LncRNA KCNQ1OT1通過調(diào)控miR-506-3p表達調(diào)節(jié)喉鱗狀細胞癌細胞的生物學行為

伊紀亮，鄭娟，張萍

喉鱗狀細胞癌，簡稱喉鱗癌，是發(fā)病率呈增長趨勢的耳鼻喉科常見惡性腫瘤［1］，其治療主要有手術、化療和放療，但療效一直不佳［2］。因此，需要尋找新的治療喉鱗癌的新方法。KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1（KCNQ1OT1）是一種在乳腺癌和舌癌中表達上調(diào)的長鏈非編碼RNA（lncRNA），其分別通過靶向miR-145∕細胞周期蛋白E2（CCNE2）、miR-211-5p∕Ezrin軸促進乳腺癌和舌癌的發(fā)展進程［3-4］。此外，對奧沙利鉑耐藥的肝細胞癌細胞中KCNQ1OT1表達升高，敲減KCNQ1OT1可通過靶向miR-7-5p∕ATP結合盒轉(zhuǎn)運體亞家族C成員1（ABCC1）軸降低肝細胞癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性，KCNQ1OT1可作為改善肝細胞癌奧沙利鉑耐藥的分子靶點［5］。然而，KCNQ1OT1對喉鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，KCNQ1OT1可能調(diào)控miR-506-3p的表達。miR-506是喉鱗癌細胞系中表達降低的微小RNA（miRNA），過表達miR-506可增強喉鱗癌細胞的放射敏感性［6］。本研究于2019年5月至2020年2月，首先采用RT-qPCR法檢測了45例喉鱗癌患者的癌組織及癌旁組織中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達；同時以人胚肺成纖維細胞WI-38為對照，采用RT-qPCR法檢測了喉鱗癌細胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達；最后，以喉鱗癌細胞系HCC345為研究對象，主要探討了KCNQ1OT1能否靶向miR-506-3p調(diào)控HCC345細胞的惡性生物學行為，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料喉鱗癌組織及癌旁組織采集自2016年5月至2018年1月于山東大學齊魯醫(yī)院桓臺分院確診并行手術治療的45例原發(fā)喉鱗癌病人，液氮保存。男29例，女16例，年齡（56.39±8.47）歲。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》原則，病人自愿簽署知情同意書。

1.2 實驗細胞和試劑人胚肺成纖維細胞WI-38，上海研生實業(yè)有限公司；喉鱗癌細胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345，中國科學院上海細胞庫；LipofectamineTM2000試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）∕碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶；PCR實驗相關試劑盒，大連寶生物；引物序列、KCNQ1OT1小干擾RNA（si-KCNQ1OT1）及陰性序列（si-NC）、miR-506-3p模擬物（mimics）和抑制劑（anti-miR-506-3p）、模擬對照序列（miR-NC）及抑制劑陰性序列（anti-miR-NC），廣州銳博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng)WI-38、EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345細胞均用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種對數(shù)期各細胞至6孔板（1.0×105個∕孔），培養(yǎng)24 h，收集細胞檢測細胞中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達。

1.3.2RT-qPCR實驗在獲得的樣本組織及細胞中加Trizol試劑，提取總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行PCR反應。引物序列：KCNQ1OT1正向5'-TGG TAA GTT ACA GGG CAG GG-3'，反向5'-TGA ACA TCC ATC CCC AAG CT-3'；GAPDH正 向5'-ACA TCG CTC AGA CAC CAT GG-3'，反向5'-GTA GTT GAG GTC AAT GAA GGG-3'；miR-506-3p正向5'-ACC ACC ATC AGC CAT ACT ATG T-3'，反向5'-TGT TGC ACA TTA CTC TAC TCA GA-3'；U6正向5'-CGT CGA CGT GCA TGC ACG-3'，反向5'-GCT TAA GCT AGC TAG CGC-3'。用2-ΔΔCt法計算KCNQ1OT1相對GAPDH、miR-506-3p相對U6的表達。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染接種對數(shù)期HCC345細胞至6孔板（1.0×105個∕孔），培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1（si-KCNQ1OT1組）、（si-NC組）、或共轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1與anti-miR-506-3p（si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-3p組）、si-KCNQ1OT1與anti-miR-NC（si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組）至HCC345細胞。轉(zhuǎn)染后，檢測細胞中KCNQ1OT1和miR-506-3p表達，驗證轉(zhuǎn)染效果后，將細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.4MTT實驗于96孔板中將轉(zhuǎn)染后的四組細胞均培養(yǎng)24 h，各組細胞起始數(shù)量均為2.5×104個∕孔。培養(yǎng)后，加20 μL MTT（5 g∕L）將細胞孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加150 μL二甲基亞砜，振蕩混勻，于酶標儀490 nm處測定吸光度（A）值。

1.3.5流式細胞儀檢測細胞凋亡于24孔板中將轉(zhuǎn)染后的四組細胞均培養(yǎng)24 h，各組細胞起始數(shù)量均為5.0×104個∕孔。培養(yǎng)后，收集各組細胞，利用Annexin V-FITC∕PI試劑盒檢測細胞凋亡。

