甜櫻桃“三早二選一促”高效育種方法

吳雅琴，程和禾，陳 龍，李玉生，高 倩，郭 勇，吳永杰，趙艷華

（河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所 河北 昌黎 066600）

甜櫻桃具有結(jié)果早，見(jiàn)效快、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)發(fā)展勢(shì)頭迅猛，栽培面積達(dá)23.33 萬(wàn)hm2以上，單位面積產(chǎn)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它樹(shù)種，已成為新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)，也是農(nóng)民增收的重要樹(shù)種。但在甜櫻桃產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的過(guò)程中，一些制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題也暴露無(wú)遺，如主栽品種單一、缺少不同熟期的優(yōu)良品種，導(dǎo)致成熟期過(guò)于集中，果品供應(yīng)周期短；良種化程度低，果個(gè)小、裂果重、單產(chǎn)低的品種仍占較大比例；優(yōu)良品種奇缺，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種非常少，引進(jìn)品種存在種植區(qū)域和管理技術(shù)方面“水土不服”的問(wèn)題，造成了種植戶(hù)的高投入，低回報(bào)，未能發(fā)揮甜櫻桃“小水果（面積?。?，高效益（價(jià)格高）”的優(yōu)勢(shì)；優(yōu)良新品種培育難度越來(lái)越大，必須尋求育種技術(shù)的創(chuàng)新與突破；為促進(jìn)甜櫻桃產(chǎn)業(yè)健康長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展，滿(mǎn)足旅游觀光、采摘的需求，全面提升甜櫻桃產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，培育優(yōu)質(zhì)甜櫻桃新品種勢(shì)在必行。利用傳統(tǒng)育種方法培育新品種需要20~30 年，育種周期長(zhǎng)，因此，開(kāi)展甜櫻桃高效育種技術(shù)研究，建立現(xiàn)代高效育種技術(shù)，培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的突破性甜櫻桃品種，對(duì)提升櫻桃產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，促進(jìn)櫻桃產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所櫻桃與生物技術(shù)研究室從2000 年開(kāi)始進(jìn)行甜櫻桃新品種培育技術(shù)研究，建立了甜櫻桃“三早二選一促”的高效育種方法，其中“三早”即早獲得雜交苗的方法（甜櫻桃胚搶救技術(shù)體系建立，甜櫻桃體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)體系建立和甜櫻桃快速播種當(dāng)年成苗技術(shù)建立）；“二選”即利用自交親和性狀分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)和質(zhì)構(gòu)分析篩選技術(shù)盡快篩選出優(yōu)質(zhì)并符合育種目標(biāo)的雜交后代；“一促”即利用砧木、整形修剪、促控藥劑等縮短甜櫻桃實(shí)生苗童期技術(shù)。將育種周期縮減了3~5 年，大大提高了育種效率，并利用該方法培育出了7 個(gè)甜櫻桃新品種。

1 “三早”——三種雜交（實(shí)生）苗早獲得的3 種方法

1.1 甜櫻桃胚搶救技術(shù)體系建立 以紅燈與斯特拉的雜交胚為試材，研究了甜櫻桃幼胚的最佳搶救時(shí)期是在30 d 以后進(jìn)行，并篩選出適宜的胚萌發(fā)培養(yǎng)基、新梢增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基[1]。

建立了甜櫻桃胚搶救技術(shù)程序：取花后30~45 d果實(shí)種子→砸破外種皮→酒精浸泡30 s→無(wú)菌水沖洗2 次→0.1%升汞消毒7 min→去內(nèi)種皮→84 消毒液浸泡20 min→接種，胚萌發(fā)培養(yǎng)基（MS+0.4 mg/L IAA+1.0 mg/L BA）→植株形成→繼代，新梢增殖培養(yǎng)基（MS + 0.4 mg/L IAA +0.7 mg/L BA→生根（1/2MS +0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L IBA）→馴化移栽。

