水稻白條紋轉(zhuǎn)綠突變體wsl887的鑒定和基因定位

鄢小青 陳能剛 李 歡 陳 鋒 宋 澤 余顯權(quán)

(1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，貴州 貴陽 550006)

水稻葉色突變體的變異類型十分豐富，一般根據(jù)苗期不同的葉色表現(xiàn)，可將葉色突變體劃分為轉(zhuǎn)綠型、白化、黃化、條紋、斑馬紋以及黃色斑點(diǎn)共6種類型[1]。水稻葉色突變體是研究植物葉綠體發(fā)育、光合作用和光形態(tài)建成等生物學(xué)過程分子調(diào)控機(jī)制的理想材料。其中溫敏型轉(zhuǎn)綠型突變體的葉色突變表型受溫度誘導(dǎo)，在自然條件下轉(zhuǎn)綠型突變體的產(chǎn)量性狀不受負(fù)面影響，可用作水稻雜交育種中的標(biāo)記性狀。因此，對水稻轉(zhuǎn)綠型葉色突變的鑒定及基因定位，可以為水稻高光效育種提供理論依據(jù)，也可以作為標(biāo)記性狀應(yīng)用于水稻不育系繁殖和雜交制種等領(lǐng)域。水稻葉色表型大多數(shù)為一對隱性核基因控制，近年來在水稻中克隆得到與葉色相關(guān)的基因已超過120個(gè)，其中白化轉(zhuǎn)綠基因有51個(gè)，主要涉及光合色素代謝途徑及葉綠體發(fā)育調(diào)控[2]。轉(zhuǎn)綠突變體的表型變化主要受到外界溫度或生育進(jìn)程的調(diào)控[3]，如V2[4]、WSL[5]、WSL3[6]、WSL4[7]、WSL6[8]、WSL9[9]和TSV3[10]等的突變表型受外界溫度調(diào)控；Rey(k2)[11]、WGL2[12]、GRA78[13]等的突變表型受生育進(jìn)程調(diào)控。V2編碼一個(gè)鳥苷酸激酶，參與質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)的建立[4]，WSL編碼一個(gè)PLS亞家族的PPR蛋白，參與葉綠體基因RNA剪切[5]；WSL3編碼一個(gè)質(zhì)體RNA聚合酶的非核心亞基OsPAP1/OspTAC3，影響葉綠體的早期發(fā)育[6]；WSL4編碼一個(gè)屬于P亞家族的PPR蛋白，對水稻葉綠體RNA Ⅱ內(nèi)含子剪接至關(guān)重要[7]；WSL6編碼一個(gè)定位于葉綠體中的era型鳥苷-5′-三磷酸(era-type granosine-5′-triphosphate(GTP)-binding protein)結(jié)合蛋白[8]；WSL9編碼一種具有HNH結(jié)構(gòu)域的新蛋白[9]；TSV3編碼一個(gè)類ObgGTPase蛋白，參與調(diào)控葉綠體50S核糖體大亞基的生物合成[10]。Rey(k2)編碼一個(gè)磷酸果糖激酶B型葉綠體蛋白，參與核質(zhì)信號的傳遞[11]；WGL2編碼一種保守的核糖體蛋白，是水稻葉綠體發(fā)育的重要組成部分[12]；TSV3編碼一個(gè)類ObgGTPase蛋白，參與調(diào)控葉綠體50S核糖體大亞基的生物合成[12]；GRA78編碼一個(gè)定位于葉綠體的硫氰酸合成酶[13]。盡管已經(jīng)克隆了很多水稻轉(zhuǎn)綠型葉色突變基因，但其分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，因此有必要定位和克隆更多的水稻葉片轉(zhuǎn)綠型葉色突變基因，為系統(tǒng)闡明轉(zhuǎn)綠型葉色突變的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究利用60Co輻射誘變貴州地方稻種資源橋港珍珠米，獲得新的溫敏型白條紋轉(zhuǎn)綠突變體wsl887，對該突變體在自然環(huán)境中的表型特征和相關(guān)農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行不同溫度條件下的表型變化、葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察以及相關(guān)基因表達(dá)分析、基因定位等研究，旨在為目的基因的克隆及功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用貴州地方粳稻資源橋港珍珠米通過60Co輻射誘變獲得白條紋轉(zhuǎn)綠葉色突變體wsl887，經(jīng)過連續(xù)多代自交，白條紋轉(zhuǎn)綠性狀穩(wěn)定遺傳。2019年3月在海南三亞海螺村貴州水稻南繁育種基地以橋港珍珠米和秈稻R1638為父本，分別與wsl887雜交獲得F1代(wsl887/橋港珍珠米和wsl887/R1638)種子，同年4月在貴陽(貴州省農(nóng)作物品種資源研究所水稻試驗(yàn)田)種植F1代，F(xiàn)1自交構(gòu)建F2遺傳群體和F2定位群體。

