馬面魚皮膠原抗氧化肽的分離制備及穩(wěn)定性研究

蔡金秀 夏姍姍 馬佳雯 王佳圓 楊 華 曹少謙,* 戚向陽,*

(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306； 2 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

人體內(nèi)具有穩(wěn)定和清除自由基的自我保護機制，當(dāng)體內(nèi)自由基過量時會產(chǎn)生活性氧，多余的活性氧會攻擊生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等主要大分子物質(zhì)，導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)生。此外，食品中的脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生氧化會導(dǎo)致食品品質(zhì)劣變，因此使用抗氧化劑至關(guān)重要[1]?？寡趸氖且活惸軌蚓S持機體內(nèi)自由基平衡和抑制脂質(zhì)氧化的生物活性肽，具有安全、高效、易消化吸收的特點，且來源廣泛，具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。目前，已開展大量從食物來源的植物蛋白和動物蛋白中分離鑒定出具有抗氧化活性肽段的研究。魚類來源的抗氧化肽由于其安全性高、結(jié)構(gòu)新穎、更益于人體健康，受到廣泛的關(guān)注[4]。

馬面魚(Navodonseptentrionalis)系革鲀科馬面鲀屬，是我國第二大海洋經(jīng)濟魚類，產(chǎn)量可觀[5-6]。由于其皮粗糙堅韌、口感差，因此加工過程中會丟棄魚皮，造成資源浪費的同時也易造成環(huán)境污染[7-8]。目前，馬面魚皮主要用于制革、生產(chǎn)可溶性蛋白粉和分離純化精氨酸、脯氨酸等[9]。研究發(fā)現(xiàn)馬面魚皮中膠原蛋白因具含量較高，占干重的80%左右[10]。因此合理利用馬面魚皮生產(chǎn)高值化產(chǎn)品既能減少資源浪費，又能減少環(huán)境污染。膠原蛋白因具有獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)不易被人體消化吸收，若將膠原蛋白酶解成為膠原蛋白多肽，則能很好地被人體吸收，且該多肽具有較強的抗氧化活性[11-12]。目前已有學(xué)者成功從各類魚皮中制備得到膠原蛋白抗氧化肽，如鱘魚皮[13]、黃鰭金槍魚皮[14]、雙斑東方鲀魚皮[15]。楊露等[16]從馬面魚骨中制備得到膠原抗氧化肽，而關(guān)于馬面魚皮膠原蛋白抗氧化肽的制備、分離及鑒定的研究尚鮮見報道。

本研究以馬面魚皮膠原蛋白為原料，制備高活性抗氧化肽，并對其結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性進行探討，旨為馬面魚皮的高值化利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬面魚皮收集于寧波水產(chǎn)批發(fā)市場，清洗后瀝干，用組織搗碎機將其制成小碎塊，于-20℃保存?zhèn)溆?；膠原蛋白，基于實驗室前期研究結(jié)果，由馬面魚皮提取所得(用10%異丙醇脫脂， 7.5% NaCl 溶液除雜蛋白后，用 0.38 mol·L-1乙酸溶液在料液比為1∶30條件下，提取33 h)；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶，北京Solarbio公司；Protease P ‘Amano’ 6G、Protease N ‘Amano’、Protease A ‘Amano’ 2G、Protease M ‘Amano’ G，日本Amano公司；對 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，美國Sigma公司；Sephadex G-15葡聚糖凝膠，美國GE公司；甲酸、乙腈均為色譜純，美國Sigma公司；谷胱甘肽，北京Solarbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D 數(shù)顯控溫水浴鍋，上海維誠儀器有限公司；ALPHA2-4冷凍干燥儀，德國CHRIST公司；5804R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；1900PC型紫外-可見分光光度計，上海析譜儀器有限公司；Labscale小型切向流超濾系統(tǒng)，密理博中國有限公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS)，沃特世(Waters)美國科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠原抗氧化肽制備工藝優(yōu)化

