顆粒蛋白前體衍生物Atsttrin對骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用及對CD+4T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

彭侃，魯超，胡守業(yè)，井文森，王波

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜炎、軟骨下骨硬化和骨贅形成為特征的關(guān)節(jié)疾病。目前，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但據(jù)報道腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中發(fā)揮重要作用［1］。其他研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α水平異常升高，并且TNF-α的水平與疾病進(jìn)展有關(guān)［2］。此外，抗TNF-α藥物在各種骨關(guān)節(jié)炎模型以及臨床試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較好的預(yù)防和治療作用［3］。顆粒蛋白前體（PGRN）是一種生長因子，具有獨(dú)特的“串珠”結(jié)構(gòu)［4］。PGRN參與許多病理生理過程，包括抗炎、組織修復(fù)和傷口愈合［5-6］。此外，PGRN還是調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育和降解的生長因子。PGRN通過與腫瘤壞死因子受體（TNFRs）結(jié)合在多種炎癥性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中發(fā)揮作用［7-8］。

Atsttrin是一種PGRN衍生工程蛋白，該分子由PGRN的F+A+C三個片段組成，該蛋白具有比PGRN更強(qiáng)的結(jié)合腫瘤壞死因子受體（TNFR）（如TNFR1和TNFR2）的能力，并且半衰期更長（約120 h）［9］。因此，Atsttrin是一種靶向TNFR的TNF∕TNFR信號拮抗劑［10］。據(jù)報道，在炎癥性關(guān)節(jié)炎動物模型中，Atsttrin具有比PGRN更強(qiáng)的治療作用［3］。

CD+4T細(xì)胞亞群在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中發(fā)揮重要功能［11］。其中，Th1∕Th2細(xì)胞、Th17∕調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的比例失衡可對機(jī)體產(chǎn)生免疫損害，并且是包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵因素。本研究建立了骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并考察了PGRN衍生物Atsttrin對骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)機(jī)制，以及對CD+4T細(xì)胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本研究起止時間為2018年10月至2019年12月，60只5周齡SD雄性大鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心［SYXK（陜）2018-001］；大鼠飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司；Atsttrin由艾美捷科技有限公司合成；番紅O固綠染色試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司；干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）ELISA試劑盒購自美國R&D公司；異硫氰酸熒光素（FITC）抗CD4、PE抗IFNγ、藻紅蛋白（PE）抗IL-4、PE抗IL-17、FITC抗CD4、PE抗CD25、PE抗叉頭盒P3（Foxp3）抗體購自美國Biolegend公司；膠原酶Ⅱ購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；BrdU細(xì)胞增殖測定試劑盒購自Merck Millipore公司；膠原酶、胎牛血清購自美國Gibco BRL公司；RNeasy試劑盒購自德國Qiagen公司；RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；解聚蛋白樣金屬蛋白酶-4（ADAMTS-4）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、IL-4、IL-17、IFN-γ、TGF-β和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔∕小鼠免疫球蛋白二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購自上海喬羽生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物及分組60只5周齡SD雄性大鼠的體質(zhì)量為230～280 g。將大鼠飼養(yǎng)在25℃、55%相對濕度、12 h光照∕黑暗循環(huán)照明的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水，不限制飲食和飲水。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、骨關(guān)節(jié)炎模型組和Atsttrin組，每組20只。

1.2.2骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立采用膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶橫斷法建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型。將大鼠用10%水合氯醛（4 mL∕kg）麻醉。大鼠仰臥固定，脫毛消毒后內(nèi)側(cè)髕骨切口暴露右膝關(guān)節(jié)腔并切斷前交叉韌帶，然后將切口逐層縫合。術(shù)后每天注射20 000 U青霉素抗感染1周。模型組和Atsttrin組大鼠進(jìn)行建模，假手術(shù)組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)操作但未切斷前交叉韌帶。術(shù)后4周，各組中隨機(jī)選取3只大鼠通過病理學(xué)觀察模型是否建立成功。

