PEG 滲透脅迫條件下26 份花生品種萌發(fā)期抗旱性評價

楊秀麗,寧東賢,趙玉坤,楊麗萍,李 楠

(山西農業(yè)大學小麥研究所,臨汾 041000)

我國是世界上最干旱的國家之一,干旱半干旱面積占國土面積的52.5%,干旱缺水是我國農業(yè)生產面臨的嚴重問題,干旱脅迫給農作物帶來的損失遠大于其他所有逆境損失的總和[1]。 花生(Arachis hypogaeaL.)是較耐旱耐貧瘠的油料和經濟作物之一,也是發(fā)展旱作農業(yè)、充分開發(fā)利用旱薄地資源的理想大田作物。 在國內農作物中,花生種植業(yè)年產值已超過1 000 億元人民幣,居第4 位,排在玉米、水稻、小麥之后,與大宗糧油作物相比,花生初級產品價格較高,單位面積收益率高,可給農民帶來更多的經濟效益[2]。 然而,干旱依然成為花生生產上危害程度較大的逆境因素之一,可引起花生品質下降,種子發(fā)芽率降低,病蟲害增加等,最終導致嚴重減產,所以,挖掘抗旱性強的花生種質成為經濟有效且重要的抗旱措施。

種子萌發(fā)期是作物生長中對逆境反應最為敏感的階段之一,萌發(fā)優(yōu)劣態(tài)勢極大影響作物后期群體的構建,因此,研究干旱條件下花生種子萌發(fā)受到的影響對于篩選耐旱花生種質具有重要意義。 關于不同作物種子萌發(fā)期的抗旱性研究已見諸多報道,且認為種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和根長等與抗旱性密切相關[3-7]。 聚乙二醇(PEG)模擬干旱脅迫的方法具有操作簡單、周期短、效率高且重復性好等優(yōu)勢,被廣泛應用于作物早期抗旱種質資源篩選與鑒定中[8]。 張智猛等[9]利用此法研究花生品種芽期的抗旱性,發(fā)現(xiàn)根長、生根率和根干重與品種抗旱能力呈顯著相關,且證實了17.5% PEG-6000 處理下,花生萌發(fā)期品種間差異最大,該濃度下宜進行干旱脅迫試驗。 大量研究已經證實,作物在遭遇干旱脅迫時,其理化性質會發(fā)生變化,細胞內產生大量自由基,破壞作物體內活性氧代謝平衡,膜脂過氧化終產物丙二醛(MDA)含量增多,同時,作物體內超氧化物歧化酶(SOD)會清除這些自由基,減少生物膜系統(tǒng)的損傷,因此,干旱脅迫下,作物體內MDA 含量和SOD 活性的變化與作物抗旱性之間具有相關性。 本研究利用17.5%的PEG-6000 脅迫液模擬干旱逆境,采用隸屬函數(shù)法對26 個農藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良的花生品種種子萌發(fā)期抗旱性進行綜合研究與評價,并對兩個不同類群花生品種的生理差異進行分析,旨在進一步豐富花生抗旱育種種質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

26 份花生試驗材料均由山西農業(yè)大學小麥研究所花生課題組提供,具體見表1。 所有材料于2019 年10 月花生種質資源圃中獲得。

表1 花生種質及來源Table 1 Peanut germplasm and source

1.2 試驗設計

1.2.1 種子處理與培養(yǎng)方法

剝殼取出花生種仁,每份種質挑選成熟飽滿、大小一致的種子,用75%的酒精消毒后,蒸餾水沖洗干凈并將其浸泡12 h,取出種皮完整的種子,用濾紙吸干種子表面水分,擺放在直徑150 mm、底部墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中,每皿20 粒,加入30 mL 17.5%的PEG-6000 脅迫溶液,對照(CK)以等量蒸餾水代替,重復3 次,置于(28 ±1)℃暗培養(yǎng)箱中。 以放入培養(yǎng)箱時間為調查首日,以后固定時間觀察并記錄發(fā)芽情況,每日更換濾紙,并加入脅迫溶液,保證脅迫強度的穩(wěn)定性[9-10]。

