抑制CTNNA3 表達(dá)對小鼠哮喘模型肺部氣道炎癥的影響

田迎 寧艷碩 王晶 張菊香 趙衛(wèi)國 王品 彭鈺紅 高春蕾

（1 哈勵遜國際和平醫(yī)院,河北 衡水 053000;2 河北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院）

哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與調(diào)控的嚴(yán)重危害人和動物健康的慢性氣道炎癥性疾病，表現(xiàn)為慢性氣道炎癥，氣道功能下降和氣道重塑〔1〕。我國第3 次城市老年哮喘流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，全國城市2010 年哮喘患病率為3.02%〔2〕，嚴(yán)重影響了患者的生命質(zhì)量和家庭幸福感。重癥哮喘患者即使使用高劑量糖皮質(zhì)激素和長效β2激動劑仍無法有效控制病情〔3〕。盡管重癥哮喘患者為數(shù)不多，但其所需的治療費(fèi)用卻占哮喘總費(fèi)用的一半〔4〕。目前針對重癥哮喘患者并沒有較為有效的治療方法。研究顯示，由CTNNA3 編碼的αT-鈣黏著蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（αT-cat）基因多態(tài)性與哮喘的惡化程度相關(guān)〔5，6〕。α-catenins 是鈣黏蛋白和細(xì)胞骨架的肌動蛋白絲之間的連接蛋白，是整個機(jī)體組織中主要的細(xì)胞黏附系統(tǒng)〔7〕。α-catenins 有3 種形態(tài)，即αE-cat、αN-cat 和αT-cat〔8〕。其中，αT-cat 在功能上似可有可無，小鼠敲除αT-cat 后仍可正常存活及繁殖〔9〕。然而，隨著年齡的增長及射血分?jǐn)?shù)降低，這些基因敲除小鼠可發(fā)生心肌病，這與αT-cat 在心臟中富集表達(dá)是一致的〔10〕。文獻(xiàn)報道，αT-cat 在肺部也有表達(dá)，但在肺組織中表達(dá)更廣泛的是αE-cat，αT-cat 的表達(dá)極少，僅圍繞肺靜脈心肌細(xì)胞的細(xì)胞層〔11〕。在小鼠過敏性哮喘模型中，有研究者觀察到肺靜脈周圍總有炎癥發(fā)生〔12〕，但αT-cat 在調(diào)節(jié)氣道炎癥方面的作用目前尚不清楚。本研究采用卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)建立CTNNA3 敲低小鼠過敏性哮喘模型，研究CTNNA3 對過敏性小鼠哮喘模型中肺靜脈炎癥的影響，鑒于αT-cat 僅在肺靜脈周圍表達(dá)，假設(shè)αT-cat 通過調(diào)控肺靜脈周圍組織炎癥來參與氣道炎癥過程，以此探討CTNNA3 在調(diào)節(jié)哮喘發(fā)作中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 OVA 及αT-cat 單克隆抗體（#952）及硫酸鋁鉀（分析純）（美國 Sigma 公司）；PARIL30Y 高頻霧化器（德國百瑞公司）；多聚甲醛（天津市博愛化工）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒G1120（北京索萊寶）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-10、干擾素（IFN）-γ（武漢博士德）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（日本Takara 公司）；RT-PCR 引物、AAV-CTNNA3 腺相關(guān)病毒過表達(dá)重組載體（NM_001164376.1）、AAV-shCTNNA3 腺相關(guān)病毒敲低重組載體構(gòu)建及包被（上海生工生物），shCTNNA3 Oligo:上游引 物 5＇-CACCGCAGCAGTTACAAGACTCCTTGTTCT CGAAAGAACAAGGAGTCTTGTAACTGCTG-3＇，下游引 物5＇-AAAACAGCAGTTACAAGACTCCTTGTTCTTTCGAGAACAAGGAGTCTTGTAACTGCTGC-3＇。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及OVA 哮喘模型制備 實(shí)驗(yàn)分組:18～20 g C57BL/6 小鼠尾靜脈注射50 μl 重組腺病毒，敲低病毒注射（AAV-shCTNNA3）滴度為1×108PFU/ml，過表達(dá)病毒注射（AAV-CTNNA3）滴度5×108PFU/ml。實(shí)驗(yàn)分組如下:control 組、AAV-shCTNNA3 組、control+OVA 組、AAV-shCTNNA3+OVA組、AAV-CTNNA3 及AAV-CTNNA3+OVA 組，每組9只，共54 只，在末次OVA 激發(fā)24 h 后對其進(jìn)行氣道反應(yīng)檢測，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）、肺部灌洗液4℃保存并盡快對炎癥細(xì)胞數(shù)目及炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ 等指標(biāo)進(jìn)行測定，收集肺部氣道、肺及肺右上靜脈等組織進(jìn)行液氮凍存，測定CTNNA3 表達(dá)、炎癥細(xì)胞因子等，以評價CTNNA3 對哮喘小鼠氣道炎癥的促進(jìn)作用。