1.2.3給藥大鼠麻醉后，Atsttrin組大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射15 μL Atsttrin（1 μg∕μL），每周注射1次，連續(xù)注射4周。假手術(shù)組和模型組大鼠注射等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中允許大鼠自由進(jìn)食，最后一次給藥2 h后，從大鼠腹主動脈采血5 mL，4 000 r∕min立即離心15 min，分離血清并置于4℃冰箱保存。處死大鼠后分離右膝關(guān)節(jié)組織并儲存在-20℃冰箱。

1.2.4膝關(guān)節(jié)的組織學(xué)檢查將大鼠膝關(guān)節(jié)組織用10%多聚甲醛固定，20%的EDTA溶液脫鈣。然后將膝關(guān)節(jié)組織在梯度乙醇中脫水，二甲苯中透明，石蠟包埋后切成4.0 μm切片。使用番紅O固綠染色試劑盒對切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下（×20）觀察組織學(xué)變化。采用OARSI評分系統(tǒng)評價軟骨退化情況。

1.2.5ELISA測定和CD+4T細(xì)胞亞群分析按照說明書，使用IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β ELISA試劑盒通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定大鼠血清樣品中細(xì)胞因子濃度。使用FITC抗CD4、PE抗IFN-γ、PE抗IL-4、PE抗IL-17對Th1、Th2和Th17進(jìn)行流式細(xì)胞分析。為了分析Treg細(xì)胞，將Treg細(xì)胞用FITC抗CD4和PE抗CD25染色標(biāo)記，然后與PE抗Foxp3一起孵育。

1.2.6滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)切碎大鼠滑膜組織，用0.2%膠原酶Ⅱ消化3 h。200目篩過濾并收集濾液，1 500 r∕min離心15 min，上清液中加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基并在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h更換1次培養(yǎng)基。融合度達(dá)到約80%時將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將滑膜細(xì)胞分別分成五組，第一組正常培養(yǎng)48 h，第二組組使用TNF-α處理滑膜細(xì)胞48 h，TNF-α終濃度為10 μg∕L。其他三組分別使用終濃度為10 μg∕L、20 μg∕L、50 μg∕L的Atsttrin以及10 μg∕L的TNF-α處理48 h。

1.2.7軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)從大鼠膝關(guān)節(jié)處收集關(guān)節(jié)軟骨，PBS沖洗并切成小塊，在0.1%膠原酶中孵育3 h。將大鼠軟骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳。融合度達(dá)到約80%時將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將軟骨細(xì)胞用完全培養(yǎng)基洗滌3次，無血清培養(yǎng)基孵育過夜。

將軟骨細(xì)胞分成五組，第一組正常培養(yǎng)48 h，第二組使用TNF-α處理滑膜細(xì)胞48 h，TNF-α終濃度為10 μg∕L。其他三組分別使用終濃度為10 μg∕L、20 μg∕L、50 μg∕L的Atsttrin以及10 μg∕L的TNF-α處理48 h。

1.2.8滑膜細(xì)胞和軟骨增殖測定按照說明書，通過5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）細(xì)胞增殖測定試劑盒檢測滑膜或軟骨細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.9RT-PCR使用RNeasy試劑盒（Qiagen）從培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中提取總RNA，并使用ImProm-Ⅱ反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物序列（表1），將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)部對照GAPDH。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

表1 引物序列信息

1.2.10蛋白質(zhì)印跡法使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并離心。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。從軟骨細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)在8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜在3%牛血清白蛋白中封閉。洗滌3次后，將膜與ADAMTS-4（1∶500稀釋）、MMP-13（1∶500稀釋）、IL-4（1∶1 000稀釋）、IL-17（1∶1 000稀釋）、IFN-γ（1∶1 000稀釋）、TGF-β（1∶500稀釋）和GAPDH（1∶500稀釋）4℃過夜孵育。然后將膜與HRP標(biāo)記的抗兔∕小鼠免疫球蛋白二抗在25℃下孵育1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒進(jìn)行顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中結(jié)果表示為±s，統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 17.0。組間比較通過t檢驗(yàn)或單因素方差分析及LSD法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Atsttrin減輕骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)組織病變各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織番紅O固綠染色顯示見圖1。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織（番紅O固綠染色×20）

