大孔樹脂純化小枝玫瑰總黃酮工藝研究

陳立格，王 瑩，蘭 衛(wèi)

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017；2.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830002)

藥理學(xué)研究表明，玫瑰具有廣泛的藥理活性，玫瑰花具有抗病毒[1]、抗氧化[2]、降糖[3]、抑菌[4]等作用。對(duì)玫瑰花的研究主要集中在玫瑰紅色素的提取[5]、花蕾的抗氧化能力[6]、化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]、黃酮類成分的提取及抗氧化性能[8]、降糖作用等方面。小枝玫瑰(branchlet rose)主要生長(zhǎng)在新疆和田地區(qū)和喀什地區(qū)，日照時(shí)間長(zhǎng)，干旱少雨，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，一年開花一次，產(chǎn)量低。小枝玫瑰與內(nèi)地玫瑰差異較大，主要產(chǎn)品有玫瑰花醬、玫瑰花茶和玫瑰精油，南疆少數(shù)民族使用較多，北疆及內(nèi)地使用較少。目前有關(guān)小枝玫瑰化學(xué)成分的提取、純化、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及生物活性的研究尚不充分。鑒于此，作者采用大孔樹脂純化小枝玫瑰總黃酮，采用紫外可見分光光度法測(cè)定小枝玫瑰總黃酮含量，考察大孔樹脂類型、最大上樣量、上樣速度、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫劑流速、洗脫劑用量對(duì)純化效果的影響，對(duì)純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，為小枝玫瑰的深入開發(fā)利用提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥材、試劑與儀器

小枝玫瑰花(批號(hào)20170110)，新疆維吾爾藥業(yè)有限公司。經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院姚藍(lán)副教授鑒定為薔薇科植物小枝玫瑰(branchlet rose)的干燥花蕾。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)20151221)，上海源葉生物科技有限公司；硝酸鋁(批號(hào)20160512，分析純)、亞硝酸鈉(批號(hào)20160122，分析純)、HPD-600大孔樹脂(批號(hào)20150423)、HPD-100大孔樹脂、X-5大孔樹脂(批號(hào)20150324)、AB-8大孔樹脂、D101大孔樹脂(批號(hào)20150423)，天津永晟精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉(批號(hào)20150212)、95%乙醇(批號(hào)20141203，分析純)，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；甲醇(批號(hào)20150122，色譜純)，F(xiàn)isher公司；實(shí)驗(yàn)用水均為純水。

UV2700型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；AS系列超聲波清洗機(jī)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；RC-FA系列電子分析天平，北京睿誠永創(chuàng)有限公司；玻璃儀器氣流烘干器、RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，河南鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；ST-02A型中藥粉碎機(jī)，浙江永康帥通五金工具有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇醫(yī)療儀器廠；A4001493型微量移液槍，上海(寶山區(qū))艾測(cè)電子科技有限公司。

1.2 小枝玫瑰總黃酮的含量測(cè)定

采用紫外可見分光光度法測(cè)定小枝玫瑰總黃酮含量。首先參照文獻(xiàn)[9]制備標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液；取標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法顯色[10]，在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液均在510 nm處有最大吸收，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇510 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。然后取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品定容，分別吸取0.1 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.001 18 mg·mL-1、0.011 8 mg·mL-1、0.023 6 mg·mL-1、0.035 4 mg·mL-1、0.047 2 mg·mL-1、0.059 0 mg·mL-1，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法顯色，測(cè)定各濃度溶液在510 nm處吸光度，測(cè)定3次，取平均值，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再取供試溶液，按上述方法測(cè)定510 nm處吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算小枝玫瑰總黃酮含量。

1.3 小枝玫瑰總黃酮的純化工藝優(yōu)化

1.3.1 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取1.00 g小枝玫瑰花粉末于錐形瓶中，按料液比1∶16(g∶mL，下同)加入50%乙醇，在80 ℃下提取30 min，過濾，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，冷凍干燥制成粉末。然后用50%乙醇配制小枝玫瑰總黃酮含量為0.8 mg·mL-1的樣品溶液。

1.3.2 純化工藝的優(yōu)化

以純化效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)大孔樹脂純化工藝條件大孔樹脂類型、最大上樣量、上樣速度、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫劑流速、洗脫劑用量[11-12]等進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與線性范圍