1.2 表型及農(nóng)藝性狀分析

分別在不同溫度(20、25和30℃)的光照培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h黑暗)中培養(yǎng)野生型和突變體wsl887，觀察幼苗表型。于2019年4月20日在貴陽試驗(yàn)田分別種植wsl887和野生型親本橋港珍珠米，5月25日移栽大田，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)種植40株，株間距20 cm×30 cm。在成熟后從種植小區(qū)中隨機(jī)取5株進(jìn)行農(nóng)藝性狀的調(diào)查。

1.3 光合色素含量測定

在光照培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h黑暗)中培養(yǎng)野生型和突變體wsl887幼苗，在不同溫度(20、25和30℃)條件下萌發(fā)后20 d，選擇不同溫度條件下，野生型和突變體的全展葉，分別稱取新鮮葉片0.2 g，剪碎后放入10 mL 95%乙醇中，4℃避光放置48 h，期間多次手動搖勻。將浸泡后的提取液移入25 mL 容量瓶中，以95%乙醇定容。使用722N型分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)測量665、649和470 nm下的吸光值。按Lichtenthaler[14]的方法，計(jì)算葉片單位鮮重的葉綠素(Chl)和胡蘿卜素(Caro)含量。計(jì)算公式如下：

Chla=13.95×A665-6.88×A649

Chlb=24.96×A649-7.32×A665

Caro=(1000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb)/245

葉綠體色素含量=C×V/[W×1000]

式中，C為色素濃度(mg·L-1)、V為提取液體積(L)、W為樣品鮮重(g)。

1.4 葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

分別選取在光照培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h黑暗)中培養(yǎng)不同溫度(20和30℃)條件下萌發(fā)后20 d的野生型和突變體wsl887幼苗的全展葉，觀察葉肉細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)。材料固定時(shí)確定取材部位，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷，組織體積一般不超過1 mm×1 mm×1 mm，迅速投入電鏡固定液固定，并用真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱。0.1 mol·L-1磷酸緩沖液PBS(pH值7.4)漂洗3次，每次15 min；用1%的鋨酸0.1 mol·L-1磷酸緩沖液PBS(pH值7.4)室溫(20℃)固定5 h。0.1 mol·L-1磷酸緩沖液PBS(pH值7.4)漂洗3次，每次15 min；組織依次入30%～50%～70%～80%～90%～95%～100%～100%酒精進(jìn)行脫水，每次1 h。無水乙醇∶丙酮=3∶1，0.5 h，無水乙醇∶丙酮=1∶1，0.5 h，無水乙醇∶丙酮=1∶3，0.5 h，丙酮1 h；置于丙酮∶812包埋劑=3∶1，2～4 h，丙酮:812包埋劑=1∶1，滲透過夜，丙酮∶812包埋劑=1∶3，2～4 h，純812包埋劑5～8 h，將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37℃烤箱過夜；用60℃烤箱聚合48 h；用超薄切片機(jī)切片(60～80 nm)；鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，切片室溫干燥過夜；在hitachi HT7700透射電子顯微鏡(日立高新技術(shù)公司，日本)下觀察，采集圖像分析。

1.5 DNA的提取和PCR擴(kuò)增

水稻新鮮葉片DNA提取按改良的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)法提取[15]，分別提取親本、混池及F2群體的基因組用于基因定位。PCR體系25 μL，包括T3 Super PCR Mix 21 μL、DNA模板2 μL和上下游引物各1 μL。PCR程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55～60℃退火10 s，72℃延伸10 s, 30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸2 min。

