花生四烯酸12-脂氧化酶-12-氫基二十碳四烯酸-GPR31軸在肝臟再灌注肝缺血損傷中的作用

2022-01-04 08:09:56高楊張升寧李來(lái)邦冉江華

安徽醫(yī)藥 2022年1期

高楊，張升寧，李來(lái)邦，冉江華

隨著移植科學(xué)的快速發(fā)展，器官移植已成為器質(zhì)性終末期病人唯一決定性且有效的治療手段［1］。其中，移植組織的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion，IR）是器官移植中不可避免的后果［2］。IR相關(guān)的組織損傷占早期移植失敗的10%，是導(dǎo)致器官排斥和肝功能損害的主要原因［3］。不僅是器官移植手術(shù)，肝臟再灌注肝缺血損傷多發(fā)于缺血性休克及多種肝臟外科手術(shù)中，是影響肝移植和肝臟葉段切除術(shù)后肝功能的一個(gè)多因素過(guò)程［4］。肝臟組織長(zhǎng)時(shí)間缺血會(huì)產(chǎn)生由活性氧簇產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞活化等導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞凋亡和損傷過(guò)程［5］。再灌注后，會(huì)進(jìn)一步加重肝臟組織細(xì)胞的代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞。組織損傷進(jìn)一步加重，甚至導(dǎo)致肝臟的功能衰竭，嚴(yán)重威脅了病人生命［6］。目前為止，還沒(méi)有有效的藥物干預(yù)治療肝IR損傷，缺血預(yù)處理是唯一有希望的改善預(yù)后的策略［7］。然而，預(yù)處理的有益效果僅限于一部分年輕病人，例如能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的血流阻斷且肝臟體積較?。?］。由于肝臟缺血損傷的致病模式涉及缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和再灌注引起的炎癥反應(yīng)的雙相過(guò)程［9］。因此，對(duì)于肝臟再灌注肝缺血損傷，需要開(kāi)發(fā)有直接抗炎和抗凋亡兩種特性的藥物，目前并未發(fā)現(xiàn)能夠有效實(shí)現(xiàn)這種臨床作用的有效藥物［10］。因此，需要更深入的了解這種致病過(guò)程的基本機(jī)制。本研究自2019年2―6月采用肝臟再灌注肝缺血損傷小鼠模型，通過(guò)基因敲除手段阻斷12-氫基二十碳四烯酸（HETE），觀察其對(duì)肝臟再灌注肝缺血損傷中的改善作用。從而為花生四烯酸12-脂氧化酶（ALOX12）-12-HETE-GPR31軸在肝臟再灌注肝缺血損傷臨床治療中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 小鼠模型構(gòu)建8周齡雄性B6.Cg-Tg（MX1-cre）Cgn∕J小鼠（Joint Ventures Sipper BK）36只，體質(zhì)量（23±3）g，購(gòu)自昆明市第一人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)中充分保證動(dòng)物福利、給予動(dòng)物人道關(guān)懷，動(dòng)物處置也符合倫理學(xué)原則。小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各12只。所有小鼠禁食12 h后，采用5 mL∕kg的25%（V∕V）烏拉坦進(jìn)行腹腔注射麻醉。（1）實(shí)驗(yàn)組：小鼠進(jìn)行基于胚胎干細(xì)胞的基因打靶技術(shù)制備基因敲除手術(shù)：①訂購(gòu)課題BAC菌；②完成打靶載體設(shè)計(jì)和構(gòu)建；③將重組載體電轉(zhuǎn)到胚胎干細(xì)胞中，用G418篩選轉(zhuǎn)染后的胚胎干細(xì)胞得到陽(yáng)性克?。虎芡ㄟ^(guò)PCR和southern blot雜交技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆，得到穩(wěn)定整合外源基因的胚胎干細(xì)胞；⑤將胚胎干細(xì)胞陽(yáng)性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)；⑥獲得F1陽(yáng)性雜合子小鼠。進(jìn)行肝血流阻斷。肝血流阻斷45 min后發(fā)送移走血管夾，以恢復(fù)血液供應(yīng)。（2）實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：進(jìn)行肝血流阻斷。（3）空白對(duì)照組：同樣進(jìn)行開(kāi)腹但并不進(jìn)行肝血流阻斷。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）采用Trizol抽提法提取采集小鼠組織的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司）說(shuō)明書(shū)合成cDNA。隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，RT-PCR方法參照TAKARA公司的SybergreenI mix試劑盒。RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×賽柏格林（Sybergreen）預(yù)混液10 μL，校正染料0.3 μL，cDNA 1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，加水至20 μL。采用ABI公司的7300型Real-Time PCR儀進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃15 s，58℃15 s，72℃15 s，共35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增反應(yīng)完成后又進(jìn)行了溶解曲線的制作，確保擴(kuò)增的特異性。

1.3 炎性因子水平和12-HETE積累檢測(cè)采用ELISA法分別檢測(cè)肝臟血清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNFα）三項(xiàng)炎性因子水平和12-HETE積累。檢測(cè)均按照試劑盒檢測(cè)方法進(jìn)行，試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.4 采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)ALOX12-12-HETE-GPR31軸中基因編碼蛋白表達(dá)水平勻漿器裂解組織，置于冰上冷卻30 min后，采用離心機(jī)13 000 r∕min離心10 min，取上清。上清移至96孔板中，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。采用SDS變性蛋白質(zhì)電泳法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。采用9%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。三明治法正確放置凝膠和PVDF，70 V電壓轉(zhuǎn)移3～4 h［11］。取出后，將PVDF膜浸入封閉液中，37℃平緩搖動(dòng)1 h。取出后，將PVDF膜浸入雜交袋中，袋中含5 mL相應(yīng)I抗，4℃平緩搖動(dòng)過(guò)夜。取出后采用TBS∕T漂洗干凈，然后浸入含5 mLⅡ抗的雜交袋中，37℃平緩搖動(dòng)1 h。再經(jīng)TBS∕T充分漂洗后，ECL化學(xué)發(fā)光及膠片曝光對(duì)比結(jié)果。

1.5 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定采用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。采用4%多聚甲醛固定1 h后，使用3%過(guò)氧化氫溶液和預(yù)冷處理的蛋白酶K處理，然后于37℃濕盒dUTP標(biāo)記2 h。SABC鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶結(jié)合，DAB顯色。染色后，細(xì)胞核呈棕黃色的細(xì)胞被判為凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)為（凋亡細(xì)胞數(shù)∕總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 肝功能指標(biāo)檢測(cè)清晨用真空管取空腹靜脈血，分離血清，采用日立7180全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能各項(xiàng)指標(biāo)，試劑由上?？迫A生物技術(shù)有限公司提供。肝功能檢查指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、AST∕ALT。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件（美國(guó)IBM公司）處理；計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠ALOX12、12-HETE和GPR31基因編碼蛋白表達(dá)量比較空白對(duì)照組小鼠再灌注后1 h、3 h和6 h的ALOX12基因表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，即肝臟再灌注肝缺血損傷小鼠的ALOX12基因在不同再灌注時(shí)間的表達(dá)量高于空白對(duì)照組小鼠（P＜0.05），且隨著灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大（P＜0.05）。ALOX12基因敲除的實(shí)驗(yàn)組小鼠，ALOX12基因表達(dá)量再灌注后1 h、3 h和6 h降低（P＜0.05），與空白對(duì)照組基因表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1、圖1。