避光孵育1 h，用PBS 洗去TUNEL工作液，DAPI 復染，隨后于每孔滴加熒光淬滅劑，最后在熒光顯微鏡下拍照記錄。

1.6 以Western 印跡檢測HK-2 細胞Notch1、Hes1、Jagged1 表達〔8〕收集對照組、高糖組和實驗組人腎小管上皮細胞，于冰上加入裂解液，30 min 后刮取細胞，離心，提取上層清液為細胞總蛋白，用BCA 蛋白試劑盒定量，取50 μg 總蛋白，煮沸樣本5 min，離心后上樣，于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)于聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA 封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，第2 天加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3 次后即用電化學發(fā)光（ECL）顯色劑曝光，使用Quantity One 分析目的條帶灰度值。其中一抗稀釋濃度分別為:Notch1（1 ∶1 000）、Hes1（1 ∶1 000）、Jagged1（1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶1 000），二抗稀釋濃度為1 ∶2 000。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進行One-way ANOVA 檢驗、LSD 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組HK-2 細胞TNF-α 和IL-6 含量比較 與對照組相比較，高糖組TNF-α、IL-6 濃度顯著增高（P＜0.05），與高糖組相比較，實驗組TNF-α、IL-6 濃度顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組IL-6 和TNF-α 含量比較(,pg/ml,n=7)

表1 各組IL-6 和TNF-α 含量比較(,pg/ml,n=7)

與對照組比較:1）P＜0.05；與高糖組比較:2）P＜0.05

2.2 各組HK-2 細胞的存活率比較 與對照組〔（100.00±0.00）%〕相比較，高糖組HK-2 細胞的存活率〔（76.52±5.14）%〕顯著降低，與高糖組相比較，實驗組〔（91.33±7.12）%〕顯著增高（均P＜0.05）。

2.3 各組HK-2 細胞凋亡率比較 與對照組〔（8.21 ±0.74）%〕 相比較，高糖組細胞凋亡率〔（17.43±1.26）%〕顯著增高；與高糖組比較，實驗組〔（11.53±1.27）%〕顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 TUNEL 法檢測各組細胞凋亡率(DAPI,×200)

2.4 黃葵膠囊對各組HK-2 細胞Notch1、Hes1 和Jagged 1 蛋白表達的影響 對照組、高糖組和實驗組Notch1 相對表達量分別為（0.92±0.08、2.33±0.17、1.32±0.11）；Hes1 相對表達量分別為（0.74±0.09、2.47±0.21、1.37±0.15）；Jagged1 相對表達量分別為（0.54±0.07、2.67±0.22、1.29±0.11）。與對照組相比較，高糖組Notch1、Hes1 和Jagged1 相對表達量顯著增高（P＜0.05）；與高糖組相比較，實驗組Notch1、Hes1 和Jagged1 相對表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞中Notch1、Hes1 和Jagged1 的相對表達

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最常見、最嚴重的慢性并發(fā)癥。既往研究顯示炎癥與糖尿病腎病密切相關(guān)，在高糖環(huán)境里，腎小管上皮細胞IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子釋放會增加，直接促使腎小管上皮細胞損傷〔5〕。黃葵膠囊可用于治療腎病綜合征、糖尿病腎病、原發(fā)性腎小球腎炎〔9〕。有研究表明黃葵膠囊能通過減輕炎癥反應、下調(diào)致纖維化細胞因子表達、抑制氧化應激和減少糖基化終末產(chǎn)物改善糖尿病腎病〔10〕。Notch 信號通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，該通路參與急性腎損傷、腎小球病變、腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。在糖尿病腎病中，Notch 信號通路的過度激活會導致足細胞損傷引起腎小球病變，同時還會誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)因子Snai2 表達，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，引起腎小管間質(zhì)纖維化〔11〕。另外，在高糖誘導的腎小管上皮細胞中，Notch 信號通路Hes1、Jagged1 和Notch1 蛋白會呈現(xiàn)高表達〔12，13〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃葵膠囊會抑制高糖誘導的HK-2細胞TNF-α 和IL-6 炎癥因子的分泌，同時提高HK-2 細胞存活率，抑制凋亡率，并降低Notch 信號通路中Notch1、Hes1 和Jagged1 蛋白的表達。

綜上，黃葵膠囊能顯著抑制腎小管上皮細胞炎癥因子的分泌，并通過降低Notch 信號通路相關(guān)蛋白表達，來減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷。然而本研究僅限于體外實驗，今后將開展體內(nèi)實驗進一步驗證該結(jié)論。