1.6 總RNA的提取與qRT-PCR

選取不同溫度下野生型和突變體wsl887葉片相同部位提取植物總RNA，采用寶生物工程(大連)有限公司的RNAiso Plus試劑盒提取總RNA；采用北京擎科生物GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；采用北京擎科生物的2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。在Applied Biosystems ABI 7500熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)上進(jìn)行qRT-PCR，以O(shè)seEF-1α為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法分析基因的相對表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。所有qRT-PCR引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

選取在20和30℃條件下萌發(fā)生長20 d的野生型和wsl887幼苗葉片，對其光合色素、葉綠體發(fā)育、光合作用和線粒體電子傳遞相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR分析(表2)。光合色素合成相關(guān)基因：CHLD、CHLH、CHLI和CHLG；光合作用相關(guān)基因：psaA/psbA(編碼PSI/PSII反應(yīng)中心蛋白)、rbcS/rbcL(編碼Rubisco小亞基/大亞基)、CAB1R/CAB2R(編碼PSII光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白)，其中CAB1R、CAB2R和rbcS屬于細(xì)胞核的編碼基因；psaA、psbA和rbcL屬于細(xì)胞質(zhì)的編碼基因；線粒體電子傳遞復(fù)合體基因：編碼線粒體電子傳遞復(fù)合體Ⅰ的基因nad2、nad4和nad5，編碼線粒體電子傳遞復(fù)合體Ⅲ的基因cob，編碼線粒體電子傳遞復(fù)合體Ⅳ的基因cox1、cox2和cox3，編碼線粒體電子傳遞復(fù)合體Ⅴ的基因atp6和atp8。

1.7 基因定位

采用混合群體分離分析法(bulked segregant analysis, BSA)法[16]定位目標(biāo)基因，從wsl887/R1638的F2群體中選取10株正常綠色的單株和10株葉片呈現(xiàn)白條紋的單株，分別等量混合成正?；虺睾屯蛔兓虺亍⒄账净蚪M的簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)分子標(biāo)記，利用秈稻9311和粳稻日本晴基因組間的差異，尋找多態(tài)性較好的SSR分子標(biāo)記。通過3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，篩選在突變體wsl887與R1638間的多態(tài)性分子標(biāo)記。用多態(tài)性好的分子標(biāo)記分析正?；虺嘏c突變基因池之間的多態(tài)性，找到目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記后用F2群體中的白條紋單株進(jìn)行驗(yàn)證，待確定該分子標(biāo)記連鎖后，進(jìn)一步尋找更多的多態(tài)性分子標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型與農(nóng)藝性狀鑒定

在大田條件下，wsl887在幼苗期呈現(xiàn)白條紋表型(圖1-A、B)，隨著植株生長開始轉(zhuǎn)綠，新長出的葉片為正常綠色。在成熟期，wsl887與野生型相比形態(tài)特征無明顯差異(圖1-C)，主要農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，wsl887的株高、有效穗、穗長、結(jié)實(shí)率和千粒重較野生型無顯著差異(表1)。

表1 野生型(WT)和突變體wsl887主要農(nóng)藝性狀比較Table 1 Comparison of major agronomic traits between WT and mutant wsl887

2.2 不同溫度下葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)野生型在20和30℃條件下，葉肉細(xì)胞中葉綠體含量豐富，葉綠體形態(tài)飽滿；而wsl887在20℃條件下，白化葉片的葉肉細(xì)胞中沒有葉綠體或者葉綠體發(fā)育畸形，含較多的囊泡狀結(jié)構(gòu)，線粒體結(jié)構(gòu)與野生型無明顯差異；wsl887在30℃條件下，葉片為正常綠葉，葉肉細(xì)胞中葉綠體發(fā)育完整，數(shù)量與野生型無明顯差異。表明在低溫(20℃)條件導(dǎo)致wsl887葉綠體發(fā)育異常，表現(xiàn)為白化表型；在高溫條件(30℃)下，wsl887葉綠體的數(shù)量與葉綠體結(jié)構(gòu)的發(fā)育與野生型無顯著差異，表現(xiàn)為正常綠葉表型。

