蒙藥德都紅花-7 味散對(duì)CCl4 所致肝纖維化大鼠Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達(dá)的影響

薛蘭 牧仁 徐艷華 陳紅梅 娜日蘇 巴圖德力根 韓志強(qiáng)

（1 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 通遼 028007;2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)）

肝纖維化（HF）在人群中的發(fā)病相當(dāng)普遍。乙型肝炎和丙型肝炎是引起肝纖維化和肝硬化的最常見(jiàn)疾病。蒙藥德都紅花-7 味散組方由紅花、天竺黃、藍(lán)盆花、木通、地丁、訶子、麻黃等7 味蒙藥組成，具有清肝熱功能，主治新舊肝病，肝損傷，肝血熱、眼睛發(fā)黃〔1〕。前期研究表明德都紅花-7 味散有對(duì)四氯化碳（CCl4）所致肝損傷具有明顯的降酶、保肝、抗纖維化，促進(jìn)HSC 細(xì)胞凋亡，抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）細(xì)胞增殖的作用〔2，3〕。本研究探討蒙藥德都紅花-7 味散對(duì)CCl4所致肝纖維化大鼠Bcl-2、Bcl-x蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及用藥 SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，體重180～220 g，許可證號(hào):SCXKC（吉）-2018-0007，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。水飛薊賓膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字H2040299，天津天士力圣特制藥有限公司，批號(hào):950 605007；德都紅花-7 味散，批準(zhǔn)文號(hào):內(nèi)衛(wèi)制字M13060134，購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，批號(hào)20191224。

1.2 主要試劑及儀器 橄欖油（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20 190129；CCl4（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20191010。Bcl-2、Affinity、批號(hào)6139；Bcl-x、CST、批號(hào)2764。激光共聚焦顯微鏡，Nikon（Japan），Eclipse Ti-E；全景切片掃描儀，PM2235 萊卡組織切片機(jī)、EG1150H 萊卡包埋機(jī)，萊卡公司；圖片分析軟件Media Cybemetics（U.S.A），Image-Pro Plus6.0。

1.3 動(dòng)物造模、分組、給藥 將34 只SD 雄性大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室1 w 后，按體重分層隨機(jī)分為空白組、模型組、水飛薊素組、德都紅花-7 味散組，每組10 只。除空白對(duì)照組，其他組腹腔注射CCl4橄欖油溶液2.0 ml/kg，造模1～2 w 腹腔注射10%的CCl4橄欖油溶液每周2 次，3～4 w 腹腔注射15%的CCl4橄欖油溶液每周2 次，5 w 腹腔注射20%的CCl4橄欖油溶液2 次，6、7 w 腹腔注射15%的CCl4橄欖油溶液每周1 次?？瞻讓?duì)照組和模型組灌胃蒸餾水，德都紅花-7 味散低劑量組按0.3 g/kg，水飛薊賓組21 mg/kg灌胃給藥，給藥7 w 后動(dòng)物禁食12 h，取肝組織%多聚甲醛固定〔4〕。

1.4 肝組織組織病理學(xué)檢查 肝組織切片用4%多聚甲醛固定，組織脫水，透明，用石蠟包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察分析，肝損傷程度療效評(píng)價(jià)〔5，6〕。

1.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠肝組織中Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達(dá) 取肝組織常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片，抗原修復(fù)液，過(guò)氧化酶阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，第一抗抗體、第二抗體、鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，蘇木素復(fù)染，觀(guān)察結(jié)果。判讀抗體的胞質(zhì)、胞膜染色的染色強(qiáng)度（0/1+/2+/3+）和染色陽(yáng)性率，評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理改變 HE 染色結(jié)果表明空白組肝臟組織被膜由厚薄均勻的富含彈性纖維致密結(jié)締組織構(gòu)成，肝小葉分界明顯，排列規(guī)則，肝小葉中央為中央靜脈，周?chē)谴笾鲁史派錉钆帕械母渭?xì)胞和肝血竇，肝細(xì)胞排列規(guī)則、整齊，肝竇無(wú)明顯擴(kuò)張或擠壓；相鄰肝小葉之間的門(mén)管區(qū)無(wú)明顯異常；未見(jiàn)明顯的炎性改變。模型組中央靜脈、匯管區(qū)周?chē)案螌?shí)質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)大量的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)體積較小、數(shù)量不等的圓形空泡；中等量的匯管區(qū)周?chē)梢?jiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；小葉結(jié)構(gòu)紊亂，多見(jiàn)纖維間隔形成；未見(jiàn)明顯的細(xì)胞壞死。水飛薊賓組、德都紅花-7 味散組中央靜脈、匯管區(qū)周?chē)案螌?shí)質(zhì)內(nèi)肝細(xì)胞顆粒變性明顯輕于模型組；小葉結(jié)構(gòu)紊亂，多見(jiàn)纖維間隔形成與模型組比較較輕。見(jiàn)表1，圖1。

圖1 各組肝組織(HE 染色,×100)

表1 德都紅花-7 味散對(duì)慢性肝損傷大鼠肝炎癥活動(dòng)度和纖維化分期的影響(n)

2.2 德都紅花-7 味散對(duì)大鼠肝組織Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組Bcl-2、Bcl-x蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓組、德都紅花-7 味散組Bcl-x、Bcl-2 蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2，圖2。

表2 德都紅花-7 味散對(duì)大鼠肝組織Bcl2、Bcl-x 蛋白表達(dá)的影響(,n=10)

表2 德都紅花-7 味散對(duì)大鼠肝組織Bcl2、Bcl-x 蛋白表達(dá)的影響(,n=10)

與空白組比較:1）P＜0.05；與模型組比較:2）P＜0.05

圖2 德都紅花-7 味散對(duì)各組肝組織Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達(dá)的影響(DAB,×800)

3 討論

HF 繼發(fā)于各種原因，如酒精、肝炎病毒、代謝性疾病、自身免疫相關(guān)性疾病等引起的肝臟損傷組織修復(fù)過(guò)程中的代償反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解失衡、并在肝細(xì)胞間隙可逆性沉積為特征〔6〕。HSC 在HF 病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。各種原因致使肝損傷后，造成肝星狀細(xì)胞激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成ECM 分泌增加，降解減少，以致大量的ECM 在肝內(nèi)沉積，形成HF〔7〕。Bcl-2 蛋白家族是調(diào)控線(xiàn)粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因子?？沟蛲龅亩嘟Y(jié)構(gòu)域蛋白，主要是Bcl-2、Bcl-x。HSC 凋亡過(guò)程中Bax 的表達(dá)減少而B(niǎo)cl-2 和Bcl-x 蛋白的表達(dá)增加〔8〕。本研究表明德都紅花-7 味散能夠明顯減輕CCl4所致大鼠的HF，降低肝組織Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達(dá)。蒙藥德都紅花-7 味散能夠明顯減輕肝纖維化，其機(jī)制與調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x 表達(dá)相關(guān)。