1.3.1.1 蛋白酶篩選 在各酶的最適溫度和pH值條件下，用木瓜蛋白酶(55℃，pH值7.0)、胰蛋白酶(40℃，pH值8.0)、堿性蛋白酶(40℃，pH值10.0)、菠蘿蛋白酶(55℃，pH值7.0)、中性蛋白酶(40℃，pH值7.0)、酸性蛋白酶(50℃，pH值2.2)、胃蛋白酶(50℃，pH值2.2)、Protease P‘Amano’6G(50℃，pH值7.0)、Protease N‘Amano’(40℃，pH值8.0)、Protease A‘Amano’ 2G(50℃，pH值8.0)和Protease M‘Amano’G(50℃，pH值4.5)，在底物濃度為1%、加酶量為2 000 U·g-1的條件下，酶解4 h，以DPPH自由基清除率為主要指標(biāo)，水解度(hydrolysis degree，DH)為參考指標(biāo)篩選最佳用酶。

1.3.1.2 單因素試驗 用篩選出的最佳用酶進行酶解，分別考察酶解時間(1、2、3、4、5 h)、加酶量(1 200、2 400、 3 600、4 800 U·g-1)及底物濃度(1%、2%、3%、4%)對馬面魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率及DH的影響。

1.3.1.3 復(fù)合酶解 根據(jù)單因素結(jié)果選取最佳條件進行組合酶解試驗，酶解條件如表1所示。

表1 復(fù)合酶解條件Table 1 Conditions of composite enzyme hydrolysis

1.3.2 DH的測定 參考趙新淮等[17]的方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法如下：將甘氨酸干燥，配制成20 mg·mL-1的溶液，再稀釋成含量為2～20 μg·mL-1的溶液。各取2 mL稀釋液(空白管加蒸餾水)，加入1 mL茚三酮顯色劑，混勻，15 min沸水浴后，冷水中冷卻。每管分別加入5 mL 40%乙醇混勻，放置15 min，以空白管調(diào)零并于570 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定步驟測定酶解液中-NH2的含量(mmol·L-1)，用蒸餾水代替酶解液做空白試驗，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶解蛋白液中-NH2的含量(mmol·L-1)。按照公式計算DH：

(1)

式中，h為水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol·g-1；htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol·g-1。

1.3.3 DPPH自由基清除率測定 參照文獻[18]的方法。取2 mL樣品與2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH溶液振蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，用95%乙醇調(diào)零，在波長517 nm處測定吸光度值A(chǔ)i。同時測定2 mL樣品與2 mL 95%乙醇溶液混合避光30 min后的吸光度值A(chǔ)j，以及2 mL樣品與2 mL去離子水混合液避光30 min后的吸光度值A(chǔ)0。按照公式計算DPPH自由基清除率：

(2)。

1.3.4 超濾分離 將在最佳酶解條件下得到的水解液過0.45 μm濾膜后，在室溫下通過截留分子量為10、8 和5 kDa 的超濾膜，收集截留液和濾過液，所得組分分別標(biāo)記為A(<5 kDa)、B(5～8 kDa)、C(8～10 kDa)、D(>10 kDa)，將各組分冷凍干燥后測定DPPH自由基清除率。

1.3.5 凝膠柱層析分離 利用Sephadex G-15(2 cm×50 cm I.D.)凝膠柱對超濾所得抗氧化活性最強的A組分進行進一步分離純化。以蒸餾水為洗脫液，設(shè)置流速0.3 mL·min-1，平衡柱子后上樣5 mL，上樣濃度為20 mg·mL-1，在220 nm波長處檢測吸光度值，分別收集各組分，測定各組分DPPH自由基清除率。

1.3.6 抗氧化肽結(jié)構(gòu)分析 使用的色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18 colum(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。洗脫條件為： 流動相A：0.1%(v/v)甲酸水溶液；流動相B：乙腈。40 min內(nèi)流動相B由0變?yōu)?0%，40～42 min 流動相B由40%變回0%；流速為0.3 mL·min-1；進樣5 μL。質(zhì)譜條件為：電噴霧電離源，正離子模式，掃描分子量100～2 000 Da。質(zhì)譜參數(shù)為：毛細管電壓3 000 V， 錐孔電壓40 V，噴霧35 psi，脫氣溫度350℃，離子源溫度120℃，N2流速900 L·h-1。