2.3 不同溫度光合色素的變化

不同溫度處理試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在不同溫度(20、25和30℃)光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)20 d的秧齡突變體wsl887的幼苗間存在葉色差異。在20℃條件下，wsl887葉片呈現(xiàn)完全白化；25℃條件下，wsl887呈現(xiàn)帶有白色條紋的葉片；在30℃條件下，wsl887葉色與野生型無明顯差異(圖4-A、B、C)。進(jìn)一步對不同溫度處理的野生型和wsl887的光合色素進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)(圖4-D、E、F)，與野生型相比，在20℃條件下，wsl887葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量降幅最大，均達(dá)到極顯著差異水平，分別降低至野生型的6.08%、5.87%、6.69%和12.48%；在25℃條件下，wsl887葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量降幅也較大，均達(dá)到極顯著差異水平，分別降低至野生型的53.39%、53.45%、53.19%和59.96%；在30℃條件下，與野生型相比，wsl887葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與野生型無顯著差異。

注：A、B、C：野生型葉肉細(xì)胞； D、E、F：突變體wsl887葉肉細(xì)胞。A、D: Bar=20 μm; B、E: Bar=2 μm; C、F: Bar=1 μm。Note: A、B、C：Mesophyll cells structure of wild type (WT). D、E、F: Mesophyll cells structure of wsl887 mutant. A、D: Bar=20 μm. B、E: Bar=2 μm. C、F: Bar=1 μm.圖2 20℃溫度下野生型(WT)和突變體wsl887葉肉細(xì)胞中葉綠體超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of chloroplasts in mesophyll cells of the wild type (WT) and wsl887 mutant under 20℃ temperature conditions

注：A、B、C：野生型葉肉細(xì)胞； D、E、F：突變體wsl887葉肉細(xì)胞。A、D: Bar=20 μm; B、E: Bar=2 μm; C、F: Bar=1 μm。Note: A、B、C：Mesophyll cells structure of wild type (WT). D、E、F: Mesophyll cells structure of wsl887 mutant. A、D: bar=20 μm. B、E: Bar=2 μm. C、F: Bar=1 μm.圖3 30℃溫度下野生型(WT)和突變體wsl887葉肉細(xì)胞中葉綠體超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructure of chloroplasts in mesophyll cells of the wild type (WT) and wsl887 mutant under 30℃ temperature conditions

注： **: 在 0.01水平上差異顯著。Note: **: Significant difference at 0.01 level.圖4 不同溫度下野生型(WT)和突變本wsl887幼苗表型及光合色素含量Fig.4 Phenotype and photosynthetic pigment content of the wild type (WT) and wsl887 mutant seedlings under different temperature conditions

2.4 光合色素合成、光合作用和線粒體電子傳遞復(fù)合體相關(guān)基因的表達(dá)分析

由于wsl887光合色素含量下降，葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，推測在低溫條件下，wsl887中葉綠素合成、葉綠體發(fā)育、光合作用以及線粒體電子傳遞相關(guān)基因(表2)的表達(dá)也受到不同的影響。由圖5可知，在20℃條件下與野生型相比，wsl887葉片的葉綠素合成途徑相關(guān)基因(CHLD、CHLH、CHLI、CHLG)的表達(dá)無顯著差異；光合作用相關(guān)基因psaA、psbA、rbcS、rbcL、CAB1R和CAB2R的表達(dá)量不同程度降低，均達(dá)到顯著水平；線粒體電子傳遞復(fù)合體基因cob、nad2、nad4和nad5、cox1和cox2的表達(dá)量顯著增加，cox3和atp6的表達(dá)量無顯著差異，atp8的表達(dá)量顯著降低。說明在低溫條件下，wsl887的呼吸作用增強(qiáng)。

注：*表示在 0.05 水平上差異顯著。下同。Note: * indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.圖5 20℃條件下野生型(WT)及突變體wsl887葉片中光合色素代謝、光合作用和線粒體相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of genes in photosynthetic pigment metabolism, photosynthesis and mitochondrial genes of the wild type (WT) and wsl887 mutant leaves under 20℃

表2 光合色素代謝、光合作用以及線粒體相關(guān)基因的定量引物Table 2 Primers of photosynthetic pigment metabolism, photosynthesis mitochondrial related genes used for quantitative real-time PCR