按1.2方法測(cè)定0.001 18 mg·mL-1、0.011 8 mg·mL-1、0.023 6 mg·mL-1、0.035 4 mg·mL-1、0.047 2 mg·mL-1、0.059 0 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510 nm處的吸光度分別為0.004、0.089、0.201、0.318、0.430、0.528。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程為A=9.2389c-0.0127，R=0.9991，表明，蘆丁濃度在0.001 18～0.059 0 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 大孔樹脂的選擇

通過靜態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)考察5種大孔樹脂HPD-600、HPD-100、X-5、AB-8、D101對(duì)小枝玫瑰總黃酮的純化效果。大孔樹脂使用前均用95%乙醇浸泡24 h。

靜態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的5種大孔樹脂各2.0 g，用濾紙吸干后置于具塞磨口三角瓶中，加入小枝玫瑰總黃酮含量為1.998 mg·mL-1的樣品溶液40 mL，室溫下吸附24 h，取上層液1 mL，定容至10 mL容量瓶中，測(cè)定總黃酮含量，按式(1)計(jì)算比吸附量(mg·g-1)。然后將上述吸附飽和的大孔樹脂用純水清洗后，加入80%乙醇20 mL，在25 ℃水浴振蕩24 h進(jìn)行靜態(tài)解吸，按式(2)、(3)計(jì)算比解吸量(mg·g-1)及解吸率(%)：

(1)

(2)

(3)

式中：c0為吸附前樣品溶液中總黃酮含量，mg·mL-1；c1為吸附后上層液中總黃酮含量，mg·mL-1；V0為樣品溶液體積，mL；m為大孔樹脂質(zhì)量，g；c2為洗脫液中總黃酮含量，mg·mL-1；V2為洗脫液體積，mL。

動(dòng)態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)：取預(yù)處理好的5種大孔樹脂，濕法裝柱10 cm；再以95%乙醇清洗，直到流出液澄清為止；然后用純水洗至無醇味；加入小枝玫瑰總黃酮含量為0.1 mg·mL-1的樣品溶液15 mL，用15 mL 95%乙醇洗脫，記錄洗脫液的體積并測(cè)定洗脫液中總黃酮含量，按式(4)計(jì)算洗脫率(%)：

(4)

5種大孔樹脂HPD-600、HPD-100、X-5、AB-8、D101對(duì)小枝玫瑰總黃酮的靜態(tài)吸附-脫附和動(dòng)態(tài)吸附-脫附效果見表1。

表1 5種大孔樹脂對(duì)小枝玫瑰總黃酮的靜態(tài)吸附-脫附和動(dòng)態(tài)吸附-脫附效果

由表1可知，HPD-600大孔樹脂對(duì)小枝玫瑰總黃酮的靜態(tài)吸附效果及解吸效果都比較好；且動(dòng)態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)所用的洗脫液體積較少、洗脫率高出其它大孔樹脂很多，是小枝玫瑰總黃酮分離純化用較理想的大孔樹脂。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HPD-600大孔樹脂純化小枝玫瑰總黃酮。

2.3 最大上樣量的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，加入樣品溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。以總黃酮泄漏量為指標(biāo)，考察上樣量對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響(圖1)：將樣品溶液過柱，分段(每10 mL收集一管)收集流出液，測(cè)定其在510 nm處吸光度，計(jì)算流出液中總黃酮含量，按式(5)計(jì)算總黃酮泄漏量(%)：

圖1 上樣量對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響Fig.1 Effect of sampling amount on purification efficiency of total flavonoids from branchlet rose

(5)

由圖1可知，當(dāng)上樣量超過270 mL時(shí)，流出液中的總黃酮明顯增多，泄漏量明顯增加，說明此時(shí)總黃酮開始明顯泄漏。故，選擇小枝玫瑰總黃酮樣品溶液的最大上樣量為270 mL。

2.4 上樣速度的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，分別以不同速度上樣進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。以總黃酮吸附量為指標(biāo)，考察上樣速度對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結(jié)果見表2。按式(6)計(jì)算總黃酮吸附量：

表2 上樣速度對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響

吸附量=c0×V0-c2×V2

(6)