最佳馴化移栽方法為將生根苗移至溫室后，先遮蔭，再逐漸增加光強(qiáng)，30 d后，開(kāi)口煉苗7 d再移栽，此時(shí)生根苗葉片濃綠，肥厚，苗粗壯，莖呈紅褐色，半木質(zhì)，主根為淺紅色，有白色側(cè)根，移栽成活率達(dá)95%。

1.2 甜櫻桃體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)體系建立 以甜櫻桃‘紅燈’ב斯特拉’，未成熟幼胚子葉為試材，研究了胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)、體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生等培養(yǎng)條件[2]。研究了不同基因型體細(xì)胞胚胎發(fā)生的差異：對(duì)花后30~45 d 的紅燈、紅艷、先鋒、拉賓斯、短枝斯特拉、斯特拉、短枝斯特拉×紅燈共7 個(gè)不同基因型幼胚進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生誘導(dǎo)，誘導(dǎo)成功率分別為90.5%、72.5%、59.5%、53.8%、59.5%、29.8%、27.4%。從以上數(shù)據(jù)看，不同基因型間的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)存在很大差異，其中紅燈和紅艷兩個(gè)早熟基因型的誘導(dǎo)率較高。

建立了甜櫻桃體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)程序：取雜種幼胚→0.1%升汞消毒7 min→去內(nèi)種皮接種→84 液消毒20 min→去胚芽→愈傷組織誘導(dǎo)（MS+2.0 mg/L 2,4-D +1.0 mg/L BA +40 g/L 蔗糖+5.0 g/L 瓊脂）→體細(xì)胞胚誘導(dǎo)（MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L BA+40 g/L蔗糖+5.5 g/L 瓊脂）→胚體成熟及植株再生（1.0 mg/L 6-BA+MS+0.1 mg/L NAA）→繼代培養(yǎng)（0.5 mg/L 6-BA+MS+0.2 mg/L NAA）→生根（1/2MS+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L IBA）→馴化移栽。

1.3 甜櫻桃快速播種當(dāng)年成苗技術(shù)建立 開(kāi)展了從選種、種子預(yù)處理、種子液體培養(yǎng)、播種到出苗的適宜條件篩選，研究建立了甜櫻桃快速播種當(dāng)年成苗技術(shù)程序：3 月下旬，選擇溫室剛成熟的自然授粉甜櫻桃品種‘早大果’，‘紅燈’、‘玲瓏脆’和‘甜心’等，取無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)，將果肉與種子剝離，裝入干凈的燒杯，用自來(lái)水洗凈，去除漂浮在水面上的種子（敗育），將沉在水底的種子取出，砸破外種皮，取出種仁（保證種仁完整），將其放在三角瓶中，用蒸餾水沖洗干凈，并用蒸餾水浸泡，蓋上封口膜，置于2~6 ℃冰箱冷藏1~2 d，取出浸泡后的種仁置于培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀片去除內(nèi)種皮，放入盛液體培養(yǎng)基（不含瓊脂的MS，1.0 mg/L BA、0.2 mg/L IAA）的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，封口并置于4 ℃冰箱冷藏，3 d 換1 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 d 后播種；5~7 d 后，陸續(xù)有芽露出土面，待植株長(zhǎng)到10~15 cm，5 月中下旬將培養(yǎng)成株的實(shí)生苗定植田間，10 月可長(zhǎng)成0.8~1.0 m 的成苗。次年進(jìn)入選種圃，進(jìn)行選種。

利用這3 種方法提早、高效獲得雜交（實(shí)生）后代，從而縮短育種周期。

2 “二選”——兩種雜交（實(shí)生）后代篩選技術(shù)

2.1 自交親和性狀分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù) 研究了CTAB法提取甜櫻桃總DNA的方法[3]：取嫩葉2~3 片，液氮研磨后轉(zhuǎn)入2 mL 離心管中，加入0.9 mL 2%CTAB 提取緩沖液（5 mol/L NaCl，0.25 mol/L EDTA，1 mol/L Tris-HCl pH8.0，2%PVP 和0.1%DIECA），置于65 ℃保溫30 min，冷卻至室溫，加入等體積CI（chloroform∶octanol=24∶1)，12 000 rpm 16 ℃離心15 min，取上清，加入等體積CI 洗滌離心2 次，2/3 體積異丙醇沉淀，棄上清，乙醇清洗晾干，加入200L TE（pH8.0）緩沖液溶解。