由圖6可知，在30℃條件下與野生型相比，wsl887葉片的葉綠素合成途徑相關(guān)基因除CHLD顯著減少，除GHLG無顯著差異，其他基因的表達(dá)量均顯著增加；在光合作用相關(guān)基因中，細(xì)胞質(zhì)編碼基因psaA、psbA和rbcL的表達(dá)量均顯著減少，而細(xì)胞核編碼基因CAB1R、CAB2R和rbcS的表達(dá)量均顯著增加；線粒體電子傳遞復(fù)合體基因中，nad4的表達(dá)量無顯著差異，其他基因的表達(dá)量均顯著減少。說明在高溫條件下，wsl887呼吸作用效率減少，光合色素合成效率增加。

圖6 30℃條件下野生型(WT)及突變體wsl887葉片中光合色素代謝、光合作用和線粒體相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of genes in photosynthetic pigment metabolism, photosynthesis and mitochondrial genes of the wild type (WT) and wsl887 mutant leaves under 30℃

2.5 遺傳分析與基因定位

注：n: 群體大小; recombinant: 重組單株數(shù)。Note: n: Number of group. recombinant: Number of recombinant.圖7 wsl887基因在2號染色體上的分子定位Fig.7 Molecular mapping of wsl887 on chromosome 2 in rice

表3 突變體wsl887的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of the wsl887 mutant

在743.6 kb區(qū)域內(nèi)共存在63個(gè)候選基因(表4)，經(jīng)https://www.genscript.com/亞細(xì)胞定位預(yù)測，葉綠體上的基因可能有19個(gè)，其中包括一個(gè)已克隆的白條紋的基因WSL4 (LOC_Os02g35750)，優(yōu)先對該基因進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)，突變體wsl887的該基因與野生型的序列完全一致，初步排除該基因的等位突變。根據(jù) http://www.ricedata.cn/gene/和 http://www.gramene.org/提供的信息，對WSL887基因定位區(qū)間內(nèi)可能定位于葉綠體上的19個(gè)基因進(jìn)行注釋分析(表5)?？芍?，LOC-Os02g34940、LOC-OsO2g35500和LOC-OS02g35750最有可能是WSL887的侯選基因。

表5 wsl887基因定位區(qū)間內(nèi)定位于葉綠體的注釋基因Table 5 Annotated genes located in chloroplast in wsl887 gene mapping interval

3 討論

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場所，對植物生長發(fā)育起重要作用。葉色突變是由于控制葉綠素生物合成和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的突變失活或沉默，導(dǎo)致葉片中葉綠素含量改變[17]，因此葉色突變體是研究植物中葉綠素合成和葉綠體發(fā)育的理想材料[18-19]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對葉色突變基因的研究日益增多，其中已克隆的白化轉(zhuǎn)綠基因包括V1[20]、V2[4]、V3[1]、St1[1]、Hsp70CP1[21]、TCD5[22]、WSL4[7]、OsV4[23]、DUA1[24]、TCD9[25]、TCD10[25]、OsSIG2A[26]、OsABCI8[27]、TCM12[28]、TCD11[29]、SPP[30]、VAL1[31]、TSV3[12]和VYL1[32]等，大部分葉色突變體由于葉綠素含量減少和葉綠體發(fā)育緩慢，對產(chǎn)量性狀造成較嚴(yán)重的負(fù)面影響，只有少部分葉色突變體對產(chǎn)量性狀影響較小。本研究的白條紋轉(zhuǎn)綠突變體wsl887屬于溫敏型突變體，在20℃條件下萌發(fā)的幼苗呈白化表型，在25℃條件下萌發(fā)的幼苗呈白條紋表型，在30℃條件下突變體的表現(xiàn)能夠恢復(fù)到野生型水平。在大田wsl887突變體苗期呈現(xiàn)白條紋表型，新生葉恢復(fù)正常綠色表型，在成熟期時(shí)突變體的農(nóng)藝性狀與野生型無顯著差異，表明基因突變未影響該突變體的產(chǎn)量性狀，在水稻生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景。

