生物活性肽制備、鑒定及其生物活性研究進(jìn)展

王耀冉，陳明杰，李治平，鐘靜詩(shī)，董沁，趙妍*

1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所（上海 201403）；2. 上海海洋大學(xué)（上海 201306）

生物活性肽（BPs）是在人體健康和代謝功能中起重要作用，具有積極影響的特異性蛋白質(zhì)片段，通常含有2～20個(gè)氨基酸殘基[1]。目前，“BIOPEP”數(shù)據(jù)庫(kù)已有4 032個(gè)生物活性肽的報(bào)道[2]，包括抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎和降血壓等生物活性。BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)中與人類健康相關(guān)的生物活性肽的數(shù)量如圖1所示。

圖1 BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)中與人類健康相關(guān)的生物活性肽的數(shù)量

從食品中提取的生物活性肽，因其對(duì)人類疾病的預(yù)防和控制作用更為安全和溫和，而受到越來(lái)越多研究人員的關(guān)注。在生物活性肽的制備過(guò)程中，其分離純化技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。良好生物活性的多肽，常采用超濾進(jìn)行粗分離、色譜進(jìn)行細(xì)分離，結(jié)合光譜、質(zhì)譜等方法對(duì)肽進(jìn)行表征，采用固相法合成目標(biāo)多肽，再通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)進(jìn)行活性驗(yàn)證和穩(wěn)定性分析。對(duì)于具有良好活性的肽，根據(jù)活性特點(diǎn)開(kāi)發(fā)其在功能性食品、營(yíng)養(yǎng)保健品、醫(yī)藥制劑和化妝品等行業(yè)的應(yīng)用。

文章對(duì)生物活性肽的制備方法及序列的鑒定進(jìn)行了綜述，闡述了生物活性肽的抗菌、抗氧化、抗癌、抗衰老、抗炎和降血壓等功能，以期為生物活性肽的應(yīng)用提供參考。

1 生物活性肽的制備

生物活性肽的制備是以蛋白質(zhì)為原料，利用酶解、微生物發(fā)酵等方法從蛋白質(zhì)中釋放多肽。

1.1 酶解法

酶解法具有操作簡(jiǎn)單、容易控制且能在較短時(shí)間獲得更一致水解產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)。

酶解使用的蛋白酶類型非常重要，如表1所示，不同酶具有不同的酶切位點(diǎn)，會(huì)產(chǎn)生不同的肽段，影響水解產(chǎn)物的生物活性。Dong等[3]使用六種蛋白酶對(duì)灰樹(shù)花進(jìn)行酶解制備肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶在pH 7.5、溫度45 ℃水解1.5 h所得水解產(chǎn)物具有最高的抗氧化活性。Pino等[4]使用枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的酶組合水解沙丁魚(yú)蛋白，獲得具有抗糖尿病活性的多肽。

表1 常用的一些商品蛋白酶

用于酶解蛋白的酶種類很多，對(duì)于單一酶或復(fù)合酶酶解的最佳效果目前沒(méi)有達(dá)成共識(shí)，因此篩選合適的酶是獲得高活性生物活性肽的關(guān)鍵。

1.2 微生物發(fā)酵法

微生物在發(fā)酵過(guò)程會(huì)產(chǎn)生許多蛋白酶作用于底物蛋白，是生產(chǎn)生物活性肽的有效途徑。如Ano等[5]從發(fā)酵乳制品中篩選出的二肽WY抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)脂多糖的活化，從而改善了認(rèn)知能力的下降。微生物雖然具有來(lái)源廣、繁殖快、蛋白酶產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，但微生物生產(chǎn)的酶活力不穩(wěn)定將會(huì)導(dǎo)致獲得的肽品種及數(shù)量的重現(xiàn)性不穩(wěn)定。

多種方法協(xié)同處理有利于生物活性肽的制備。如：劉子毅等[6]發(fā)現(xiàn)超高壓協(xié)同堿性蛋白酶制備玉米黃粉ACE抑制肽，不僅提高了ACE抑制率，且酶解時(shí)間縮短到15 min以內(nèi)；Gammoh等[7]通過(guò)對(duì)駱駝奶乳清蛋白和酪蛋白進(jìn)行超聲處理和使用德式乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲處理和發(fā)酵后駱駝奶乳清蛋白和酪蛋白的抗氧化活性和ACE抑制活性均增加。

2 生物活性肽的分離純化及鑒定

2.1 生物活性肽的分離純化

分離純化是分析多肽結(jié)構(gòu)和活性之間關(guān)系的重要步驟，選擇合適的分離技術(shù)能夠更加準(zhǔn)確地富集生物活性肽。

Wang等[8]在木瓜蛋白酶的最佳酶解條件下酶解路氏雙髻鯊的醇溶性蛋白，使用超濾（UF）、離子交換層析（IEC）、凝膠過(guò)濾層析（GFC）和反相高效液相色譜（RP-HPLC）對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到的兩個(gè)肽WDR和PYFNK均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。Wang等[9]通過(guò)Sephadex G-15凝膠層析、高效液相色譜（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）等色譜技術(shù)純化大西洋三文魚(yú)副產(chǎn)物的胃蛋白酶酶解物，所得肽TPEVHIAVDKF具有抗過(guò)敏活性。借助多種色譜相結(jié)合選擇最優(yōu)的方法，能更好地對(duì)粗多肽進(jìn)行分離純化，從而得到高活性、高純度的肽。