1.2.2 花生苗培養(yǎng)方法

每個品種挑選大小一致、完整飽滿的種子,用75%酒精消毒10 min 后,純水沖凈表面殘留乙醇,再用純水浸泡12 h,置于墊有濾紙的培養(yǎng)盒中,在人工氣候箱中(28 ±1)℃恒溫暗培養(yǎng)5 d。 選取子葉展開較好且長勢一致的材料移入裝有Hoagland 營養(yǎng)液的水培盒中,每個水培盒栽種8 棵苗,每個品種移栽6 盒,3 盒做干旱脅迫處理,3 盒做對照處理,全部置于光照培養(yǎng)箱中,設置光暗周期16 h∕8 h,晝夜溫度26 ℃∕15 ℃,第一片真葉展開時,用17.5%PEG-6000 的Hoagland 營養(yǎng)液做苗期脅迫處理,期間控制脅迫濃度,脅迫處理3 d 后,每兩天定時摘取葉片1 次,用液氮速凍,置于-80 ℃冰箱中保存待測,連續(xù)摘取6 次。

1.2.3 指標測定與方法

胚芽突破種皮,露出3 mm 的白色芽尖為種子發(fā)芽標準。 將第1 粒種子發(fā)芽之日定為該處理發(fā)芽的開始期,以后每隔1 d 定時記錄發(fā)芽種子數(shù),當連續(xù)3 d 不再有種子發(fā)芽時作為發(fā)芽試驗結束期,挑選10粒發(fā)育正常的種子,測定其胚軸長和主根長,胚根伸長長度即胚軸和主根的總長度。 計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根軸比和根長脅迫指數(shù)[11-13]。 各指標計算公式如下:

1.2.4 SOD 活性和 MDA 含量測定

取0.5 g 葉片,放入冰浴的研缽中,分次加入5 mL 的pH 7.8 的磷酸緩沖液(含1%PVP 和0.2 mmol∕L EDTA),研磨,取勻漿至離心管中,12 000 r∕min 離心30 min,移出上清液,用于 SOD 和MDA 含量分析。SOD 活性測定采用氮藍四唑(NBT)還原法,MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與抗旱性評價方法

采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理,利用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計學分析。 采用隸屬函數(shù)方法對各抗旱性指標進行綜合評價[14]。 隸屬函數(shù)值公式為:μ(xj)=(xj-xmin)∕(xmax-xmin) ,j=(1,2,3,…,n)。 式中,μ(xj)為各品種第j個性狀的隸屬函數(shù)值,xj為各品種某一指標性狀的相對值(各指標性狀相對值=干旱脅迫下性狀測定值∕對照處理下性狀測定值),xmax和xmin分別為所有參試品種中第j個指標性狀相對值的最大值和最小值。 采用標準差系數(shù)法確定指標的權重,標準差系數(shù)Pj用公式(1)計算,因子權重系數(shù)Wj用公式(2)計算,抗旱性度量值D用公式(3)計算[15-16]。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫條件下測定指標的方差分析

由表2 可知,不同品種的發(fā)芽率差異不顯著;CK 和17.5% PEG-6000 處理下的發(fā)芽率存在極顯著差異;濃度和品種交互效應下的發(fā)芽率存在顯著差異,即不同品種在17.5% PEG-6000 脅迫處理下的反應是不同的。 發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在各品種之間和不同處理下都存在極顯著差異,說明品種和17.5% PEG-6000 脅迫液對花生發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響均是極顯著的,發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)可以反映各個品種在干旱脅迫處理下的差異性,因此用發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)來評價品種的抗旱性是可行的。

表2 不同處理下26 份材料發(fā)芽指標的方差分析Table 2 Variance analysis of germination indexes of 26 peanuts under different treatments

2.2 干旱脅迫條件下測定指標的變化

從表3 可見,干旱脅迫使得花生萌發(fā)期的生長受到抑制,各指標下降程度大小依次是活力指數(shù)＞發(fā)芽勢＞發(fā)芽率＞發(fā)芽指數(shù),干旱脅迫下胚軸生長受較大抑制,長度縮短,根軸比相應增加。 5 個指標在各品種間較對照處理變異系數(shù)增長倍數(shù)不同,大小依次是發(fā)芽勢＞發(fā)芽率＞發(fā)芽指數(shù)＞根軸比＞活力指數(shù),表明26 個品種的抗旱性之間存在差異。

