不同發(fā)育期及授粉方式對設(shè)施甜瓜中穩(wěn)定同位素比值變化的影響研究

趙 珊 王釋婕 聶 晶 邵圣枝 吳 嬌 趙冬香 高景林 袁玉偉,*

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所， 海南 海口 571101； 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310021； 3 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570000)

甜瓜(CucumismeloL.)是世界十大水果之一。國內(nèi)外市場對甜瓜的品種、數(shù)量和質(zhì)量等方面的要求越來越高，自80年代以來，甜瓜設(shè)施栽培迅速發(fā)展，并逐步走向產(chǎn)業(yè)化。設(shè)施環(huán)境的封閉性會(huì)導(dǎo)致外界昆蟲無法進(jìn)入，因此常使用氯吡脲(forchlorfenuron，CPPU)等人工合成生長調(diào)節(jié)劑或其他化學(xué)輔助授粉技術(shù)促進(jìn)坐果，然而此類方法容易產(chǎn)生安全隱患并影響果實(shí)品質(zhì)。近年來，蜜蜂授粉已在設(shè)施甜瓜中廣泛應(yīng)用，蜜蜂授粉的甜瓜果肉中蔗糖含量和香味物質(zhì)顯著增加，食用品質(zhì)明顯優(yōu)于使用氯吡脲處理的甜瓜[1-2]。

植物的穩(wěn)定同位素比率(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)具有“自然指紋”的屬性，可隨生長環(huán)境發(fā)生變化，能夠反映植物生長過程中的環(huán)境因素差異[3-5]。植物的δ13C值可以反映植物生長、光合作用和氣孔特性[6]，δ15N值主要受土壤環(huán)境和人工施肥的影響[7-8]，δ18O值和δ2H值主要受環(huán)境中水循環(huán)、緯度、氣溫和海拔等影響[9]。目前穩(wěn)定同位素分析已廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源、真實(shí)性判別和有機(jī)食品鑒別[10-11]，如茶葉[7，12]、大米[13]、小麥[14]、蘋果[15-16]、楊梅[17]、葡萄酒[18]等產(chǎn)地溯源，果汁[19]、蜂蜜[20-21]等摻假鑒定，雞蛋[22]、有機(jī)蔬菜[23]等有機(jī)食品鑒別以及設(shè)施栽培[24]和施肥方式[25]判別等。已有研究表明，植物中同位素的變化受氣候生態(tài)、植物生理代謝和栽培方式等的影響，然而有關(guān)設(shè)施條件下激素坐果和蜜蜂授粉對甜瓜中同位素組成影響與發(fā)育期變化等的相關(guān)研究卻鮮見報(bào)道。

本研究通過測定不同發(fā)育期設(shè)施甜瓜中4種穩(wěn)定同位素比值(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)，比較激素授粉和蜜蜂授粉甜瓜中穩(wěn)定同位素的特征差異，旨在探究設(shè)施甜瓜穩(wěn)定同位素的變化規(guī)律，豐富穩(wěn)定同位素的溯源與鑒別理論，為農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源與鑒別以及同位素?cái)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建與完善提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)于2018年12月至2019年2月在海南省樂東黎族自治縣甜瓜(金香玉)設(shè)施棚內(nèi)進(jìn)行。土壤類型為濱海沙地，設(shè)施簡易棚為鋼架結(jié)構(gòu)，吊蔓立體栽培，拱棚間過道和外圍用防蟲網(wǎng)密封，選擇健康，生長狀態(tài)一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