OVA 小鼠哮喘模型制備:參考文獻(xiàn)〔13，14〕。各組先進(jìn)行1 w 的適應(yīng)性飼養(yǎng)。在第0、7、14 天，AAVshCTNNA3 組、AAV-shCTNNA3+OVA 組及AAV-CTNNA3+OVA 組均腹腔注射 OVA 致敏液（250 μg/ml），0.1 ml/只，而control 組、control+OVA組及AAV-CTNNA3 組注射等量的磷酸鹽緩沖液（PBS）。在第24～27 天，各組經(jīng)乙醚麻醉后滴鼻OVA 激發(fā)液，50 ml/只，并對致敏后進(jìn)行激發(fā)的各組小鼠行為學(xué)觀察。

1.3 高頻振蕩法 末次OVA 激發(fā)24 h 后，各組通過Buxco 肺功能儀來測定氣道反應(yīng)性的強(qiáng)弱。具體方法為:利用2%戊巴比妥鈉鹽（55 mg/kg）麻醉小鼠進(jìn)行氣管插管并連接小動物呼吸機(jī)，頻率2 000 r/min，潮氣量0.14～0.16 ml，以此測定各組小鼠的氣道壓力，并計(jì)算氣道阻力值（RI）。每次霧化之后均進(jìn)行記錄。用來激發(fā)的乙酰甲膽堿（mCh）的濃度梯度為:0、5、10、25、50、100、200 mg/ml。測定結(jié)果進(jìn)行分析，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 支氣管肺泡灌洗（BAL）收集BALF:測定小鼠反應(yīng)性后，使用氣管插管到肺段，向支氣管肺泡內(nèi)快速注4℃預(yù)冷滅菌生理鹽水1 ml 后，在80～100 mmHg負(fù)壓下吸引回收液，反復(fù)灌洗2～3 次，收集1 ml BALF 進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)。步驟如下:①BALF 細(xì)胞沉淀作涂片；②4%多聚甲醛固定，姬姆薩染液染色；③計(jì)數(shù)細(xì)胞，于顯微鏡下觀察細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)用白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)器進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，每張片計(jì)數(shù)200 個細(xì)胞，最終細(xì)胞數(shù)=各類細(xì)胞總數(shù)×百分比；每組重復(fù)3 次；④在剩余細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷PBS，吹打混勻，吸取1 ml 用智能細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，余下細(xì)胞進(jìn)行ELISA 測定細(xì)胞因子。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR 截取各組肺組織及右肺上靜脈段樣本約20 mg，分別用Trizol 勻漿提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR 體系參考Takara 產(chǎn)品使用說明書，PCR 引物序列CTNNA3:正義鏈:5＇-AGCGAAATTGACTGCCCCAC-3＇，反義鏈:5＇-CTGACATGCTGCCTTTCTGTT-3＇；GAPDH:正 義鏈:55＇-GGAGTCCACTGGTGTCTTCA-3＇，反義鏈:5＇-GGGAACTGAGCAATTGGTGG-3＇。每個樣本3 個復(fù)孔，按兩步法PCR 擴(kuò)增，條件為Step 1:95℃30 s；Step 2:95℃5 s，60℃30 s（40 cycles）。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RT-PCR 的擴(kuò)增曲線及溶解曲線是否滿足要求，儀器軟件中自動輸出Ct 值，計(jì)算相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法。

1.6 Western 印跡 收集各組肺組織及右肺上靜脈段樣本，提取各組織中的總蛋白并測定蛋白濃度，處理好的待測樣品取50 μg 蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)一抗孵育后，4℃過夜。TBST充分洗膜后，加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗后顯色液顯色照相。

