樹莓成熟胚組織培養(yǎng)技術(shù)研究

楊艷敏,魏 鑫,張 舵,王 升,劉修麗,王宏光,王 莉,劉 成

(遼寧省果樹科學(xué)研究所,營口 115009)

樹莓為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(RubusL.)植物,其果實(shí)富含多種維生素、超氧化物歧化酶(SOD)、花青素、鞣化酸等,具有突出的抗癌、抗衰老等保健功能,有一定的加工潛力[1-2]。 樹莓果實(shí)綜合開發(fā)利用途徑多,國際市場需求空間大,市場前景廣闊,是目前風(fēng)靡世界的“第三代水果”之一。 隨著國際和國內(nèi)市場對高品質(zhì)樹莓果品及消費(fèi)者對果品多樣化需求的增加,以及老品種逐步表現(xiàn)出病害嚴(yán)重、種性退化、品質(zhì)下降等問題,生產(chǎn)上進(jìn)行樹莓品種的更新?lián)Q代和品種結(jié)構(gòu)調(diào)整勢在必行。

通過優(yōu)良親本組培,利用雜交技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、抗病、適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)新品種是樹莓產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的原動力之一。 然而,樹莓雜交種子常規(guī)播種存在萌發(fā)難、出苗慢、出苗不整齊及出苗率低等問題,阻礙了樹莓雜交育種的進(jìn)程。 研究表明,用濃硫酸或次氯酸鹽腐蝕種殼,之后進(jìn)行幾周至幾個月的層積(濕冷)處理,可以不同程度地提高樹莓種子的萌發(fā)率,但種間差異很大,同種處理的可重復(fù)性不好[3-6]。 種皮障礙和胚未發(fā)育完全成熟是樹莓種子出苗慢、出苗難的重要因素,組織培養(yǎng)技術(shù)可以打破樹莓種子種皮障礙,在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)種胚快速萌發(fā)、高效成苗和胚挽救,實(shí)現(xiàn)每一粒雜交種子萌發(fā)成苗,是培養(yǎng)樹莓雜交種子成苗的有效措施。 本研究以多個樹莓雜交組合種子為試材,進(jìn)行組培技術(shù)研究,以期篩選出樹莓雜交種子最佳誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基配方,優(yōu)化組培苗田間移栽及培養(yǎng)流程,為樹莓育種、雜交苗培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選自遼寧省果樹科學(xué)研究所樹莓資源圃,以紅樹莓‘海爾特茲’ ב托拉米’(HT)、‘托拉米’ ב海爾特茲’(TH),‘秋來斯’ × ‘如貝’(QR)、‘如貝’ × ‘秋來斯’(RQ),‘托拉米’ × ‘阿崗昆’(TA)、‘阿崗昆’ ב托拉米’(AT),‘海爾特茲’ ב米克’(HM),‘米克’ × ‘海爾特茲’(MH)8 個雜交組合獲得的種子為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌材料的獲得

選取發(fā)育成熟且飽滿的雜交種子,首先用手術(shù)刀片將樹莓種子堅(jiān)硬的種皮兩端切破[7],不能傷及種胚,用自來水沖洗12 h,置于超凈工作臺上用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精蕩洗30 s;再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞(HgCl2)溶液浸泡并不斷攪動,倒去升汞溶液后用無菌水沖洗3—5 次,用無菌濾紙吸去材料上的附著水,平鋪于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上。 用0.1%升汞滅菌的時間設(shè)5 個處理(3 min、5 min、8 min、10 min、15 min),每處理20 粒種子,3 次重復(fù),2 周后調(diào)查滅菌效果[8]。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè) 6 個處理,在 1∕2MS 基礎(chǔ)上添加 6-BA 0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、0.8 mg∕L、1.0 mg∕L、1.5 mg∕L;以不添加6-BA 為對照(CK)。 激素組合設(shè)5 個處理,在1∕2MS+6-BA 0.5 mg∕L 基礎(chǔ)上添加 IBA 0.5 mg∕L、1.0 mg∕L、1.5 mg∕L、2.0 mg∕L、2.5 mg∕L,每處理 15—20 粒種子,每瓶 5 粒種子,3—4 瓶,3 次重復(fù),4 周后調(diào)查試驗(yàn)結(jié)果。 培養(yǎng)基中添加蔗糖20 g∕L、瓊脂4.6 g∕L。 種胚先進(jìn)行7 d 暗培養(yǎng)后,再移入正常光照下培養(yǎng),光照強(qiáng)度1 500—2 000 lx,溫度21—23 ℃,光照時間14 h,pH 5.8。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