氯吡脲，四川施特優(yōu)化工有限公司；咯菌腈，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司；δ13C的參照標(biāo)準(zhǔn)為VPDB，δ15N的參照標(biāo)準(zhǔn)為Air，δ18O和δ2H的參照標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW，均購自國際原子能機(jī)構(gòu)(International Atomic Energy Agency，IAEA，奧地利)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Elementarvario PYRO cube元素分析儀-同位素比率質(zhì)譜(elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers，EA-IRMS)、vario PYRO cube元素分析儀，德國Elementar公司；Isoprime 100同位素質(zhì)譜儀，英國Isoprime公司；XP6 電子天平，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；FDY1001-UV-P 超純水儀，青島富勒姆科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 甜瓜開花授粉時(shí)，在同一設(shè)施棚內(nèi)同時(shí)進(jìn)行激素授粉和蜜蜂授粉試驗(yàn)，在同一種植區(qū)共選擇3個(gè)設(shè)施棚進(jìn)行試驗(yàn)。激素授粉處理組：將10袋5 mL氯吡脲(有效成分0.1%)和2袋10 mL咯菌腈(有效成分25 g·L-1)加入1 L水中混合后，快速均勻地噴灑在雌花子房(瓜胎)上，再用網(wǎng)袋套住，并做好標(biāo)記；蜜蜂授粉處理組：在雌花開放前一天的夜間，將中華蜜蜂授粉蜂群(3張脾/箱，有蜂王)搬至設(shè)施棚內(nèi)，第二天標(biāo)記中華蜜蜂訪問的雌花。

選取授粉后第7、第10、第20、第30天以及采收期(第45～第47天)的甜瓜果實(shí)進(jìn)行同位素比率值測定。每個(gè)處理組隨機(jī)選取5個(gè)甜瓜，3個(gè)設(shè)施棚共計(jì)150個(gè)樣本。將不同發(fā)育期的甜瓜去皮去籽，果肉切碎后勻漿，勻漿后將樣本在-80℃條件下冷凍干燥72 h，檢測穩(wěn)定同位素前于干燥器中平衡3 d。

1.3.2 碳、氮穩(wěn)定同位素測定 參照劉志等[26]的方法，采用元素分析儀-同位素比率質(zhì)譜測定甜瓜果肉中的總δ13C和δ15N值。稱取約2 mg甜瓜樣品，用錫箔杯包樣后，通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀中，樣品中的碳元素和氮元素轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2，再經(jīng)稀釋后進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀檢測。具體參數(shù)為：元素分析儀氧化爐和還原爐的溫度分別為920和600℃，N2吹掃流量為250 mL·min-1，同位素質(zhì)譜檢測時(shí)間設(shè)置為550 s，以CO2和N2為參考?xì)狻?/p>

1.3.3 氧、氫同位素測定 參照劉志等[26]的方法，采用元素分析儀-同位素比率質(zhì)譜測定甜瓜樣品中的δ18O和δ2H值。稱取約1 mg甜瓜樣品，用銀箔杯包好后放入120位自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)，將樣品送入元素分析儀中，經(jīng)燃燒爐高溫裂解后，產(chǎn)生的CO和H2進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。具體參數(shù)為：N2流量為125 mL·min-1，燃燒爐溫度為1 450℃，同位素質(zhì)譜檢測時(shí)間設(shè)置為950 s，O2和H2作參考?xì)狻?/p>

1.3.4 穩(wěn)定同位素比率計(jì)算 按照公式計(jì)算穩(wěn)定同位素比率：

δ=[(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn))-1]×1 000‰

式中，R樣品為所測樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，其中δ13C的相對標(biāo)準(zhǔn)為VPDB，δ15N的相對標(biāo)準(zhǔn)為Air，δ18O和δ2H的相對標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各處理數(shù)據(jù)平等測定3次，采用SPSS 24軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果以Mean±SD表示，并采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育期及授粉方式對設(shè)施甜瓜δ13C值的影響

單因素方差分析箱線圖可以更全面、直觀地反映不同授粉方式甜瓜在不同發(fā)育期樣本間的差異。由圖1可知，激素授粉甜瓜在不同發(fā)育期的δ13C值不同，且甜瓜發(fā)育10 d時(shí)的均值與采收期(45～47 d)存在顯著差異(P<0.05)，整個(gè)發(fā)育期蜜蜂授粉對甜瓜的δ13C值無顯著影響(P>0.05)。在甜瓜發(fā)育30 d時(shí)，2種授粉方式的δ13C值差異最大，蜜蜂授粉的δ13C均值高于激素授粉1.033‰(圖1)。對δ13C值的變異系數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在2種授粉方式下，隨著發(fā)育時(shí)間的延長(7～30 d)，甜瓜δ13C值的變異系數(shù)絕對值由大到小，在采收期時(shí)出現(xiàn)反彈(表1)。

