NOD 樣受體在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

王橋 宋波 馮博 季佳 李佐強

（齊齊哈爾醫(yī)學院 1 附屬第二醫(yī)院口腔科,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2 臨床病原教研室;3 齊齊哈爾五官醫(yī)院口腔科;4 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院教研科）

口腔頜面部惡性腫瘤約占人體惡性腫瘤的3%，其中90%以上為鱗狀細胞癌，其局部復(fù)發(fā)性高，預(yù)后差，晚期生存率低，導(dǎo)致患者即使存活下來也由于手術(shù)造成的面部缺損，而嚴重影響患者的心理和生活質(zhì)量〔1～3〕。口腔鱗狀細胞癌（OSCC）目前發(fā)病機制不甚明了，但研究顯示基因的突變及信號通路的失控在OSCC 的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要作用〔2，4，5〕。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）即NOD 樣受體，是一種位于細胞質(zhì)內(nèi)的模式識別受體，能夠非特異性的識別各種致病微生物，在微生物感染中具有重要作用，在腫瘤中的研究較少〔6，7〕。本文將檢測NOD 樣受體在OSCC 中的表達，從而探討NOD 樣受體在OSCC 發(fā)生發(fā)展過程中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2016 年10 月至2019 年10 月齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院做過手術(shù)切除的82 例石蠟標本，患者經(jīng)病理檢查證實為OSCC，術(shù)前均未接受放、化療?；颊吣挲g28～76 歲，中位年齡51.5歲。男46 例，女36 例。＜50 歲30 例，≥50 歲52例。低分化48 例，中分化19 例，高分化15 例。根據(jù)國際TNM 國際分期:Ⅰ期18 例、Ⅱ期19 例、Ⅲ期24 例、Ⅳ期21 例。另外選取82 例距離癌組織＞5 cm的癌旁舌正常黏膜組織作為對照。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人NOD1 及NOD2 多克隆抗體均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。BH-2 顯微鏡購于日本OLYMPUS 公司。

1.3 免疫組化法檢測NOD1 及NOD2 表達 石蠟標本60℃烤片30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，100%、95%、85%、75% 酒精脫水，3% H2O2室溫滅活30 min，檸檬酸鹽溶液煮沸2 min 進行抗原修復(fù)，滴加一抗（兔抗人NOD1 及NOD2 多克隆抗體）4℃過夜孵育、二抗室溫孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染并封片，最后在光鏡下觀察蛋白的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 NOD1 及NOD2 蛋白主要定位于細胞質(zhì)中，當出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，說明為陽性表達。兩名病理科醫(yī)生進行閱片。根據(jù)細胞染色強度判定:無染色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。根據(jù)陽性細胞比率判定:未著色為0 分，1%～25% 為1 分，26%～50% 為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。最后根據(jù)染色強度評分與陽性細胞比率評分的乘積作為最終的染色評分:陰性（-，0～2 分），弱陽性（+，3～4 分），中等陽性（荻，5～8 分），強陽性表達（莘，9～12分）?！? 分說明細胞陽性表達。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS17.0 軟件進行χ2檢驗，Pearson 相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 OSCC 組織及癌旁舌正常黏膜組織中NOD1 及NOD2 的表達 OSCC 組織中NOD1、NOD2 的陽性表達明顯低于癌旁舌正常黏膜組織（均P＜0.001），見表1。

表1 NOD1 及NOD2 在OSCC 組織及癌旁舌正常膜組織中的表達〔n(%),n=82〕

2.2 NOD1 及NOD2 表達與OSCC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Ⅲ～Ⅳ期NOD1 及NOD2 陽性表達率顯著低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.01，P＜0.001），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NOD1 及NOD2 陽性表達率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001），低分化中NOD1 及NOD2 陽性表達率顯著低于中高分化（均P＜0.001）。而OSCC 組織中NOD1 及NOD2 陽性表達率與年齡、性別無關(guān)。見表2。