2.2 生物活性肽的鑒定

對(duì)肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定能夠更好地理解結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。質(zhì)譜（MS）可以準(zhǔn)確測(cè)定多肽的分子量和氨基酸序列[10]；圓二色譜（CD）可獲得多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成[11]；紅外光譜（IR）可測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成最敏感的光譜區(qū)酰胺I，進(jìn)而分析多肽中可能存在的基團(tuán)[12]；核磁共振（NMR）通常與紅外光譜聯(lián)用，鑒定多肽中存在的特殊的官能團(tuán)[13]。

Jia等[14]從文蛤中分離出的抗氧化肽MmP 4（LSDRLEETGGASS）、MmP 11（KEGCREPETEKGHR）、MmP19（IVTNWDDMEK）能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子DAF-16的核轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)中sod-3、ctl-1和ctl-2等基因的表達(dá)，提高線蟲(chóng)對(duì)百草枯的抗性，圓二色譜顯示MmP 4主要為β折疊片，MmP 11和MmP 19主要為無(wú)規(guī)卷曲。莫加利等[15]通過(guò)超納濾、RP-HPLC從風(fēng)干武昌魚(yú)中分離純化出純度均一的鮮味肽，使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS）、氨基酸自動(dòng)分析儀、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）測(cè)定鮮味肽的分子質(zhì)量、氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)。

多種方法聯(lián)用可以在多肽的結(jié)構(gòu)解析中達(dá)到相互補(bǔ)充的效果，從而能更加準(zhǔn)確地解析結(jié)構(gòu)和活性之間的關(guān)系。

3 肽的生物活性

3.1 抗菌活性

肽序列通常由5～50個(gè)氨基酸殘基組成，高疏水性和凈正電荷的特性為抗病原體奠定了基礎(chǔ)。Noore等[16]發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子抗菌肽LL-37相較于抗生素對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的金黃色葡萄球菌的殺傷力更迅速且有效。Yu等[17]研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶水解獲得較小尺寸的肽，有利于與微生物膜的相互作用，進(jìn)而改變微生物膜的滲透性，從而導(dǎo)致其分解。

隨著細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，人們對(duì)新型抗菌肽的需求量日益增加。加大對(duì)于天然抗菌肽的探索，在生物醫(yī)藥研發(fā)及應(yīng)用方面具有重要的意義。

3.2 抗氧化活性

在人體中過(guò)量的自由基攻擊生物分子引起氧化損傷會(huì)導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生，如癌癥、衰老、動(dòng)脈粥樣硬化等[1]。多項(xiàng)研究表明抗氧化劑在相對(duì)較低的濃度下，能夠抑制或延緩細(xì)胞的氧化損傷，對(duì)人體健康具有重要的作用。

肽結(jié)構(gòu)和氨基酸序列影響其抗氧化性能，多肽兩端或側(cè)鏈含有芳香族和疏水性氨基酸，可以增強(qiáng)其抗氧化能力。Guo等[18]發(fā)現(xiàn)在C端含有Tyr殘基的二肽（LY、RY和YY）具有較強(qiáng)的羥自由基、過(guò)氧化物自由基清除活性。通過(guò)用9種蛋白酶水解23種成熟亞麻籽蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶相較于胰蛋白酶和胃蛋白酶水解亞麻籽蛋白所得的肽具有更高的抗氧化能力，且芳香族、疏水性和帶負(fù)電的氨基酸頻繁地出現(xiàn)在這些肽中[19]。

盡管蛋白質(zhì)來(lái)源的生物活性肽具有減少活性氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的作用，但其不良反應(yīng)、安全性和致敏性有待進(jìn)一步研究以確定其治療用途。

3.3 抗癌活性

癌癥是全球發(fā)病率和死亡率高的主要原因之一，是由體內(nèi)細(xì)胞的異常生長(zhǎng)和增殖產(chǎn)生的[20]。一些抗癌的化學(xué)藥物存在較大副作用，對(duì)正常的細(xì)胞造成損害[21]，從食物蛋白等自然資源中發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥可以為癌癥的預(yù)防和治療提供更好的選擇。

從孔鰩蛋白酶水解物中分離出的六肽FIMGPY通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制Hela細(xì)胞的增殖，具有高劑量依賴性抗增殖活性[21]。Wang等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌酶協(xié)同作用和油菜粕固態(tài)發(fā)酵的組合方法制備油菜籽肽RSP-4-3-3，在體外可顯著改變HepG2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征并引起細(xì)胞凋亡，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。Umayaparvathi等[20]發(fā)現(xiàn)牡蠣肽LANAK通過(guò)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增加DNA損傷和凋亡，來(lái)啟動(dòng)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡。由上可知，生物活性肽具有作為抗增殖劑和抗癌劑的強(qiáng)大潛力。