表3 不同處理下花生萌發(fā)期各指標的變化情況Table 3 Changes of various indexes during germination period under different treatments

2.3 干旱脅迫條件下抗旱性綜合評價

2.3.1 測定指標的相關分析

從表4 可見,除了相對發(fā)芽勢中最大值大于1(1.029)以外,其余4 項指標數(shù)值都小于1,說明26 個品種的這些性狀在干旱脅迫下均受到抑制,但各指標間的變異程度存在差異,變異系數(shù)越大,說明該性狀對干旱脅迫反應越敏感,反之,變異系數(shù)越小,該性狀對干旱脅迫越不敏感,各性狀在干旱脅迫下的敏感程度為X4＞X5＞X2＞X3＞X1。

表4 26 個花生品種萌發(fā)期指標Table 4 Indexes for germination period of 26 peanuts

從表5 可知,種子萌發(fā)期,5 項指標之間均存在顯著或極顯著正相關。 根長脅迫指數(shù)(X5)越大,胚根受抑制作用越不明顯,抗旱能力就越強。 相對發(fā)芽率(X1)、相對發(fā)芽勢(X2)、相對發(fā)芽指數(shù)(X3)、相對活力指數(shù)(X4)均與根長脅迫指數(shù)(X5)呈現(xiàn)顯著或極顯著正相關,其中,相對活力指數(shù)(X4)和根長脅迫指數(shù)(X5)之間相關性最大(相關系數(shù)=0.983)。 這5 項指標均可用來評價花生萌發(fā)期的抗旱性。

表5 26 個花生品種萌發(fā)期測定指標的相關性分析Table 5 Correlation analysis of measuring indexes for germination period of 26 peanuts

2.3.2 花生萌發(fā)期抗旱性的綜合評價

運用隸屬函數(shù)法,以相對發(fā)芽率(X1)、相對發(fā)芽勢(X2)、相對發(fā)芽指數(shù)(X3)、相對活力指數(shù)(X4)和根長脅迫指數(shù)(X5)5 個指標為依據(jù),對26 個花生品種的萌發(fā)期抗旱性進行綜合評價,結果用D值來反映,通常D值越高,表示該品種的抗旱能力越強,反之亦然。 表6 顯示,26 份材料的綜合評價D值變幅范圍為0.119 4—0.973 8,差異較大,‘花育25 號’D值最大,抗旱性最強,‘白珍珠’D值最小,抗旱性最弱。

表6 26 個花生品種抗旱評價指標相對值、隸屬函數(shù)值及綜合評價Table 6 Relative value,membership function value and comprehensive evaluation of drought resistance evaluation index for 26 peanut varieties

2.3.3 花生萌發(fā)期抗旱性的聚類分析

依據(jù)26 份花生供試材料的綜合評價結果,對供試材料進行聚類分析。 在平方歐氏距離為5 處,26 份花生材料分成5 個類群(圖1),第Ⅰ類群包括4 個品種(編號:10、13、25、26),占供試材料總數(shù)的 15.4%,D值變幅范圍在0.763 4—0.973 8,平均值為0.883 6,屬于強抗旱型品種;第Ⅱ類群包括 9 個品種(編號:3、5、12、15、16、19、21、22、23),占供試材料總數(shù)的34.6%,D值變幅范圍在0.502 4—0.700 4,平均值為0.592 6,屬于較抗旱型品種;第Ⅲ類群包括 5 個品種(編號:1、9、17、18、24),占供試材料的19.2%,D值變幅范圍在0.320 7—0.454 5,平均值為0.413 0,屬于弱抗旱型品種;第Ⅳ類群包括6 個品種(編號:4、6、7、8、11、14),占供試材料總數(shù)的 23.1%,D值變幅范圍在0.126 2—0.346 9,平均值為0.215 8,屬于干旱敏感型品種;第Ⅴ類群包括2 個品種(編號:2、20)種,占總試材的7.7%,D值變幅范圍在0.119 4—0.134 2,平均值為0.186 5,屬于干旱高敏感型品種。