由表2可知，上樣速度為1.5 mL·min-1時(shí)，小枝玫瑰總黃酮吸附量最大，為148.51 mg。故，選擇上樣速度為1.5 mL·min-1。

2.5 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，分別用不同體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%)的乙醇作為洗脫劑進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)。分段收集洗脫液，稀釋后測(cè)定其吸光度，考察洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響Fig.2 Effect of eluent volume fraction on purification efficiency of total flavonoids from branchlet rose

由圖2可知，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響較大，40%乙醇的洗脫效果最佳。故，選擇40%乙醇為洗脫劑。

2.6 洗脫劑流速的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，分別以不同流速洗脫進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)。分段收集洗脫液，稀釋后測(cè)定其吸光度，以洗脫液中總黃酮質(zhì)量為指標(biāo)，考察洗脫劑流速對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結(jié)果見表3。

表3 洗脫劑流速對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響

由表3可知，當(dāng)洗脫劑流速為 0.5 mL·min-1時(shí)，洗脫液中總黃酮質(zhì)量最高，洗脫效果最佳，純化效果最佳。故，選擇洗脫劑流速為 0.5 mL·min-1。

2.7 洗脫劑用量的選擇

HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，洗脫劑流速 0.5 mL·min-1，在洗脫劑用量分別為10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-脫附實(shí)驗(yàn)。分段收集洗脫液，測(cè)定其在510 nm處吸光度，以洗脫液中總黃酮質(zhì)量為指標(biāo)，考察洗脫劑用量對(duì)小枝玫瑰總黃酮純化效果的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，隨著洗脫劑用量的增加，洗脫液中總黃酮質(zhì)量迅速降低；當(dāng)洗脫劑用量為60 mL時(shí)，洗脫液中總黃酮質(zhì)量降至最低。故，選擇洗脫劑用量為60 mL。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取小枝玫瑰花粉末2.0 g，按料液比1∶20加入60%乙醇提取60 min；過濾，用蒸餾水稀釋成總黃酮含量為0.8 mg·mL-1的樣品溶液；在上述確定的最優(yōu)條件下進(jìn)行小枝玫瑰總黃酮的純化：HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，洗脫劑流速0.5 mL·min-1，洗脫劑用量60 mL。收集洗脫液，水浴烘干，得小枝玫瑰總黃酮純化粉末1.64 g；稱取0.02 g粉末，加入100 mL甲醇攪拌溶解，精密吸取5 mL，定容至25 mL容量瓶中，測(cè)定吸光度，計(jì)算純化粉末中總黃酮質(zhì)量，按式(7)計(jì)算總黃酮轉(zhuǎn)移率(%)，結(jié)果見表5。

(7)

由表5可知，在最優(yōu)條件下對(duì)小枝玫瑰總黃酮進(jìn)行純化，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的總黃酮轉(zhuǎn)移率平均值為58.75%。表明，確定的最優(yōu)純化條件可行，純化效果較好。

表5 最優(yōu)純化工藝條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.9 討論

靜態(tài)吸附時(shí)，HPD-600大孔樹脂對(duì)小枝玫瑰總黃酮的吸附優(yōu)于其它型號(hào)大孔樹脂，解吸也比其它型號(hào)大孔樹脂容易；動(dòng)態(tài)吸附時(shí)，HPD-600大孔樹脂對(duì)小枝玫瑰總黃酮的吸附和脫附效果均比其它型號(hào)大孔樹脂的要好。本實(shí)驗(yàn)采用HPD-600大孔樹脂對(duì)小枝玫瑰乙醇提取物進(jìn)行純化，在進(jìn)行多次吸附-脫附純化后，小枝玫瑰總黃酮的純度會(huì)降低。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)對(duì)小枝玫瑰總黃酮粗提物進(jìn)行預(yù)處理，從而延長(zhǎng)HPD-600大孔樹脂的使用時(shí)間。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)大孔樹脂純化小枝玫瑰總黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝條件如下：HPD-600大孔樹脂濕法裝柱10 cm，樣液濃度0.8 mg·mL-1，最大上樣量270 mL，上樣速度1.5 mL·min-1，40%乙醇為洗脫劑，洗脫劑流速0.5 mL·min-1，洗脫劑用量60 mL。在此條件下純化得到的小枝玫瑰總黃酮中的總黃酮含量為23.24%，總黃酮轉(zhuǎn)移率為58.75%。