3.4 抗衰老活性

皮膚衰老是由內(nèi)在因素和外在因素共同作用導(dǎo)致的。這些因素對(duì)皮膚作用的后果是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度降解，抗菌功能喪失，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)增加。

體外研究表明，生物活性肽具有抑制衰老相關(guān)酶活性的作用。例如：用胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶共同作用水解螺旋藻獲得的螺旋藻生物活性肽，對(duì)膠原蛋白酶活性抑制達(dá)92.5%[23]；源自南沙綠藻的蛋白質(zhì)水解物，具有較高的抗彈性蛋白酶和抗透明質(zhì)酸酶活性[24]；魚(yú)的副產(chǎn)物生產(chǎn)膠原蛋白經(jīng)水解后產(chǎn)生的＜1 kDa的組分，具有抑制酪氨酸酶和膠原蛋白酶的抗衰老活性[25]。類似地，Hong等[26]報(bào)道小于3 kDa的膠原蛋白肽的組分具有更高的酪氨酸酶活性抑制作用。生物活性肽是具有較高安全性且對(duì)皮膚有保護(hù)作用的功能成分，它們可以有益地影響皮膚中的多種生理途徑。

3.5 抗炎活性

炎癥是機(jī)體對(duì)多種炎癥因子的防御反應(yīng)，是許多疾病中常見(jiàn)的病理過(guò)程。抑制炎癥細(xì)胞因子的合成和活性是炎癥治療的關(guān)鍵。生物活性肽顯示出抑制或減少炎癥標(biāo)志物，以及通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生抗炎效果。極大螺旋藻酶解產(chǎn)物L(fēng)DAVNR、MMLDF能顯著抑制肥大細(xì)胞中組胺的釋放以及內(nèi)皮細(xì)胞中IL-8的產(chǎn)生[27]。Cheng等[28]從金槍魚(yú)烹飪汁中純化的肽PRRTRMMNGGR具有抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的作用。Gao等[29]從鱘魚(yú)胃蛋白酶水解產(chǎn)物中純化所得的級(jí)分F2對(duì)LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞的抗炎作用歸因于抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路、促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的釋放和IκBα的磷酸化。

3.6 降血壓

高血壓是指動(dòng)脈內(nèi)持續(xù)的血壓升高，是引起心血管疾病的主要危害因素。ACE能催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，且能使緩激肽失活，因此抑制ACE的活性對(duì)于防治高血壓意義重大。ACE抑制肽阻斷了血管緊張素II的合成，并抑制激肽酶Ⅱ的減少和緩激肽的破壞[30]。

ACE的抑制作用與肽的序列和分子量關(guān)系密切，ACE抑制肽的序列由疏水性氨基酸和脂肪族氨基酸組成[31]。Escudero等[32]從豬肉的體外消化物中鑒定出的三種新肽RPR、KAPVA、PTPVP具有抗高血壓活性；Lau等[10]發(fā)現(xiàn)泡囊側(cè)耳純化肽AHEPVK可能與ACE活性部位結(jié)合，阻止其與底物結(jié)合，而對(duì)ACE表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制；Geng等[33]從松茸子實(shí)體的水提取物中提純的ACE抑制肽，其IC50值為0.40 μmol/L，低于所有乳清和酪蛋白衍生的ACE抑制肽的IC50值。

雖然動(dòng)物和體外證據(jù)指出了食物來(lái)源的生物活性肽具有降血壓作用的潛在機(jī)制，但是仍需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 生物活性肽及其功能

4 結(jié)語(yǔ)

生物活性肽作為食物蛋白水解的產(chǎn)物，具有多種生理活性，可作為功能性食品、保健品、膳食補(bǔ)充劑和藥品的基本成分。目前采用酶解法、微生物發(fā)酵法等制備生物活性肽，但對(duì)活性肽的體內(nèi)作用機(jī)制研究較少。2019年5月，在西班牙巴倫西亞舉行的第二屆國(guó)際生物活性肽研討會(huì)的“熱門話題”之一就是生物活性肽的作用機(jī)制。與此同時(shí)，肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其活性作用機(jī)制密切相關(guān)，因此對(duì)肽結(jié)構(gòu)的深入研究有助于探索其作用機(jī)制。近年來(lái)，將生物信息學(xué)和經(jīng)典方法相結(jié)合進(jìn)行科學(xué)研究，如以計(jì)算機(jī)為工具，預(yù)測(cè)生物活性肽的前體蛋白、活性、分析生物活性肽的物化性質(zhì)以及活性機(jī)制等，應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物活性建模，如定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系建模、分子對(duì)接試驗(yàn)等方法，可以對(duì)生物活性肽進(jìn)行更為透徹的研究。