圖1 26 份花生品種的萌發(fā)期抗旱性綜合評價聚類分析Fig.1 Clustering analysis diagram of 26 peanut varieties on drought-resistance for germination period

2.4 干旱脅迫下花生幼苗SOD 活性變化

選擇第Ⅰ類群的4 個強抗旱性品種和第Ⅴ類群的2 個干旱高敏感性品種進行生理差異性分析。 圖2 顯示,干旱脅迫后12 d 內,6 個花生品種的SOD 活性總體均呈現(xiàn)上升趨勢,尤其在8—12 d 中,‘花育25’(編號10)、‘開農8 號’(編號 13)、‘晉花 8 號’(編號 25)和‘商花6 號’(編號26)的SOD 活性上升幅度明顯高于之前,而‘白珍珠’(編號2)和‘花育23’(編號20)的SOD 活性上升趨勢相較其他品種明顯緩慢;干旱脅迫12 d 之后,‘白珍珠’(編號 2)、‘花育 25 號’(編號 10)和‘商花6 號’(編號26)的SOD 活性呈現(xiàn)緩慢下降趨勢,‘開農8 號’(編號 13)、‘花育 23’(編號 20)和‘晉花8 號’(編號25)的SOD 活性依然有上升的表現(xiàn),但上升幅度較之前明顯減小。

圖2 不同品種對干旱脅迫反應的SOD 活性變化Fig.2 Changes in SOD activity of different varieties in response to drought stress

從表7 可以看出,隨著干旱脅迫時間增加,各品種間SOD 活性較對照表現(xiàn)出較大的差異。 干旱脅迫4 d,各品種的SOD 活性較對照均有所下降;干旱脅迫6 d,‘花育25 號’和‘晉花8 號’的SOD 活性較對照提高0.6%和4.6%,其余品種仍低于對照;干旱脅迫8 d,除了‘花育23’的SOD 活性略低于對照,其余品種相比對照均有所增加;干旱脅迫10—14 d 內,所有品種SOD 活性較對照均有所增加,但增幅存在差異,總體呈現(xiàn)強抗旱型品種‘開農8 號’、‘晉花8 號’、 ‘花育25 號’和‘商花6 號’的SOD 活性與對照相比增幅明顯,而干旱高敏感型品種‘白珍珠’和‘花育23 號’的增幅相對較小。

表7 干旱脅迫下不同品種SOD 活性變化情況Table 7 Changes of SOD activity of different varieties under drought stress

2.5 干旱脅迫下花生幼苗MDA 動態(tài)變化

花生幼苗受到干旱脅迫后,體內的活性氧自由基累積并引發(fā)膜脂過氧化反應,丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的主要產物之一。 圖3 顯示,干旱脅迫下,第Ⅰ類群和第Ⅴ類群的6 個品種幼苗期的MDA 含量均呈上升趨勢,而且在干旱脅迫4—10 d 內的MDA 累積速度最快,干旱脅迫10—14 d,除了‘白珍珠’MDA累積速度仍然很快外,其他品種累積速度變得緩慢。 干旱敏感型的2 個品種(‘白珍珠’和‘花育23 號’)MDA 含量整體高于抗旱型強的4 個品種(‘開農8 號’、‘晉花 8 號’、‘花育25 號’和‘商花 6 號’),說明干旱脅迫下,強抗旱型品種的幼苗膜脂過氧化程度小于干旱敏感型品種,可以更快抵御和適應干旱環(huán)境。

圖3 不同品種對干旱脅迫反應的MDA 含量變化Fig.3 Changes of MDA content in different varieties in response to drought stress

3 結論與討論

3.1 PEG-6000 干旱脅迫與抗旱鑒定

不同環(huán)境逆境對作物生長發(fā)育的影響程度不同,其中,作物對干旱逆境的反應最大,而且,作物不同生長階段對干旱脅迫的反應存在差異,相對于其他生長時期,于作物萌發(fā)期進行抗旱性鑒定具有耗時短、重復性好、環(huán)境影響小等優(yōu)勢。 前人在小麥、玉米、大豆、綠豆、水稻和番茄等作物的萌發(fā)期都進行了抗旱性研究[4,6-7,17-20]。