1.3.6Transwell實驗遷移實驗：于Transwell上室接種各組細胞，起始數(shù)量均為5.0×104個∕孔。下室加500 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，取出上室，將下室細胞進行固定和染色處理后，于顯微鏡下觀察，計數(shù)。侵襲實驗：除預先在Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠外，操作同遷移實驗。

1.3.7KCNQ1OT1與miR-506-3p靶向關系驗證由上海生工構建含miR-506-3p結合位點的KCNQ1OT1野生型熒光素酶報告載體（KCNQ1OT1-WT），同時突變結合位點，構建KCNQ1OT1突變型熒光素酶報告載體（KCNQ1OT1-MUT）。接種對數(shù)期HCC345細胞至6孔板（1.0×105個∕孔），培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別共轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimics（或miR-NC）與KCNQ1OT1-WT（或KCNQ1OT1-MUT）至HCC345細胞。轉(zhuǎn)染后，收集細胞并裂解。用半徑10 cm離心機行離心（3 500 r∕min、10 min）處理后，取20 μL上清液，加100 μL 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應工作液，檢測螢火蟲和海腎的熒光強度。細胞熒光素酶活性以螢火蟲與海腎熒光強度的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學方法SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。組織和細胞系中KCNQ1OT1和miR-506-3p的表達、各組細胞活力、凋亡率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)及熒光素酶活性均符合正態(tài)分布，用±s表示。用獨立樣本t檢驗對兩組間各實驗數(shù)據(jù)進行比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗

2.1 KCNQ1OT1在喉鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達情況喉鱗狀細胞癌組織中KCNQ1OT1表達量 為0.81±0.09，較 癌 旁 組 織0.27±0.08升 高（t=30.08，P＜0.05）；喉鱗狀細胞癌組織中miR-506-3p表達量為0.24±0.08，較癌旁組織0.83±0.09降低（t=14.70，P＜0.05）。喉鱗狀細胞癌細胞系EV-SCC-18、AMC-HN-8和HCC345中KCNQ1OT1表達量分別為2.44±0.22、2.69±0.21、3.61±0.24、較WI-38細胞1.00±0.13均升高（P＜0.05）；miR-506-3p表達分別為0.41±0.13、0.30±0.12、0.22±0.11，較WI-38細胞1.00±0.12均降低（P＜0.05）。選擇KCNQ1OT1和miR-506-3p表達較WI-38細胞差異最顯著的喉鱗癌細胞系HCC345進行后續(xù)實驗。

2.2 敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞增殖和凋亡的影響KCNQ1OT1在si-NC組 和si-KCNQ1OT1組HCC345細胞中的表達量分別為0.61±0.16、0.14±0.05，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（t=8.41，P＜0.05），說明si-KCNQ1OT1組HCC345細胞中KCNQ1OT1表達較si-NC組被敲減。si-KCNQ1OT1組HCC345細胞活力為0.41±0.06，較si-NC組細胞活力0.81±0.12降低（t=8.94，P＜0.05）。si-KCNQ1OT1組HCC345細胞凋亡率為（34.13±3.60）%，較si-NC組細胞凋亡率（3.79±2.37）%升高（t=21.12，P＜0.05）。見圖1。

圖1 敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞凋亡的影響

2.3 敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞遷移和侵襲的影響si-KCNQ1OT1組HCC345細胞遷移數(shù)低于si-NC組［（86.32±15.21）個比（162.31±20.23）個，t=9.01，P＜0.05］，侵襲數(shù)低于si-NC組［（65.23±12.05）個比（140.26±18.27）個，t=10.29，P＜0.05］。見圖2。

圖2 敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞遷移和侵襲的影響

2.4 KCNQ1OT1靶向調(diào)控miR-506-3p表達生物信息學軟件預測顯示的KCNQ1OT1與miR-506-3p的核苷酸序列的連續(xù)結合位點見圖3。共轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimics與KCNQ1OT1-WT的HCC345細胞熒光素酶活性為0.36±0.14，較共轉(zhuǎn)染miR-NC與KCNQ1OT1-WT的HCC345細胞熒光素酶活性1.00±0.13降 低（t=10.05，P＜0.05）；共 轉(zhuǎn) 染miR-506-3p mimics與KCNQ1OT1-MUT、miR-NC與KCNQ1OT1-MUT的HCC345細胞熒光素酶活性為1.02±0.12、1.03±0.17，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.16，P=0.87）。同時miR-506-3p在si-KCNQ1OT1組HCC345細胞中的表達量為3.34±0.21，顯著高于si-NC組1.00±0.16（t=26.59，P＜0.05）。