1.3.7 溫度對馬面魚皮膠原肽抗氧化活性的影響 取一定量的樣品用去離子水配制成2 mg·mL-1的溶液，分別在20、40、60、80和100℃條件下保溫2 h，用冷水浸泡使其快速恢復(fù)至室溫，測定其DPPH自由基清除率并計算抗氧化活性保持率。

1.3.8 pH值對馬面魚皮膠原肽抗氧化活性的影響 取一定量的樣品分別用pH值為2、4、6、8、10的緩沖液配制成2 mg·mL-1的溶液，在40℃條件下保溫2 h，用冷水浸泡使其快速恢復(fù)至室溫，最后將溶液pH值調(diào)至8.0，測定其DPPH自由基清除率，并計算抗氧化活性保持率。

1.3.9 體外模擬胃腸消化對馬面魚皮膠原抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 參考Zhu等[19]的方法，體外模擬胃液消化試驗，將樣品用pH值為2.0的0.1 mol·L-1KCl-HCl緩沖液配制成5 mg·mL-1的溶液，按酶與底物質(zhì)量比為 1∶100加入胃蛋白酶，振蕩混勻后在37℃條件下恒溫水浴3 h，沸水浴滅酶5 min，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，取1/2消化液離心(10 000 r·min-1，25 min)，取上清測定其DPPH自由基清除率。

體外模擬腸液消化試驗，將剩余1/2消化液按酶與底物質(zhì)量比為1∶100加入胰蛋白酶，振蕩混勻后在37℃條件下恒溫水浴4 h，經(jīng)滅酶、離心(10 000 r·min-1， 25 min)后，取上清測定DPPH自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPad Prism軟件繪圖，SPSS Statistics軟件進行Duncan(D)方差分析，顯著性水平為P<0.05，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶酶解馬面魚皮膠原蛋白

由圖1可知，馬面魚皮膠原蛋白經(jīng)不同酶水解后，由酸性蛋白酶酶解制備的酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率最高，但水解度較低；Protease A ‘Amano’ 2G酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率僅次于酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物，而水解度較高。有研究表明水解度與抗氧化活性無明顯相關(guān)性[20]。不同酶的酶切位點不同，得到的酶解產(chǎn)物具有不同程度的抗氧化活性，與單酶相比，復(fù)合酶具有更多的酶切位點，有可能提高酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[21]。因此，本研究選擇酸性蛋白酶和Protease A ‘Amano’ 2G進行復(fù)合酶解試驗。

注：小寫字母表示水解度差異顯著(P<0.05)；大寫字母表示DPPH自由基清除率差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level in hydrolysis degree. Capital letters indicate significant difference at 0.05 level in DPPH radical scavenging rate. The same as following.圖1 不同酶對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different enzyme hydrolysis on hydrolysis degree and DPPH radical scavenging rate

2.2 酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 底物濃度、加酶量、酶解時間對ProteaseA ‘Amano’2G酶解的影響 由圖2可知，用Protease A‘Amano’2G酶解馬面魚皮膠原蛋白時，水解產(chǎn)物的水解度隨底物濃度增大、加酶量增大及酶解時間的延長而升高，當(dāng)加酶量大于3 600 U·g-1后無明顯變化。DPPH自由基清除率隨底物濃度和加酶量的增加而增加，分別在底物濃度為3%和加酶量為3 600 U·g-1時達最大值后趨于平緩。在酶解初期1～3 h內(nèi)，隨酶解時間延長，DPPH自由基清除率增加，當(dāng)酶解3 h后，其清除率有所下降，與王熙等[22]的研究相一致。這可能是由于隨著酶解時間的延長，部分肽被酶解為氨基酸，失去抗氧化活性。綜上，在底物濃度為3%、加酶量為3 600 U·g-1、 酶解3 h條件下可獲得抗氧化活性較高的酶解產(chǎn)物。

圖2 底物濃度、加酶量、酶解時間對Protease A ‘Amano’2G酶解的影響Fig.2 Effect of substrate concentration, amount, and time on Protease A ‘Amano’ 2G enzymatic hydrolysis