1.7 HE 染色 各組小鼠在末次激發(fā)24 h 后取肺組織，于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，經(jīng)酒精脫水、二甲苯通透后進(jìn)行石蠟包埋，蠟塊切片厚度為0.8 μm。HE 染色后，在顯微鏡下對染色組織的炎癥情況進(jìn)行觀察。

1.8 ELISA 取各組小鼠肺靜脈組織樣本，加入等體積蛋白裂解液將勻漿組織，離心取上清液，并按試劑盒說明書設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及陰性對照等。按照劑盒說明書步驟處理收集樣本，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD 值，觀察記錄結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)觀察 control 組CTNNA3 mRNA水平（1.07 ±0.11）顯著高于AAV-shCTNNA3 組（0.39±0.15，P＜0.05），control 組aT-cat 蛋白水平（0.97±0.32）顯著高于AAV-shCTNNA3 組（0.47±0.07，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western 印跡檢測αT-cat 的表達(dá)

與control 組和AAV-shCTNNA3 組相比，control+OVA 組和AAV-shCTNNA3+OVA 組小鼠經(jīng)OVA 誘導(dǎo)后的行為學(xué)變化較大，激發(fā)過程中存在不同程度的抽搐、呼吸急促、煩躁不安等癥狀，激發(fā)第2 天則開始產(chǎn)生陽性反應(yīng)，大便次數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，control組〔（5 ± 2）次/d〕 和 AAV-shCTNNA3 組〔（6 ±1）次/d〕顯著低于control+OVA 組〔（11±2）次/d，P＜0.05〕 和 AAV-shCTNNA3+OVA 組〔（13 ±3）次/d，P＜0.05〕；呼吸頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，control組〔（118±9）次/min〕和AAV-shCTNNA3 組〔（106±13）次/min〕 顯著低 于control+OVA 組〔（153 ±11）次/min，P＜0.05〕和AAV-shCTNNA3+OVA 組〔（146±3）次/min，P＜0.05〕。

2.2 抑制αT-cat 表達(dá)可緩解OVA 誘導(dǎo)的過敏性哮喘 mCh 濃度為0、5、10、25、50、100、200 mg/ml 時control 組和AAV-CTNNA3 組氣道阻力值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；當(dāng)mCh 濃度為0、5、10 mg/ml時，control+OVA 組和AAV-CTNNA3+OVA組氣道阻力值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；當(dāng)mCh 濃度為25、50、100、200 mg/ml 時，control+OVA 組氣道阻力值均顯著高于AAV-CTNNA3+OVA組（均P＜0.05），見表1。control 組和AAV-CTNNA3組炎性細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；control+OVA 組炎性細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目均顯著高于AAV-CTNNA3+OVA 組（均P＜0.05）。見表2。表明下調(diào)CTNNA3 可能對過敏性哮喘模型小鼠有保護(hù)作用。

表1 各組氣道阻力值比較(,n=9,cmH2O·s/ml)

表1 各組氣道阻力值比較(,n=9,cmH2O·s/ml)

與control+OVA 組比較:1）P＜0.05；表2、3 同

表2 各組支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目比較(,n=9,×104 個/ml)

表2 各組支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)目比較(,n=9,×104 個/ml)

2.3 抑制αT-catenin 表達(dá)顯著降低OVA 模型小鼠肺靜脈中的炎癥反應(yīng) control 組和AAV-CTNNA3組IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；control+OVA 組IL-1β、IL-4 水平均顯著高于AAV-shCTNNA3+OVA 組，而IL-10、IFN-γ 水平均顯著低于AAV-shCTNNA3+OVA 組（均P＜0.05）。見表3、圖2。表明CTNNA3 可能在肺部靜脈組織OVA 激發(fā)情況下起著促進(jìn)作用。

圖2 下調(diào)αT-cat 減緩OVA 誘導(dǎo)的過敏性哮喘(HE,×200)

表3 各組肺靜脈組織中免疫細(xì)胞因子表達(dá)水平比較(,n=9,pg/ml)

表3 各組肺靜脈組織中免疫細(xì)胞因子表達(dá)水平比較(,n=9,pg/ml)