假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)組織未見明顯番紅O失染現(xiàn)象，關(guān)節(jié)表面光滑，軟骨結(jié)構(gòu)清晰可見。而模型組中的番紅O失染嚴(yán)重，可見軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞彌漫性增加。Atsttrin組大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨破壞情況得到明顯減輕。OARSI評分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比（0.51±0.03），模型組（2.56±0.21）和Atsttrin組（1.08±0.11）大鼠OARSI評分均顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，Atsttrin組大鼠OARSI評分顯著降低（P=0.001）。

2.2 Atsttrin對骨關(guān)節(jié)炎大鼠CD+4 T細(xì)胞亞群的影響細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組和Atsttrin組大鼠的血清IFN-γ和IL-17水平均顯著升高，而IL-4和TGF-β水平均顯著降低（P＜0.05）。Atsttrin組大鼠的血清IFN-γ和IL-17水平顯著低于模型組，而IL-4和TGF-β水平顯著高于模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β水平∕（ng∕L，±s）

表2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β水平∕（ng∕L，±s）

注：IFN-γ為干擾素-γ，IL-4為白細(xì)胞介素-4，IL-17為白細(xì)胞介素-17，TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子-β。①與假手術(shù)組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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與假手術(shù)組相比，模型組和Atsttrin組大鼠的血清Th1和Th17細(xì)胞比例均顯著升高，而Th2和Treg細(xì)胞比例均顯著降低（P＜0.05）。Atsttrin組大鼠的血清Th1和Th17細(xì)胞比例顯著低于模型組，而Th2和Treg細(xì) 胞 比 例 顯 著 高 于 模 型 組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比較∕（%，±s）

表3 各組大鼠血清Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比較∕（%，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

?

2.3 Atsttrin抑制TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞增殖與對照組（1.03±0.12）相比，TNF-α（10 μg∕L）處理組（1.78±0.15）的滑膜細(xì)胞增殖能力顯著升高（P＜0.001）；用10 μg∕L、20 μg∕L或50 μg∕L的Atsttrin處理后，與TNF-α（10 μg∕L）處理組相比，三組滑膜細(xì)胞的增殖能力均顯著降低，依次為（1.31±0.12）、（1.11±0.09）和（1.06±0.07）（P=0.014，P=0.002和P＜0.001）。

2.4 Atsttrin促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖與對照組（1.12±0.14）相比，TNF-α（10 μg∕L）處理組（0.34±0.04）的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.001）；用10 μg∕L、20 μg∕L或50 μg∕L的Atsttrin處理后，與TNF-α（10 μg∕L）處理組相比，三組軟骨細(xì)胞的增殖能力均顯著升高，依次為（0.66±0.05）、（0.76±0.07）和（0.80±0.09）（P＜0.001，P=0.007和P=0.011）。

2.5 Atsttrin抑制TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中ADAMTS-4和MMP-13的表達(dá)與對照組相比，TNFα（10 μg∕L）處 理 組 的 軟 骨 細(xì) 胞 中ADAMTS-4和MMP-13的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上升，而用10 μg∕L、20 μg∕L或50 μg∕L的Atsttrin處 理后，與TNF-α（10 μg∕L）處理組相比，三組軟骨細(xì)胞中ADAMTS-4和MMP-13的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。見圖2，表4。

圖2 Western blotting檢測Atsttrin對TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中ADAMTS-4和MMP-13表達(dá)的影響

表4 各組ADAMTS-4和MMP-13的mRNA相對表達(dá)量

2.6 Atsttrin對TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響與對照組相比，TNF-α（10 μg∕L）處理組的軟骨細(xì)胞中IFN-γ和IL-17的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上升，而IL-4和TGF-β的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。用10 μg∕L、20 μg∕L或50 μg∕L的Atsttrin處理后，與TNF-α（10 μg∕L）處理組相比，三組軟骨細(xì)胞中IFN-γ和IL-17的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而IL-4和TGF-β的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。見圖3和表5。

圖3 Western blotting檢測Atsttrin對TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β表達(dá)的影響

