動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響

敬思群*，王德萍，周苗苗，縱偉

1. 韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院（韶關(guān) 512005）；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（烏魯木齊 830046）；3. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心（鄭州 450002）

動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)（DHPM）是一種新型的超高壓均質(zhì)方式，集輸送、加壓、混合、超微粉碎等的功能原理于一體。處理裝置主要包括超微粉碎室、微射流室和超高壓泵，料液進(jìn)入超微粉碎室時(shí)，由于高壓作用物料受到超微粉碎破壞大分子顆粒形成納米微粒。其機(jī)理主要是結(jié)合空穴作用、剪切力和高速率，對(duì)樣品產(chǎn)生巨大的壓力，使物料起著較好的超細(xì)化處理效果[1-2]。動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)在食品、藥品、生化等方面都有應(yīng)用，如乳化均質(zhì)、濕法超微化、大分子改性、滅菌、脂質(zhì)體的制備等處理[3]。大豆分離蛋白（SPI）是食品加工中的重要原料，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和功能特性，大多研究集中于動(dòng)態(tài)高壓對(duì)大豆分離蛋白功能特性的影響，如起泡性、膠凝性、乳化性等[4-5]，鮮見動(dòng)態(tài)超高壓對(duì)大豆分離蛋白水溶液的微觀結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)作用的報(bào)道[6]。

試驗(yàn)以20，40，80，120和160 MPa處理大豆分離蛋白溶液，分析動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白的粒徑分布、Zeta電位、蛋白溶解度、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和形貌變化的影響，為進(jìn)一步研究動(dòng)態(tài)高壓對(duì)蛋白與多糖共存體系的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白（純度達(dá)到90%，食品級(jí)，哈高科大豆食品有限公司）；疊氮化鈉；氫氧化鈉、考馬斯亮藍(lán)、鹽酸（均為分析級(jí)）。

FPG128000動(dòng)態(tài)高壓微射流（英國SFP公司）；Nano-ZS90激光散射儀（英國Malern公司）；XYFD-18冷凍干燥機(jī)（上海欣諭儀器有限公司）；JSM-6490LV掃描電鏡（日本JEOL公司）；Vertex70傅里葉紅外光譜儀（美國Bruker公司）；T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白水溶液的制備

將大豆分離蛋白加入到去離子水中，在磁力攪拌下配制成濃度2 mg/mL的母液，攪拌20 min后，經(jīng)膠體磨將其細(xì)化及均勻分布，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH 7.0，在4 ℃下水化過夜，經(jīng)20 MPa普通均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后，得到大豆分離蛋白水溶液

1.2.2 動(dòng)態(tài)超高壓微射流處理

參照敬思群等[7]的方法稍作改動(dòng)進(jìn)行對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行處理。采用高壓微射流機(jī)均質(zhì)機(jī)在均質(zhì)壓力分別為40，80，120和160 MPa對(duì)大豆分離溶液進(jìn)行2次循環(huán)處理，以未經(jīng)任何處理的大豆分離蛋白水溶液作為對(duì)照，以20 MPa下的大豆分離蛋白作為陽性對(duì)照，加入濃度0.02%的NaN3作為抑菌劑。除直接取樣測定粒度分布外，剩余樣品冷凍干燥后待測。

1.2.3 粒徑和電位

參照Sun等[8]的方法稍作改動(dòng)測定大豆分離蛋白溶液的粒徑和電位。采用Nano-ZS90型激光散射儀同時(shí)對(duì)不同條件下處理的樣品進(jìn)行粒徑和電位分析。

1.2.4 蛋白溶解性測定

參照張晶等[9]的方法稍作改動(dòng)測定大豆分離蛋白溶解度。樣品溶液在10 000 r/min下離心20 min后，取上清液稀釋到合適的濃度，取1 mL于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，振蕩搖勻后，在595 nm處比色測定吸光度。原樣品的總蛋白質(zhì)含量則使用凱氏定氮法測定。上清液中蛋白質(zhì)含量與原蛋白含量的比值即為溶解度指數(shù)S（%），S（%）表示的是蛋白溶解度。

1.2.5 傅里葉紅外分析

根據(jù)陳登龍等[10]的方法稍作改動(dòng)分析大豆分離蛋白功能基團(tuán)的特征。冷凍干燥的樣品與KBr混合，研磨壓片，置于傅里葉紅外光譜儀中掃描，每個(gè)樣品掃描34次，檢測器為HgCdTe，分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1。

1.2.6 SEC掃描電鏡分析

將樣品冷凍干燥后粘于樣品臺(tái)上并進(jìn)行噴鍍電導(dǎo)層，在高分辨率掃描電子顯微鏡下觀察大豆分離蛋白的形貌變化。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，p＜0.05時(shí)表示差異性顯著。所有試驗(yàn)平行3次，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 動(dòng)態(tài)高壓對(duì)大豆分離蛋白顆粒尺寸的影響