2.2.2 底物濃度、加酶量、酶解時間對酸性蛋白酶酶解的影響 由圖3可知，用酸性蛋白酶酶解所得酶解產(chǎn)物水解度隨底物濃度和加酶量的增加而上升，在酶解1～4 h隨時間的延長而上升，在酶解5 h呈下降趨勢。其DPPH自由基清除率隨底物濃度和加酶量的增加而上升最后趨于平緩。在酶解2 h時最大，而后呈下降趨勢且無顯著性差異(P>0.05)。由此可見，在底物濃度為3%、加酶量為3 600 U·g-1、酶解處理2 h條件下可獲得抗氧化活性較高的酶解產(chǎn)物。

圖3 底物濃度、加酶量、酶解時間對酸性蛋白酶酶解的影響Fig.3 Effect of substrate concentration, amount, and time on acidic protease enzymatic hydrolysis

2.2.3 復(fù)合酶解工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在Protease A‘Amano’2G和酸性蛋白酶最佳條件下，進行組合酶解試驗，探討雙酶分步酶解、雙酶混合酶解與單酶酶解的差異。由圖4可知，先用Protease A‘Amano’2G酶解3 h，后用酸性蛋白酶酶解2 h酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，達89.01%，顯著高于單酶酶解和雙酶混合酶解的酶解產(chǎn)物。

注：1：Protease A ‘Amano’ 2G酶解；2：酸性蛋白酶酶解；3：Protease A ‘Amano’ 2G+酸性蛋白酶酶解；4：酸性蛋白酶+Protease A‘Amano’ 2G酶解；5：先Protease A ‘Amano’2G后酸性蛋白酶酶解；6：先酸性蛋白酶后Protease A ‘Amano’ 2G酶解。Note:1: Protease A ‘Amano’2G enzymolysis.2:Acid protease enzymolysis. 3:Protease A ‘Amano’2G+ acid protease enzymolysis. 4: Acid protease +protease A ‘Amano’2G enzymolysis. 5: Protease A ‘Amano’2G followed by acid Protease hydrolysis. 6: Acidic protease followed by Protease A ‘Amano’2G.圖4 復(fù)合酶解對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of using mixed enzymes hydrolysis on the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

2.3 馬面魚皮膠原蛋白抗氧化肽的分離純化

2.3.1 超濾分離 由表2可知，用最佳酶解條件制備的馬面魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離后得到A、B、C、D 4個組分，其中分子量<5 kDa的組分其保留率顯著高于其他組分，其IC50值顯著低于其他組分，表明馬面魚皮膠原蛋白水解產(chǎn)物主要由小分子肽段(<5 kDa)組成，且小分子量肽段具有較強的抗氧化活性，這與胡曉等[23]的研究結(jié)果一致。

表2 超濾分離組分及其抗氧化活性Table 2 Ultrafiltration separation components and their antioxidant activity

2.3.2 凝膠柱層析分離 進一步將抗氧化活性較強的A組分進行凝膠過濾分離，在Sephadex G-15柱上的洗脫曲線如圖5-A所示。經(jīng)凝膠過濾分離后，將其分成A1和A22個組分。

注：小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖5 凝膠過濾分離色譜及各組分抗氧化活性Fig.5 Chromatogram of gel filtration column and the antioxidant activity of each component

由圖5-B可知，凝膠柱分離所得的各組分抗氧化活性差異較大，A1和A2的DPPH自由基清除率均顯著高于A組分，以A1的DPPH自由基清除率最高，顯著高于A2。A1、A2組分的保留率分別為18.8%和51.2%，其DPPH自由基清除率的IC50值分別為1.80和4.51 mg·mL-1，均低于分離前A組分(6.51 mg·mL-1)。

2.4 馬面魚皮抗氧化肽抗氧化活性的穩(wěn)定性研究

抗氧化肽的活性在生產(chǎn)和加工時會受環(huán)境因素及其他組分等的影響，食用時胃腸道中的蛋白酶在一定程度上會進一步降解抗氧化肽從而影響其活性，且肽的組成和結(jié)構(gòu)不同，受環(huán)境等因素的影響程度也不同。因此，本試驗探討了溫度、pH值、體外模擬胃腸消化對抗氧化肽A1、A2抗氧化活性的影響。