引物BFP200/ BFP201 與內(nèi)對(duì)照引物PCR IC-F/IC-R 的反應(yīng)體系為15L：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTPs，2 mmol/L MgCl2，0.2mol/L 引物BFP200/ BFP201，0.1mol/L引物IC-F/IC-R，1.5 UTaq DNA 聚合酶，約20 ng DNA模板。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃3 min，94 ℃45 s，50 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；PCR 體系2 反應(yīng)條件:94 ℃3 min，94 ℃45 s，50 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠(含0.5g/mL EB)上進(jìn)行電泳分離，電泳緩沖液為0.5×TBE，5 V/cm 電壓電泳40~60 min，紫外燈下成像并拍照。

篩選程序?yàn)椋禾饳烟覍?shí)生苗嫩葉→提取總DNA→PCR→2%瓊脂糖凝膠→自交親和性狀確定→田間套袋自花結(jié)實(shí)率驗(yàn)證。

利用該方法可在苗期對(duì)雜交后代是否具備自交親和性狀進(jìn)行鑒定，有利于自花結(jié)實(shí)后代的早期篩選，提高育種效率。

2.2 質(zhì)構(gòu)分析快速篩選技術(shù) 質(zhì)地特性是櫻桃果實(shí)極其重要的品質(zhì)因素，物性分析儀所反映的主要是與力學(xué)特性有關(guān)的果蔬質(zhì)地特性，具有較高的靈敏性與客觀性。主要測(cè)試果實(shí)的成熟度、堅(jiān)實(shí)度、果肉硬度、果實(shí)的脆性及果皮或果肉的彈性等。TPA 測(cè)試法是通過(guò)探頭的二次下壓全面的反映水果的硬度、脆性、彈性、內(nèi)聚性、回復(fù)性、咀嚼性等。經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)試及調(diào)整優(yōu)化，篩選出了適于甜櫻桃的參數(shù)設(shè)置：探頭P50，模式為T(mén)PA，測(cè)試前、測(cè)試及測(cè)后速率均為1 mm/s，壓縮程度25%，停留間隔為2 s，觸發(fā)力為0.1 N。

利用該技術(shù)可快速準(zhǔn)確測(cè)定果實(shí)硬度，進(jìn)行硬肉、耐貯品種篩選。

3 “一促”——雜交（實(shí)生）后代縮短童期、促早開(kāi)花技術(shù)

在櫻桃新品種培育過(guò)程中，實(shí)生苗從種植到開(kāi)花、結(jié)果一般需要3~4 年時(shí)間，嚴(yán)重影響育種進(jìn)度。我們?cè)谏a(chǎn)實(shí)踐中總結(jié)出一套利用噴施促控藥劑，結(jié)合刻芽、掐尖、扭稍等栽培管理措施，促使縮短實(shí)生苗童期，第2 年就可以開(kāi)花、結(jié)果，有利于優(yōu)系的早期篩選，可以縮短育種周期2~3 年。

4 總結(jié)

利用甜櫻桃“三早二選一促”的高效育種方法，克服了傳統(tǒng)育種方法中育種周期長(zhǎng)、育種效率低的問(wèn)題。通過(guò)早期篩選技術(shù)，將不符合育種目標(biāo)的單株盡早淘汰，結(jié)合促早結(jié)果技術(shù)，縮短實(shí)生苗童期技術(shù)，縮短育種周期，提高育種效率和準(zhǔn)確率。利用該方法已培育出‘玲瓏脆’、‘五月紅’、‘早蜜露’、‘昌華紫玉’、‘昌華紫脆’、‘昌華紫霞’和‘晚蜜露’共7 個(gè)甜櫻桃新品種。