目前,室內PEG 模擬干旱脅迫法是花生萌發(fā)期抗旱性鑒定與評價最常用的方法。 PEG 是一種高分子滲透劑,其濃度達到一定程度時會使植物組織和細胞處于類似干旱脅迫中。 不同作物萌發(fā)期抗旱鑒定的適宜脅迫濃度是不同的[19-20],張智猛等[21]發(fā)現(xiàn),17.5%PEG-6000 脅迫條件下不同花生品種間萌發(fā)期情況差異最大,是進行干旱脅迫模擬的適宜濃度。 本研究在預備試驗中采用了10% 和20% 的PEG-6000 處理花生種子,發(fā)現(xiàn)10%濃度處理下,種子萌發(fā)未被抑制,發(fā)芽率基本是100%,胚軸和胚根的伸長生長受抑制作用小,較對照差異不明顯,而20% 濃度處理下,絕大多數(shù)的種子萌發(fā)受到嚴重抑制作用,甚至不萌發(fā),因此,本研究運用17.5% PEG-6000 處理26 份供試材料,結果顯示,此濃度下各品種間不同評價指標值的差異性顯著,可以有效評價品種間抗旱性差異。

3.2 花生抗旱性鑒定指標的綜合評價

不同花生品種對干旱脅迫的響應不同,本研究用不同指標的相對值分析抗旱性差異,減少了品種間固有差異的影響,可以更準確評判品種的抗旱性,另外,指標相對值的比較和分析也更具有科學性[22]。 本試驗依據(jù)綜合評價D值,通過聚類分析將26 份材料歸納為5 類群,‘花育25 號’、‘開農8 號’、‘晉花8號’和‘商花 6 號’是強抗旱型品種;‘臨花8 號’、‘花育27 號’、‘963’、‘唐 8252’、‘抗3’、‘8130’、‘山花9 號’、‘開農 69’和‘海高’是較抗旱型品種;‘白沙1016’、‘山花12 號’、‘濰花13 號’、‘豐花1 號’和‘魯花11 號’是弱抗旱型品種;‘魯花14 號’、‘易花 13 號’、‘錦花 10 號’、‘桂花 30’、‘粵油 256’和‘豐花 6號’是干旱敏感性品種;‘白珍珠’和‘花育23 號’是干旱高敏感性品種。 從劃分結果可以看出類群間或類群內的遠近關系,為后續(xù)科學合理地對種質資源開展研究和利用奠定基礎。

3.3 干旱脅迫下SOD 活性和MDA 含量的變化

PEG-6000 模擬干旱脅迫逆境初期,花生幼苗葉片的SOD 活性低于對照,隨著脅迫時間推移,SOD 活性逐漸升高,但不同品種間存在差異,強抗旱性的花生品種較對照增幅明顯,而干旱敏感型品種較對照增幅較小;MDA 是植物體內膜脂過氧化的主要產物之一,當花生在干旱脅迫環(huán)境下生長時,幼苗體內開始積累,但不同品種的MDA 累積含量隨著脅迫時間的不同存在一定差異,干旱敏感型的2 個品種的MDA 累積含量總體高于其他抗旱型品種,在干旱逆境中,其體內細胞受傷害程度較高,幼苗期生長受到較大影響。 通過在逆境下對花生生理指標進行測定,可以驗證抗旱性綜合評價結果的有效性,同時也可作為花生抗旱性篩選的依據(jù)。

花生抗旱性是一個相當復雜的生理生化過程,是受多基因控制且復雜的生物學表現(xiàn)。 花生不同生長發(fā)育階段的抗旱性因干旱脅迫程度和持續(xù)時間的變化呈現(xiàn)出差異,本試驗從大量試驗材料中快速篩選抗旱性材料,然而鑒定結果無法詮釋其整個生育期的抗旱性,需在其他生育期進一步研究驗證。