2.4 增加CTNNA3 表達(dá)促進(jìn)OVA 小鼠哮喘模型中肺靜脈炎癥 control 組CTNNA3 過表達(dá)后的mRNA相對表達(dá)量（1.05±0.08）顯著低于AAV-CTNNA3組（5.37±0.81，P＜0.05）。見圖3。未暴露于OVA中的CTNNA3 過表達(dá)小鼠AAV-CTNNA3 組炎癥因子IL-1β、IL-4 顯著高于control 組，IL-10、IFN-γ 顯著低于control 組（均P＜0.05）；而暴露于OVA 中的CTNNA3 過表達(dá)小鼠AAV-CTNNA3+OVA 組炎癥因子IL-1β、IL-4 顯著高于control+OVA 組，IL-10、IFNγ 顯著低于control+OVA 組（均P＜0.05）。見表4。

圖3 上調(diào)αT-cat 促進(jìn)OVA 模型中肺靜脈炎癥

表4 各處理組肺靜脈組織中免疫因子表達(dá)(,n=9,pg/ml)

表4 各處理組肺靜脈組織中免疫因子表達(dá)(,n=9,pg/ml)

與control 組比較:1）P＜0.05；與control+OVA 組比較:2）P＜0.05

2.5 肺靜脈炎癥促進(jìn)過敏性哮喘氣道炎癥的發(fā)生 control+OVA 組氣道炎癥明顯高于AAV-shCTNNA3+OVA 組，且與肺靜脈的距離越遠(yuǎn)，兩組氣道炎性細(xì)胞數(shù)目均降低（P＜0.05），見表5、圖4。

表5 各組炎性細(xì)胞數(shù)目比較(,n=9)

表5 各組炎性細(xì)胞數(shù)目比較(,n=9)

與control+OVA 組比較:1）P＜0.05；與本組前一距離比較:2）P＜0.05

圖4 肺靜脈炎癥促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生

3 討論

哮喘是一種由嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主并參與調(diào)控的慢性氣道炎癥〔15〕。哮喘治療不僅要對癥，更要控制潛在的氣道炎癥〔16〕。哮喘主要的防治方式是吸入糖皮質(zhì)激素。但重癥哮喘患者卻對這種激素治療方式有抵抗，無法有效控制病情〔3〕。研究數(shù)據(jù)顯示，攜帶αT-cat SNP 突變的哮喘患者對糖皮質(zhì)激素耐藥〔5〕。研究表明小鼠過敏性哮喘模型易引發(fā)肺靜脈炎癥〔6〕。本研究結(jié)果提示肺靜脈為中心的炎癥可能對氣道炎癥有顯著增強(qiáng)作用；小鼠哮喘模型中的肺靜脈炎癥促進(jìn)了過敏性氣道炎癥的發(fā)生，提示αT-cat 在過敏性氣道炎癥的發(fā)生中有促進(jìn)作用。

支氣管哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病〔17，18〕。研究顯示，支氣管哮喘的致病機(jī)制非常復(fù)雜，一般是在環(huán)境變應(yīng)原和遺傳因素雙重作用下影響Th1/Th2 細(xì)胞分化，導(dǎo)致哮喘的發(fā)生〔19〕。研究顯示支氣管哮喘氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制存在許多信號通路及靶點(diǎn)，如sFRP2 通過Wnt/β-catenin 途徑促進(jìn)COPD 氣道炎癥和Th17/Treg 失衡〔20〕。Brg1通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路加重哮喘氣道炎癥〔21〕。Rho 激酶抑制劑〔22〕、Sirtuins〔23〕等參與了支氣管哮喘發(fā)病過程，成為靶向治療支氣管哮喘的新靶點(diǎn)。本研究表明由CTNNA3 基因編碼的αT-cat在調(diào)節(jié)支氣管哮喘方面發(fā)揮重要作用，有望成為哮喘治療藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

目前治療支氣管哮喘主要是集中在癥狀緩解，尚無治愈支氣管哮喘的方法〔24，25〕。研究表明多種中藥制劑及活性化合物通過調(diào)控TGF-β、NF-κB 等炎癥信號的表達(dá)參與哮喘氣道炎癥。馬黃湯通過TLR9 通路改善支氣管哮喘癥狀〔26〕。表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過TGF-β1 通路改善哮喘小鼠氣道炎癥〔27〕。魚藤素通過抑制NF-κB 通路減輕小鼠過敏性氣道炎癥〔28〕。方消方通過抑制TGF-β/Smad3信號通路減輕哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑〔29〕。上述研究表明支氣管哮喘的治療除了對中藥復(fù)方及各種生物活性化合物的篩選外，其主要發(fā)病機(jī)制的研究及治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)也十分關(guān)鍵。