表2 NOD1 及NOD2 陽性表達與OSCC 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3 OSCC 組織NOD1 及NOD2 表達的相關(guān)性 OSCC1 組織中，NOD1 與NOD2 表達正相關(guān)（r=0.556，P＜0.01）。

3 討論

NOD 樣受體有5 個亞家族，分別為NLR（A、B、C、P 和X），其中NLRC 及NLRP 是其主要類型，NOD1、NOD2 是NLRC 亞家族研究最多的2 個成員。NOD1、NOD2 均由3 個結(jié)構(gòu)域組成，分別為位于羧基末端LRR 結(jié)構(gòu)域，位于分子中間NBD 結(jié)構(gòu)域及位于氨基末端EBD 結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域通過識別配體、寡聚化及介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用，將信號傳遞給下游通路。另外NOD1 及NOD2 均含有半胱氨酸募集結(jié)構(gòu)域。NOD 樣受體自發(fā)現(xiàn)以來，均作為先天性免疫應(yīng)答的一部分參與細菌入侵細胞后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)NOD 樣受體與炎癥密切相關(guān)，炎癥是眾多腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動因素，因此學者開始關(guān)注NOD 樣受體在腫瘤中的作用〔6，7〕。

Wang 等〔8〕采用免疫組化檢測NOD1 信號通路在正?？谇?、癌前病變和口腔惡性腫瘤中的表達，結(jié)果表明隨著NOD1 隨著OSCC 的進展而降低。NOD1 的表達與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小密切相關(guān)。莊媛媛等〔9〕研究表明NOD1 蛋白表達于細胞質(zhì)，舌鱗狀細胞癌組織中NOD1 蛋白表達率為60.0%顯著低于正常舌黏膜對照組表達率80.0%，舌鱗狀細胞癌組織NOD1 mRNA 表達量為正常舌黏膜對照組（0.437±0.103）倍。本研究結(jié)果與研究報道一致〔8，9〕，NOD1 在OSCC 組織中低表達，同時臨床病理參數(shù)分析結(jié)果說明NOD1 參與OSCC 的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

莊園等〔10〕研究表明NOD2 蛋白表達于細胞質(zhì)，舌鱗癌組織NOD2 蛋白表達率為64.0%（16/25），顯著低于正常舌黏膜組織的表達率〔84.0%（21/25，P＜0.05）〕。舌鱗癌組織NOD2 mRNA 表達量為正常舌黏膜組織的（0.521±0.080）倍。而且過表達NOD2 可促進Tca8113 舌鱗癌細胞凋亡，抑制其增殖〔11〕。本研究與莊園等〔10〕研究結(jié)果一致，說明低表達的NOD2 促進OSCC 的發(fā)生。

Da Silva Correia 等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)NOD1 敲除或者過表達的人乳腺癌細胞（SK-BR）-3、人巨噬細胞趨化因子（MCF）-7 乳腺癌細中，NOD1 均能調(diào)控細胞的凋亡通路，而且移植瘤小鼠實驗發(fā)現(xiàn)NOD1 對于雌激素敏感的腫瘤具有抑制作用，但NOD1 對該細胞系無顯著影響。Chan 等〔13〕發(fā)現(xiàn)白細胞介素（IL）-8 能夠通過趨化因子受體（CXCR）1/2 介導(dǎo)的NOD1/信號通路中受體相互作用蛋白（RIP）2 信號通路進而促進頭頸部鱗癌的發(fā)展，NOD2 卻對此癌癥進展無任何影響。Yoon 等〔14〕卻證實NOD1 在YD-10B 口腔鱗癌細胞中高表達，NOD2 低表達，且NOD2 激動劑MDP 以劑量依賴的方式抑制YD-10B細胞的增殖。說明NOD1、NOD2 在不同的腫瘤組織、細胞中起的作用不大相同。而本研究說明低表達的NOD1、NOD2 促進OSCC 的發(fā)生發(fā)展。提示NOD1 及NOD2 可能可作為OSCC 診斷及惡性程度判斷的有效指標。