2.4.1 pH值對馬面魚皮膠原抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 由圖6可知，A1、A2組分在不同pH條件下抗氧化活性的穩(wěn)定性趨勢基本一致。當(dāng)pH值介于 2～6時，抗氧化活性的穩(wěn)定性隨pH增高而增大，且具有較高的穩(wěn)定性；而當(dāng)pH值大于6時，其抗氧化活性的穩(wěn)定性急劇下降，pH值為8時下降至初始的60%左右，pH值升高至10時，其抗氧化活性僅為初始的30%左右。這可能是由于膠原蛋白抗氧化肽在堿性條件發(fā)生消旋和脫酰胺作用，從而導(dǎo)致活性降低[24-26]。

圖6 pH對抗氧化肽A1、A2活性穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on the antioxidant activities stability of A1 and A2

2.4.2 溫度對馬面魚皮膠原抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 由圖7可知，溫度對膠原蛋白抗氧化肽A1活性的影響較小，在20～100℃時抗氧化活性保持94%以上。而膠原蛋白抗氧化肽A2的抗氧化活性在20～80℃時隨溫度的升高有所下降，但抗氧化活性仍能保留88%以上。

圖7 溫度對抗氧化肽A1、A2抗氧化活性穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the antioxidant activity stability of A1 and A2

2.4.3 體外模擬胃腸消化對馬面魚皮膠原抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 由圖8可知，膠原蛋白抗氧化肽A1、A2經(jīng)胃液模擬消化后其抗氧化活性分別降低為初始的89.99%和87.46%，而經(jīng)腸液模擬消化后其抗氧化活性又分別降低為80.53%和76.45%，最終的抗氧化活性均保持在初始值的80%左右，且A1較A2穩(wěn)定。由此可知，經(jīng)過胃腸模擬消化后，膠原蛋白的抗氧化活性有所下降，但大部分活性未喪失。胡曉等[27]考察了模擬胃腸道消化對鳶烏賊抗氧化肽穩(wěn)定性的影響，消化后活性降低為初始的70%左右，與之相比本研究所制備的抗氧化肽的抗氧化穩(wěn)定性較高。

圖8 體外模擬胃腸消化抗氧化肽A1、A2抗氧化活性穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of gastrointestinal digestion on the antioxidant activity stability of A1 and A2

對抗氧化活性較強的A1、A2組分的穩(wěn)定性進行探究，結(jié)果表明，馬面魚皮膠原抗氧化肽在酸性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下活性急劇下降。溫度對其活性影響不大，在20～100℃條件下均能保持88%以上。本研究發(fā)現(xiàn)，馬面魚皮膠原抗氧化肽經(jīng)體外模擬胃腸消化后，其抗氧化活性有所降低，但仍能保持在初始活性的80%。綜合pH值、溫度及胃腸模擬消化對A1、A2抗氧化活性穩(wěn)定性的影響可知，A1較A2穩(wěn)定。

2.5 馬面魚皮膠原抗氧化肽結(jié)構(gòu)分析

綜合抗氧化活性及穩(wěn)定性結(jié)果，A1組分具有較高抗氧化活性，且較穩(wěn)定，對其進行UPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，A1中主要組成成分的二級質(zhì)譜圖如圖9所示，分子離子峰為[M]+531 m/z，5個碎片離子峰分別為474 m/z([M-57]+)、345 m/z([M-57-129]+)、288 m/z([M-57-129-57]+)、217 m/z([M-57-129-57-71]+)、114 m/z([M-57-129-57-71-103]+)，碎片離子峰114 m/z可能為Asn，推測其他碎片離子峰為分別失去一個Gly、Glu、Gly、Ala、Cys基團形成的，由此可推測此物質(zhì)可能為六肽，其氨基酸序列可能為Gly-Glu-Gly-Ala-Cys-Asn或Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly。