雜交種胚發(fā)芽后,1 粒種胚萌發(fā)出1 個單芽,形成1 個株系,接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。 增殖培養(yǎng)設(shè) 6 個處理:MS+6-BA 0.3 mg∕L、MS+6-BA 0.5 mg∕L、MS+6-BA 0.8 mg∕L、MS+6-BA 1.0 mg∕L、MS+6-BA 1.5 mg∕L,以 MS +6-BA 0 mg∕L 為對照,6 個處理均添加 GA30.5 mg∕L、IBA 0.1 mg∕L、蔗糖30 g∕L、瓊脂4.6 g∕L。 每處理接種10 瓶,每瓶1 個單株,3 次重復(fù),30 d 后調(diào)查試管苗的增殖倍數(shù)及植株生長狀況[9]。 繼代苗生長勢可劃分為5 個等級:(1)莖桿細(xì)弱,葉片微黃,生長矮小而弱;(2)莖桿細(xì)弱,葉片微黃,長勢較弱;(3)莖桿中等,葉片淡綠,生長一般;(4)莖桿粗壯,葉片淡綠,生長良好;(5)莖桿粗壯,葉片濃綠,生長健壯。

1.2.4 生根培養(yǎng)

試管苗經(jīng)增殖培養(yǎng)6 周后,待苗高2—3 cm 時,剪成1 cm 單芽莖段接入生根培養(yǎng)基中,進(jìn)行生根培養(yǎng),生根培養(yǎng)基設(shè) 6 個處理:1∕2MS + IBA 0. 1 mg∕L、1∕2MS + IBA 0.2 mg∕L、1∕2MS + IBA 0.3 mg∕L、1∕2MS+IBA 0.4 mg∕L、1∕2MS + IBA 0.5 mg∕L,以 1∕2MS + IBA 0 mg∕L 為對照,6 個處理均添加蔗糖15 g∕L、瓊脂4.3 g∕L,每處理接種5 瓶,每瓶10 株,3 次重復(fù),40 d 后調(diào)查生根株數(shù)和生根率。

1.2.5 煉苗與移栽

移栽前先將生根苗的培養(yǎng)瓶口打開,通風(fēng)煉苗,以提高試管苗的適應(yīng)能力,空氣濕度保持在75%以上,移栽時用鑷子取出生根苗,洗去根部附著的培養(yǎng)基,再用500 mg∕L 的海藻素快速浸沾后,栽入育苗盤中,基質(zhì)為河沙+園田土+草炭土(基質(zhì)經(jīng)55%敵克松可濕性粉劑配制的0.1%水溶液加噁霉靈稀釋1 000—1 500 倍噴施消毒)[9-10]。 移栽成活后,當(dāng)苗高10—15 cm 時,即可轉(zhuǎn)入營養(yǎng)缽中定植。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用DPS 7.05 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行Duncan,s 新復(fù)極差顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌時間對污染率和種胚活性的影響

以‘海爾特茲’ ב托拉米’(HT)的雜交種子為試材,用0.1%HgCl2滅菌后進(jìn)行組織培養(yǎng),調(diào)查污染率和種胚活性,結(jié)果顯示:樹莓雜交種子處理3 min 時,組培污染率高達(dá)85%,5 min 時污染率為75%,10 min 時污染率為10%,15 min 時污染率最低,為5%,但種子褐變率達(dá)80%。 綜上,0.1%HgCl2滅菌10 min 污染率為10%,種子褐變率為10%,處理效果最佳(表1)。

表1 0.1%HgCl2 處理時間對樹莓種胚的滅菌效果Table 1 Sterilization effect of 0.1% HgCl2 treatment time on raspberry seed embryo

2.2 不同濃度6-BA 對樹莓種胚發(fā)芽的影響

以‘海爾特茲’ ב托拉米’(HT)、‘托拉米’ ב海爾特茲’(TH)、‘托拉米’ × ‘阿崗昆’(TA)、‘阿崗昆’ ב托拉米’(AT)正反交組合的種子為試材,滅菌后在添加不同濃度6-BA 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng),調(diào)查發(fā)芽率。 結(jié)果顯示:經(jīng)過3—4 周的培養(yǎng)后,樹莓同一父母本的正反交雜交種子在同一濃度6-BA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果有所不同,但差異不明顯。 從表2 可以看出,以1∕2MS 為基本培養(yǎng)基,HT 與TH 的種胚在附加6-BA 0.5 mg∕L 培養(yǎng)基上的發(fā)芽率為53.4%—87.8%,效果最好;而TA 與AT 的種胚在6-BA 質(zhì)量濃度為0.8 mg∕L 時發(fā)芽效果最好,發(fā)芽率為62.2%—56.6%。 對照只有1 粒種子萌發(fā),說明6-BA 在種胚萌發(fā)中起著決定性作用。

表2 不同濃度6-BA 對樹莓種胚發(fā)芽的影響Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA on seed embryo germination of raspberry