表5 各組IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的mRNA相對表達(dá)量

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是最常見的關(guān)節(jié)疾病之一，然而，骨關(guān)節(jié)炎的確切病理機(jī)制仍不清楚。目前，臨床中仍缺乏特效藥物阻止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。眾所周知，細(xì)胞因子密切參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程。其他研究發(fā)現(xiàn)PGRN是與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的生長因子［3］。PGRN的缺失可加重骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠的骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，而外源性施用重組PGRN則可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎［7］。PGRN通過與TNFRs結(jié)合在多種炎癥性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中發(fā)揮作用［12］。Atsttrin是一種PGRN衍生工程蛋白，該蛋白具有比PGRN更強(qiáng)的結(jié)合TNFR的能力，并且半衰期更長。據(jù)報道，在炎癥性關(guān)節(jié)炎動物模型中，Atsttrin具有比PGRN更強(qiáng)的治療作用［3］。外科手術(shù)誘發(fā)的骨關(guān)節(jié)炎模型是研究體內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的公認(rèn)方法，本研究通過膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶橫斷法建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并應(yīng)用Atsttrin治療大鼠4周以考察Atsttrin在治療骨關(guān)節(jié)炎反面的潛在價值和所涉及的機(jī)制。

堿性染料番紅O可將嗜堿性的軟骨染為紅色，而酸性染料固綠可將嗜酸性的骨組織染為藍(lán)色或綠色，因此，番紅O固綠染色可用于觀察關(guān)節(jié)軟骨退變情況，在本研究中，番紅O固綠染色切片表明Atsttrin有效地防止了骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的軟骨退變。OARSI評分結(jié)果表明，Atsttrin顯著降低了骨關(guān)節(jié)炎大鼠的OARSI評分，說明Atsttrin可有效抑制骨關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展，改善膝關(guān)節(jié)功能。

眾所周知，TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生中起重要作用，作為重要的促炎細(xì)胞因子，上調(diào)TNF-α可直接促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞死亡［17］。另外，TNF-α可以激活MAPK和NF-κB信號傳導(dǎo)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞［3］。TNF-α抑制劑在關(guān)節(jié)炎的臨床試驗(yàn)中均顯示出較好的治療效果［18］。其他研究中已經(jīng)證實(shí)Atsttrin可在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中抑制軟骨破壞和炎癥反應(yīng)。為了揭示Atsttrin在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的生理機(jī)制，本研究探討了Atsttrin對TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖的影響。已知骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境失衡主要與滑膜組織和滑膜細(xì)胞微環(huán)境失衡有關(guān)?；ぜ?xì)胞主要由成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞組成。在骨關(guān)節(jié)炎中，滑膜細(xì)胞增殖可導(dǎo)致滑膜增生和纖維化，改變軟骨細(xì)胞微環(huán)境及關(guān)節(jié)的力學(xué)特征，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。本研究顯示，TNF-α可明顯促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖并抑制軟骨細(xì)胞增殖，而Atsttrin可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)，從而維持關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。

據(jù)報道，TNF-α可在軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶（包括MMP-13和ADAMTS-4）以及其他炎性生物標(biāo)志物降解軟骨基質(zhì)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞［19］。ADAMTS-4是軟骨基質(zhì)蛋白聚蛋白多糖的主要降解酶，而MMP-13是一種能夠溶解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶［20］。本研究中也發(fā)現(xiàn)了TNF-α可上調(diào)軟骨細(xì)胞中ADAMTS-4和MMP-13的表達(dá)，然而，Atsttrin可以劑量依賴性方式下調(diào)軟骨細(xì)胞中ADAMTS-4和MMP-13的表達(dá)，從而發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。

另外，在軟骨細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理可上調(diào)軟骨細(xì)胞中IFN-γ和IL-17的表達(dá)并下調(diào)IL-4和TGF-β的表達(dá)。不同濃度的Atsttrin處理可逆轉(zhuǎn)上述變化。該結(jié)果與骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致，進(jìn)一步證實(shí)了Atsttrin可通過糾正Th1∕Th2細(xì)胞以及Th17∕Treg細(xì)胞的失衡來發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。

綜上所述，Atsttrin可有效抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的軟骨病變并提高關(guān)節(jié)功能。Atsttrin可通過抑制滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、抑制軟骨機(jī)制降解來維持關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。此外，Atsttrin的關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用與糾正Th1∕Th2細(xì)胞以及Th17∕Treg細(xì)胞的失衡有關(guān)。