圖9 馬面魚皮膠原蛋白抗氧化肽主成分質(zhì)譜圖Fig.9 MS spectra of major ingredient of APCNS

3 討論

膠原蛋白水解物具有疏水性氨基酸含量高、分子量低等特點，具有較強的抗氧化活性[28]。馬面魚皮富含膠原蛋白，此前鮮見關(guān)于馬面魚膠原蛋白抗氧化肽的報道，本研究在制備膠原蛋白的基礎(chǔ)上，制備馬面魚皮膠原蛋白抗氧化肽，并對其分離純化后進行結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性分析。研究結(jié)果表明，與單酶及雙酶直接混合酶解相比，采用雙酶分步酶解法可得到活性較強的抗氧化肽，這與林琳等[29]的結(jié)果一致。酶解粗產(chǎn)物經(jīng)超濾分離后，發(fā)現(xiàn)分子量小于5 kDa的A組分抗氧化活性最強，大分子組分抗氧化活性較弱，這與前人研究結(jié)果一致[1,28-29]。A組分經(jīng)凝膠過濾分離后得到的2個組分(A1，A2)抗氧化活性均高于A組分，其中A1活性較高，其清除DPPH自由基的 IC50值為1.80 mg·mL-1，比酶解粗產(chǎn)物提高了7倍以上，說明經(jīng)過超濾和凝膠柱層析分離后，對馬面魚皮膠原蛋白抗氧化肽進行了有效的分離富集。對抗氧化活性較強的A1、A2組分的穩(wěn)定性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬面魚皮膠原抗氧化肽在酸性條件下較穩(wěn)定，這與Zhu等[19]和梁杰等[30]的研究結(jié)果一致；在20～100℃條件下均能保持88%以上的活性，梁杰等[30]研究結(jié)果顯示鮑魚水解肽在溫度高于80℃后，其抗氧化活性急劇下降，與之相比馬面魚皮膠原抗氧化肽有較好的耐高溫能力；經(jīng)體外模擬胃腸消化后其抗氧化活性有所下降，但仍能保持初始活性的80%，這比胡曉等[27]研究的鳶烏賊抗氧化肽穩(wěn)定性好。通過UPLC-MS對抗氧化活性最高的A1組分進行結(jié)構(gòu)分析，推測A1的氨基酸序列可能為Gly-Glu-Gly-Ala-Cys-Asn或Asn-Glu-Gly-Ala-Cys- Gly。在A1含有的氨基酸中，酸性氨基酸谷氨酸(Glu)自身具有抗氧化活性，而甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)為疏水氨基酸，一般認為含有疏水氨基酸越多其抗氧化活性越強，因為疏水氨基酸能與氧結(jié)合或阻止脂質(zhì)中氫的釋放從而促進抗氧化肽與自由基的反應(yīng)[31]。且甘氨酸(Gly)為兩性氨基酸，具有氫質(zhì)子供體結(jié)構(gòu)，增強了抗氧化肽對自由基的捕捉作用。在多種抗氧化肽中發(fā)現(xiàn)含有甘氨酸，是強抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的重要組成氨基酸[23,31-32]。推測以上氨基酸的存在對其抗氧化活性的增強起到了一定的作用。馬面魚皮膠原蛋白抗氧化肽高活性成分A1熱穩(wěn)定性高比鮑魚抗氧化肽更適用于熱加工產(chǎn)品；經(jīng)胃腸模擬消化后扔能發(fā)揮較強抗氧化效用；且其對DPPH自由基清除率與同濃度的谷胱甘肽比無顯著性差異。綜上所述，馬面魚皮膠原蛋白肽具有替代現(xiàn)有抗氧化劑的潛力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，雙酶分步酶解法能夠有效提高馬面魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的水解度及抗氧化活性。經(jīng)超濾和凝膠柱層析分離后，抗氧化肽活性顯著增強。穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，其在酸性條件下較穩(wěn)定，在堿性條件下抗氧化活性急劇下降；而溫度對其穩(wěn)定性影響不大；經(jīng)體外模擬胃腸消化后仍保留有較強的抗氧化活性。由此可見，馬面魚皮膠原抗氧化肽具有良好的穩(wěn)定性。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定A1為六肽，其氨基酸序列可能為Gly-Glu-Gly-Ala-Cys-Asn或Asn-Glu-Gly-Ala-Cys- Gly。