2.3 6-BA 與IBA 配合使用對樹莓種胚發(fā)芽的影響

以‘秋來斯’ × ‘如貝’(QR)、‘如貝’ ב秋來斯’(RQ)、‘海爾特茲’ × ‘米克’(HM),‘米克’ × ‘海爾特茲’(MH)的雜交種子為試材,在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5 mg∕L 6-BA 和不同濃度IBA 進(jìn)行培養(yǎng),調(diào)查發(fā)芽率。 從表 3 可以看出,當(dāng) 6-BA 質(zhì)量濃度為 0.5 mg∕L、IBA 為 1.5 mg∕L 時,QR 與 RQ 種胚的發(fā)芽率最高,分別是62.2%、71.2%;而HM 與MH 種胚在IBA 質(zhì)量濃度2.0 mg∕L 時,萌發(fā)率最高,分別是84.4%、88.9%;當(dāng)IBA 為2.5 mg∕L 時,種胚的發(fā)芽率明顯下降,只有26.7%—31.1%。 由此看出,當(dāng)IBA 的濃度增加到一定程度時,抑制了種胚的萌發(fā)。

表3 6-BA 與IBA 配合使用對樹莓種胚發(fā)芽的影響Table 3 Effects of 6-BA combined with IBA on seed embryo germination of raspberry

2.4 不同濃度6-BA 對樹莓試管苗增殖的影響

由表4 可以看出,雜交后代試管苗在 IBA 質(zhì)量濃度為0.1 mg∕L、GA3為 0.5 mg∕L 時,隨著6-BA 濃度增大,其增殖倍數(shù)和生長狀態(tài)呈上升趨勢且生長健壯,當(dāng)達(dá)到一定濃度時,增殖倍數(shù)和生長狀態(tài)有所下降。 HT、TH 與 AT 試管苗在附加 6-BA 0.5 mg∕L 培養(yǎng)基上的增殖倍數(shù)高達(dá) 3.6 倍、4.23 倍與 4.27 倍,且試管苗莖桿粗壯,葉片濃綠,生長健壯。 當(dāng)6-BA 達(dá) 1.5 mg∕L 時,增殖倍數(shù)下降至 1.5 倍、2.07 倍和1.63 倍,且莖桿中等變?nèi)?葉片淡綠至微黃,生長一般或較弱。 而TA 試管苗在附加6-BA 0.8 mg∕L 培養(yǎng)基上的增殖倍數(shù)高達(dá)4.87 倍,且試管苗莖桿粗壯,葉片濃綠,生長健壯。 當(dāng)6-BA 達(dá)1.0 mg∕L 和1.5 mg∕L時,增殖倍數(shù)分別下降至2.7 倍、2.07 倍,且莖桿中等變?nèi)?葉片淡綠至微黃,生長一般或較弱。 6-BA 濃度為0(CK)時,4 個雜交后代試管苗的增殖倍數(shù)為1.2—2 倍,莖桿細(xì)弱,葉片微黃,生長勢較弱。 從表4還可以看出,在同一條件下HT 試管苗的增殖倍數(shù)與生長狀況都不如TH,而TA 試管苗與AT 試管苗沒有明顯差異。

表4 不同濃度6-BA 對樹莓試管苗增殖的影響Table 4 Effects of different concentrations of 6-BA on the proliferation of raspberry plantlets in vitro

2.5 不同濃度IBA 對樹莓試管苗生根的影響

由表5 可以看出,當(dāng) IBA 質(zhì)量濃度為 0.3 mg ∕L 時,雜交后代 QR、WH、HW 的生根率分別達(dá)到93.83%、96.35%、92.09%,顯著高于其他處理與對照,隨著IBA 濃度的加大,生根率不斷降低;而雜交后代RQ 在IBA 為0.2 mg∕L 時生根率最高,達(dá)95.25%,顯著高于其他處理與對照。

表5 不同濃度IBA 對樹莓試管苗生根的影響Table 5 Effects of different concentrations of IBA on rooting of raspberry plantlets in vitro

2.6 田間移栽

移入育苗盤深度0.5 cm,封嚴(yán)根際,隨栽隨澆透水,栽后上搭小拱棚無紡布保濕,上覆75%—80%的遮陽網(wǎng)。 5—7 d 時噴殺菌劑,移栽10—15 d 時,所蓋無紡布可兩側(cè)揭開,定時通風(fēng),并增加光照,光強(qiáng)時仍須遮陽。 此時開始澆施營養(yǎng)液(EC 1.0—1.3 mS∕cm),4—5 d 一次,可采取水肥交替,一周噴1 次保護(hù)性藥劑;移栽15—30 d 時植株開始生長,去掉無紡布及遮陽網(wǎng),全光照,而后水肥4—5 d 一次,營養(yǎng)液EC 1.3—1.5 mS∕cm。 當(dāng)植株生長健壯,新葉3—5 片且葉濃綠,高度1—1.5 cm,根數(shù)20—30 條,根長度1—2 cm 時,可移植到小營養(yǎng)缽中。