表1 不同授粉方式設(shè)施甜瓜不同發(fā)育期果實(shí)中δ13C、δ15N、δ18O和δ2H值的變異系數(shù)Table 1 Coefficient variances in δ13C, δ15N, δ18O and δ2H values of greenhouse muskmelon during the different development stages by different pollination methods /%

注：不同小字母表示差異顯著(P<0.05)?！啊恪北硎揪怠Ｏ峦?。Note：Different lowercase letters represent significant difference at 0.05 level.‘°’ represents the average value.The same as following.圖1 不同授粉方式設(shè)施甜瓜果實(shí)發(fā)育期δ13C值的單因素方差分析箱線圖Fig.1 One-way ANOVA boxplot of δ13C value in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

2.2 不同發(fā)育期及授粉方式對設(shè)施甜瓜δ15N值的影響

由圖2可知，隨著發(fā)育期的變化，激素授粉對不同發(fā)育期甜瓜的δ15N值均無顯著影響，而蜜蜂授粉甜瓜在第7和20天的δ15N值差異顯著(P<0.05)。在甜瓜發(fā)育20 d時(shí)，2種授粉方式的δ15N值差異最大，激素授粉甜瓜δ15N均值較蜜蜂授粉高1.13‰，激素授粉甜瓜δ15N值的變異系數(shù)小于蜜蜂授粉，此外發(fā)育7 d時(shí)激素授粉甜瓜的δ15N值差異最大，變異系數(shù)為0.61%(表1)。

圖2 不同授粉方式設(shè)施甜瓜果實(shí)發(fā)育期δ15N值的單因素方差分析箱線圖Fig.2 One-way ANOVA boxplot of δ15N value in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

2.3 不同發(fā)育期及授粉方式對設(shè)施甜瓜δ18O值的影響

由圖3可知，激素授粉對不同發(fā)育期甜瓜δ18O值的影響較小(P>0.05)。發(fā)育7和30 d的δ18O值存在顯著差異(P<0.05)。在甜瓜采收期時(shí)，2種不同授粉方式的δ18O值差異最大，蜜蜂授粉δ18O高于激素授粉1.85‰。通過對δ18O值的變異系數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨發(fā)育期的變化，2種授粉方式甜瓜δ18O值的變異系數(shù)差異較小。此外，在采收期時(shí)，激素授粉甜瓜的δ18O值與δ15N值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)(表2)；在發(fā)育10 d時(shí)，蜜蜂授粉甜瓜的δ18O值與δ15N值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)(表3)。

圖3 不同授粉方式設(shè)施甜瓜果實(shí)發(fā)育期δ18O值的單因素方差分析箱線圖Fig.3 One-way ANOVA boxplot of δ18O in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

2.4 不同發(fā)育期及授粉方式對設(shè)施甜瓜δ2H值的影響

由圖4可知，在發(fā)育7～20 d時(shí)，2種授粉方式對甜瓜的δ2H值無顯著影響(P>0.05)；而在發(fā)育30 d時(shí)，蜜蜂授粉和激素授粉甜瓜的δ2H值出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，分別為-53.50‰和-43.63‰。這可能是由于甜瓜受代謝過程中同位素分餾的影響，導(dǎo)致接受不同授粉方式甜瓜的δ2H值出現(xiàn)差異。通過對δ2H值的變異系數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2種授粉方式甜瓜δ2H值的變異系數(shù)在采收期時(shí)差異最大(表1)。對同一發(fā)育期甜瓜的δ2H值與其他同位素比率進(jìn)行相關(guān)性分析(表2、表3)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育10 d時(shí)，激素授粉甜瓜的δ2H值與δ18O值呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而蜜蜂授粉甜瓜的δ2H值與δ18O值、δ15N值均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；對于激素授粉而言，甜瓜在發(fā)育20 d時(shí)δ2H值與δ18O值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，采收期甜瓜的δ2H值與δ13C值、δ18O值均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。說明蜜蜂授粉甜瓜發(fā)育10 d時(shí)δ2H和δ18O、δ15N值的變化趨勢一致，激素授粉甜瓜發(fā)育20 d時(shí)δ2H和δ18O的變化趨勢一致。