本研究表明，wsl887受一對隱性核基因控制，將WSL887定位于2號染色體上的SSR標(biāo)記RM262和RM5427之間，物理距離為743.6 kb。該區(qū)間內(nèi)存在63個(gè)候選基因(表4)，其中亞細(xì)胞定位于葉綠體上的基因有19個(gè)，影響葉綠體的發(fā)育。其中包括已報(bào)道的一個(gè)白條紋基因WSL4(LOC_Os02g35750)編碼一種PPR蛋白[7]，LOC_Os02g34940編碼OsPDIL1-3蛋白二硫鍵異構(gòu)酶，LOC_Os02g35500編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶蛋白的NAD結(jié)合域，參與磷酸戊糖途徑。WSL4屬于P亞家族的PPR蛋白，對水稻葉綠體RNA Ⅱ內(nèi)含子剪接至關(guān)重要。wsl4突變導(dǎo)致atpF、ndhA、rpl2和rps12的剪接缺陷。前人研究表明，在20℃時(shí)wsl4突變體呈白化表型，幾乎檢測不到光合色素；在30℃/25℃(白/晝)時(shí)呈白條紋表型，光合色素顯著減少；在30℃條件下部分恢復(fù)表型，但光合色素含量與野生型仍然有較顯著的差異[7]。本研究中突變體wsl887在20℃時(shí)，白化葉片中的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素含量極顯著降低；隨溫度升高，突變體wsl887的光合色素含量逐漸上升，在30℃條件下與野生型無差異，能夠完全恢復(fù)到正常野生型的表型。本研究中，在20℃條件下wsl887葉片的葉綠素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量無顯著差異；光合作用相關(guān)基因psaA、psbA、rbcS、rbcL、CAB1R和CAB2R的表達(dá)量顯著降低；部分編碼線粒體電子傳遞復(fù)合體基因cob、nad2、nad4和nad5、cox1和cox2的表達(dá)量顯著增加。在30℃條件下與野生型相比，wsl887葉片的葉綠素合成途徑相關(guān)基因除CHLD顯著減少以外，其他基因的表達(dá)均顯著增加；在光合作用相關(guān)基因中由細(xì)胞質(zhì)編碼的基因psaA、psbA和rbcL的表達(dá)量均顯著減少，而由細(xì)胞核編碼的基因CAB1R、CAB2R和rbcS的表達(dá)量均顯著增加；線粒體電子傳遞復(fù)合體基因中除nad4以外，其他基因的表達(dá)量均顯著減少。由細(xì)胞質(zhì)編碼的psaA、psbA和rbcL基因的表達(dá)量在不同溫度條件下均顯著減少，可以推測該基因可能與細(xì)胞質(zhì)中葉綠體的發(fā)育有關(guān)。而wsl4中光合色素合成和光合作用相關(guān)基因CHLD、CHLH、CHLI、CAB1R、CAB2R、rbcS、psaA、psbA和rbcL的表達(dá)均顯著下調(diào)[7]，wsl887與wsl4的光合作用相關(guān)基因表達(dá)的變化趨勢基本一致，均較野生型顯著下調(diào)，而在光合色素合成相關(guān)基因的表達(dá)上存在較大差異。因此，推測wsl887可能是新的溫敏型葉色突變體。

本研究對突變體wsl887與野生型中的WSL4基因的全長進(jìn)行測序分析，未發(fā)現(xiàn)堿基突變，因此推測WSL887可能是一個(gè)新的溫敏型葉片白條紋轉(zhuǎn)綠基因。目前尚不能確定WSL887的侯選基因，有待進(jìn)一步進(jìn)行基因測序分析和候選基因的遺傳互補(bǔ)驗(yàn)證試驗(yàn)。

4 結(jié)論

白條紋轉(zhuǎn)綠突變體wsl887是一個(gè)新的溫敏型葉色突變體，wsl887表型受溫度誘導(dǎo)，在20℃下萌發(fā)的wsl887幼苗呈現(xiàn)白化，葉肉細(xì)胞中光合色素含量少，葉綠體發(fā)育缺陷。在25℃條件下，wsl887幼苗呈白條紋表型，葉片光合色素含量增加，但與野生型差異顯著。在30℃條件下，wsl887幼苗呈現(xiàn)正常綠葉表型，葉片光合色素含量與野生型無顯著差異。WSL887基因突變影響光合作用和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，而對光合色素代謝和線粒體電子傳遞相關(guān)基因的表達(dá)影響較小。wsl887突變表型受一對隱性核基因控制，定位于2號染色體上的SSR標(biāo)記RM262和RM5427之間，約743.6 kb 區(qū)域。本研究為下一步的WSL887基因克隆和闡釋該基因?qū)θ~綠體發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。