3 結(jié)論與討論

樹莓種皮堅(jiān)韌、質(zhì)密、休眠期長,是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素,常規(guī)層積沙藏方法播種出苗率極低(0.6%),最高才1.1%,并費(fèi)時費(fèi)工[11-12]。 目前,濃硫酸處理是解除種皮障礙的主要方法,已有報道中濃度硫酸處理樹莓種子的研究。 王菲等[13]用98%濃硫酸處理15 min 加20%次氯酸鈉處理3 h,供試樹莓種子萌發(fā)率為48.87%。 盧晶晶等[14]用80%硫酸處理澳洲紅種子,最高發(fā)芽率為61.8%。 段修安等[15]用75%硫酸處理8—10 min 后用0.8%尿素浸種34 h,野生樹莓最高發(fā)芽率為58.49%。 濃硫酸與其他試劑配合較常規(guī)播種樹莓種子萌發(fā)率顯著提高,但不同品種及不同組合雜交種子種皮厚度及質(zhì)密程度存在差異,濃硫酸處理時間及濃度的準(zhǔn)確把握難度較大,處理不當(dāng)會導(dǎo)致種胚死亡或種皮炭化不足而起不到解除種皮障礙的目的,存在一定風(fēng)險,從目前的報道看萌發(fā)率并不能滿足育種需求。 組織培養(yǎng)技術(shù)可以打破樹莓種子種皮障礙,在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)種胚快速萌發(fā)、高效成苗和胚挽救,所以,篩選適合樹種的種胚最佳誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基配方是實(shí)現(xiàn)雜交種子萌發(fā)成苗的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)基于樹莓不同品種雜交組合的種子進(jìn)行滅菌及培養(yǎng)基條件優(yōu)化,表明種胚用0.1%升汞滅菌10 min 效果最佳。 在現(xiàn)有報道中,樹莓成熟胚組織培養(yǎng)以1∕2MS 為基本培養(yǎng)基,加蔗糖30 g∕L 及瓊脂4.6 g∕L。 本試驗(yàn)在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加6-BA 和IBA,發(fā)現(xiàn)6-BA 和IBA 濃度對不同組合雜交種子的萌發(fā)率影響稍有差異,其中組合HT 與TH 的雜交種子種胚在添加0.5 mg∕L 6-BA 時的萌發(fā)率最高,分別為53.4%、87.8%,而 TA 與 AT 的種胚在添加0.8 mg∕L 6-BA 時萌發(fā)效果最好,萌發(fā)率分別為62.2%、56.6%。 當(dāng)固定6-BA 為0.5 mg∕L,培養(yǎng)基中添加IBA,種子萌發(fā)率會進(jìn)一步提高,其中0.5 mg∕L 6-BA +1.5 mg∕L IBA 處理的 QR 與 RQ 種胚的萌發(fā)率最高,分別為 62.2%、71.2%,而 HM 與 MH 種胚在0.5 mg∕L 6-BA+2.0 mg∕L IBA 時,萌發(fā)率最高,分別為 84.4%、88.9%。 雜交種子萌發(fā)率顯著提高,說明適當(dāng)濃度的6-BA 和IBA 對樹莓種子萌發(fā)有明顯促進(jìn)作用。

在樹莓常規(guī)增殖培養(yǎng)基中,添加GA3可促進(jìn)組培苗莖和葉生長。 本試驗(yàn)在萌發(fā)培養(yǎng)基MS +蔗糖30 g∕L+ 瓊脂 4.6 g∕L+6-BA(0.5—0.8)mg∕L +IBA 0.1 mg∕L 的基礎(chǔ)上添加 GA30.5 mg∕L,供試 HT、TH與AT 組合試管苗增殖倍數(shù)在3.60—4.27,顯著高于對照,且植株生長健壯,表現(xiàn)為莖桿粗壯、葉片展開、株高增長,可見 GA3在樹莓種胚增殖培養(yǎng)過程中也發(fā)揮著重要作用。 以1∕2MS + 蔗糖15 g∕L + 瓊脂4.3 g∕L 為基本培養(yǎng)基,IBA 增加到0.2—0.3 mg∕L 時,供試材料試管苗生根率均大于90%,最高達(dá)到96.35%,顯著高于對照,可見高濃度IBA 可促進(jìn)樹莓組培苗生根。

綜上所述,針對樹莓雜交種子成熟胚優(yōu)化的誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基可顯著提高樹莓雜交種子成熟胚的萌發(fā)、成苗和生根,為解決樹莓種子萌發(fā)難、萌發(fā)時間長、整齊度差等問題提供了一條新的途徑,為樹莓育種雜交苗培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。