圖4 不同授粉方式設(shè)施甜瓜果實(shí)發(fā)育期δ2H值的單因素方差分析箱線圖Fig.4 One-way ANOVA boxplot of δ2H in greenhouse muskmelons during fruit development stages by different pollination methods

3 討論

蜜蜂授粉可降低生產(chǎn)成本，提升果品品質(zhì)。目前國內(nèi)外針對不同授粉方式對果品同位素影響的基礎(chǔ)性研究較少，無法區(qū)別蜜蜂授粉與其他授粉的差異。本研究結(jié)果表明，在相同種植和環(huán)境條件下，激素授粉和蜜蜂授粉設(shè)施甜瓜的δ13C、δ15N和δ18O值都無顯著差異，可能由于授粉方式對同一發(fā)育期碳、氮和氧的同位素分餾效應(yīng)無明顯影響，不足以作為區(qū)別甜瓜授粉方式的有效特征指標(biāo)。然而，2種授粉方式的甜瓜在不同生長時(shí)期，碳、氮和氧穩(wěn)定同位素存在自然分餾效應(yīng)和差異變化，這些差異可能是由于植物在不同發(fā)育期光合碳代謝途徑[26-27]、養(yǎng)分的積累和分配[27-28]等不同。如植物中δ13C值的范圍因光合作用的途徑不同而存在差異，因此能夠反應(yīng)植物的生長方式和生理生態(tài)過程；氧同位素受植物的光合作用以及呼吸作用中的同位素分餾影響；農(nóng)產(chǎn)品中氮同位素的影響主要與農(nóng)業(yè)施肥相關(guān)。

對于δ2H值，生物體代謝方式的不同也可能引起合成碳水化合物分子同位素組成的差異，造成2H/1H比率的變化。植物干物質(zhì)中的氫同位素不僅受降水同位素的影響，也受植物蒸騰作用的影響[18]。在果樹生長過程中，水分運(yùn)輸?shù)街仓旮鞑课粫r(shí)并未出現(xiàn)分餾現(xiàn)象，但后續(xù)進(jìn)行一系列生化反應(yīng)后產(chǎn)生了同位素的分餾，導(dǎo)致δ2H值發(fā)生變化[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育30 d時(shí)激素授粉和蜜蜂授粉甜瓜的δ2H值呈顯著差異，這說明δ2H值可能受授粉方式的影響。由此可見，δ2H值可作為設(shè)施甜瓜不同授粉方式鑒別的一個(gè)重要指標(biāo)，但不同授粉方式引起δ2H值出現(xiàn)差異的機(jī)理需要進(jìn)一步深入研究。此外，水果中特征成分含量還受其他因素(如品種、成熟度)的影響，因此用單一變量作為判定甜瓜授粉方式真實(shí)性溯源指標(biāo)，存在一定的局限性，推測還需要結(jié)合多元素、有機(jī)成分分析[13]等結(jié)果支撐，才能更好地進(jìn)行果品溯源分析。

4 結(jié)論

本研究通過EA-IRMS比較了不同發(fā)育期設(shè)施甜瓜中4種穩(wěn)定同位素比值(δ13C、δ15N、δ18O和δ2H)。結(jié)果表明，在同一發(fā)育時(shí)期，不同授粉方式甜瓜果實(shí)中的δ13C、δ15N和δ18O值較穩(wěn)定，無顯著差異(P>0.05)，僅發(fā)現(xiàn)在甜瓜發(fā)育30 d時(shí)蜜蜂授粉和激素授粉δ2H值存在顯著差異，可作為甜瓜授粉方式的一項(xiàng)標(biāo)識(shí)性指標(biāo)。該研究初步揭示了不同授粉方式下和發(fā)育階段中甜瓜穩(wěn)定同位素的變化特征和影響規(guī)律，對豐富設(shè)施甜瓜溯源體系具有重要意義。但由于本研究選取在海南省種植的甜瓜樣品進(jìn)行試驗(yàn)，具有一定的地域限制，試驗(yàn)結(jié)果的普遍性不足。因此，今后將針對在不同生產(chǎn)區(qū)域、地域相近、品種相似的甜瓜進(jìn)行更深入的分餾機(jī)理研究，建立并完善甜瓜果品的安全溯源體系。