圖3 KCNQ1OT1與miR-506-3p的結合位點

2.5 敲減miR-506-3p逆轉(zhuǎn)了敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞增殖和凋亡的影響miR-506-5p在KCNQ1OT1+anti-miR-NC組和si-KCNQ1OT1+antimiR-506-5p組HCC345細胞中的表達量分別為1.00±0.09、0.25±0.06，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（t=20.80，P＜0.05），說明si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組HCC345細胞中miR-506-5p表達較KCNQ1OT1+anti-miR-NC組被敲減。si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組HCC345細胞活力為0.82±0.11，較si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組細胞活力0.43±0.05升高（t=9.68，P＜0.05）；si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組 細 胞 凋 亡 率 為（5.32±1.85）%，較si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組細胞凋亡率（30.25±3.48）%降低（t=18.98，P＜0.05）。見圖4。

圖4 敲減miR-506-3p和敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞凋亡的影響

2.6 敲減miR-506-3p表達逆轉(zhuǎn)了敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞遷移和侵襲的影響si-KCNQ1OT1+anti-miR-506-5p組細胞遷移數(shù)高于si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組［（158.26±19.24）個 比（88.31±15.39）個，t=8.52，P＜0.05］，侵襲數(shù)高于si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組［（138.25±19.05）個 比（66.27±12.39）個，t=9.50，P＜0.05］。見圖5。

圖5 敲減miR-506-3p和敲減KCNQ1OT1對HCC345細胞遷移和侵襲的影響

3 討論

lncRNA在真核生物中廣泛存在，其可發(fā)揮miRNA分子海綿作用的表達調(diào)控miRNA靶基因的表達，共同影響腫瘤的發(fā)展進程。例如，LncRNA CASC2是肝癌組織中表達降低的lncRNA，過表達lncRNA CASC2可競爭性吸附miR-24-3p阻礙肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡［7］。既往研究顯示，喉鱗癌也存在大量異常表達的lncRNA，如lncRNA CCAT2［8］、lncRNA FGD5-AS1［9］、LncRNA FEZF1-AS1［10］等lncRNA在喉鱗癌中表達升高，促進喉鱗癌的發(fā)展進程；lncRNA GAS5是喉鱗癌中表達下調(diào)的lncRNA，過表達lncRNA GAS5通過靶向調(diào)節(jié)miR-26a-5p∕UNC-51樣激酶2（ULK2）軸抑制喉鱗癌細胞的惡性行為［11］。

KCNQ1OT1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在多種惡性腫瘤中起調(diào)控作用。報道稱，KCNQ1OT1在非小細胞肺癌組織中呈高表達，且其表達與病人TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移及預后密切相關，參與非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展［12］；敲減KCNQ1OT1可降低卵巢癌細胞的增殖和遷移能力，KCNQ1OT1是卵巢癌治療的潛在靶點［13］；KCNQ1OT1通過調(diào)節(jié)miR-296-5p∕缺氧上調(diào)蛋白（HYOU1）軸促進宮頸癌細胞的惡性行為并促進腫瘤生長［14］；KCNQ1OT1在順鉑的結直腸癌細胞中表達上調(diào)，下調(diào)KCNQ1OT1通過靶向miR-497進而抑制B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的表達降低結直腸癌細胞對順鉑的耐藥性，KCNQ1OT1是改善結直腸癌順鉑耐藥的潛在分子靶點［15］。本研究結果顯示，KCNQ1OT1在喉鱗癌組織及細胞系中均表達增加，敲減KCNQ1OT1造成了喉鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲受到抑制，而凋亡加劇，這提示敲減KCNQ1OT1有利于延緩喉鱗癌的發(fā)展進程，KCNQ1OT1也可能成為喉鱗癌治療的新靶點。

此外，本研究首先證實了KCNQ1OT1結合并負調(diào)控miR-506-3p。miR-506-3p是前列腺癌細胞中表達降低的miRNA，上調(diào)miR-506-3p對前列腺癌細胞的惡性行為起抑制作用［16］；miR-506-3p在骨肉瘤中也發(fā)揮抑癌基因作用，其通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達削弱骨肉瘤細胞的增殖和遷移行性，阻礙骨肉瘤的發(fā)展進程［17］；miR-506-3p通過靶向抑制zeste 2多梳抑制復合物2亞基增強子（EZH2）的表達阻礙結直腸癌的發(fā)展進程［18］；miR-506-3p表達的上調(diào)可阻礙肝癌細胞增殖［19］。本研究顯示，喉鱗癌組織及細胞系中miR-506-3p的表達明顯降低，與Tang等［6］報道結果一致；同時，本研究恢復實驗數(shù)據(jù)顯示，敲減miR-506-3p逆轉(zhuǎn)了敲減KCNQ1OT1表達對HCC345細胞惡性行為的影響，這提示KCNQ1OT1通過靶向負調(diào)控miR-506-3p來影響喉鱗癌細胞的惡性行為。

綜上所述，KCNQ1OT1在喉鱗癌組織及細胞系中KCNQ1OT1呈高表達，敲減KCNQ1OT1導致喉鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲受到抑制，而凋亡加劇，這可能與敲減KCNQ1OT1引起細胞中miR-506-3p表達上調(diào)有關，KCNQ1OT1∕miR-506-3p軸可能為喉鱗狀細胞癌的治療提供了新靶點，但KCNQ1OT1作用的miR-506-3p的靶基因還有待進一步探究。