由圖1可知：在常壓下，大豆分離蛋白溶液中顆粒尺寸分布不均勻，出現(xiàn)3個(gè)峰，其中91.2%的顆粒的粒徑達(dá)到429.133 nm，5.3%的顆粒的粒徑尺寸達(dá)到86.27 nm，而3.5%顆粒的尺寸達(dá)到5 279.5 nm，總體上0.1 MPa下的大豆分離蛋白的平均粒徑尺寸為259.80±19.126 nm。而20，40，80，120和160 MPa的條件下，顆粒的平均粒徑分別為202.60±8.591 nm、174.73±3.403 nm、159.13±4.398 nm、153.90±5.237 nm和147.6±2.851 nm。總之粒徑體積分?jǐn)?shù)分布隨著壓力增加向小粒徑尺寸移動(dòng)。這與Sun等[11]研究動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)玉米蛋白的粒徑分析相似。

圖1 動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白溶液粒徑體積分?jǐn)?shù)的影響

表1 不同壓力下大豆分離蛋白粒徑尺寸方差分析

表2 不同壓力下大豆分離蛋白粒徑尺寸多重比較

根據(jù)方差分析和多重比較可知，動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白的粒徑分布有顯著影響，120和160 MPa下的大豆分離蛋白與80和40 MPa下的大豆分離蛋白的平均粒徑相比，有顯著性差異（p＜0.05）；80和40 MPa下的大豆分離蛋白的平均粒徑與20 MPa下的大豆分離蛋白相比，有顯著差異性（p＜0.05）；與0.1 MPa下相比，20 MPa下大豆分離蛋白的平均粒徑有顯著性差異（p＜0.05）。

2.2 動(dòng)態(tài)高壓對(duì)大豆分離蛋白Zeta電位的影響

在大豆分離蛋白溶液中，其顆粒穩(wěn)定的存在在水溶液中不僅與顆粒大小有關(guān)，還與其表面帶點(diǎn)情況有密切的關(guān)聯(lián)。未經(jīng)動(dòng)態(tài)高壓微射流處理大豆分離蛋白水溶液（即0.1 MPa下的大豆分離蛋白）Zeta電位達(dá)到-26.30±0.624，20，40，80，120和160 MPa下大豆分離蛋白水溶液的Zeta電位分別為-22.13±0.569，-22.767±1.600，-22.867±1.422，-22.867±1.050和-21.80±0.692，由圖2可知，動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白水溶液的Zeta電位的影響與常壓下的大豆分離蛋白溶液具有顯著性差異（p＜0.05）。由于Zeta電位均為負(fù)值，說明大豆分離蛋白表面帶負(fù)電荷，即相同電荷的粒子間相互排斥，所以大豆分離蛋白間不易形成聚合體，從而增加蛋白溶液的穩(wěn)定性。對(duì)照組與不同壓力下的蛋白溶液相比，在壓力作用下，其Zeta電位有所上升，其主要可能是由于動(dòng)態(tài)高壓微射流處理大豆分離蛋白破壞蛋白表面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)部部分帶正電荷的物質(zhì)暴露，導(dǎo)致Zeta電位上升[12]。

圖2 動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白水溶液Zeta電位的影響

2.3 動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而進(jìn)一步測定溶液的蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.158 6x-0.143 9，R2=0.998 3。如圖3所示，隨著壓力升高，大豆分離蛋白溶解性也發(fā)生一定變化，壓力從0.1 MPa升到40 MPa時(shí)，其溶解性呈直線上升，而壓力超過40 MPa后其溶解性無顯著性變化，即動(dòng)態(tài)高壓微射流在一定程度上可以提高蛋白質(zhì)的溶解性。

圖3 動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響

2.4 動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉紅外光譜對(duì)不同壓力下的大豆分離蛋白進(jìn)行鑒定，由于蛋白質(zhì)的官能團(tuán)在紅外圖譜上表現(xiàn)相應(yīng)的特征吸收峰，從而來判斷動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響[13]。蛋白質(zhì)最常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析是酰胺帶，酰胺Ⅰ（1 600～1 700 cm-1）其振動(dòng)頻率取決于C＝O和N—H之間的氫鍵性質(zhì)，酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm-1）振動(dòng)頻率取決于C—N伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)角變振動(dòng)，酰胺Ⅲ帶（1 300～1 200 cm-1）其振動(dòng)頻率取決于C＝O的伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)變角振動(dòng)，特征振動(dòng)頻率反映了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、β-拐角和無規(guī)則卷曲[14-16]。如圖4所示，大豆分離蛋白在3 267 cm-1處主要是—NH的伸縮振動(dòng)，其吸收峰主要是（RCORNH）的吸收峰。波數(shù)在1 631 cm-1和1 525 cm-1也出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，波數(shù)在1 631 cm-1的吸收峰主要是由—C＝O的伸縮振動(dòng)引起，波數(shù)1 525 cm-1時(shí)是由于N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)造成，其譜帶為酰胺Ⅱ帶，而—CH—亞甲基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)帶和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的波數(shù)在3 066 cm-1和2 923 cm-1處，—CH彎曲振動(dòng)的波數(shù)在1 446 cm-1和1 397 cm-1處，波數(shù)在1 234 cm-1和1 072 cm-1出現(xiàn)的峰分別是由于—CH和—CN的伸縮振動(dòng)形成的峰。經(jīng)過動(dòng)態(tài)高壓微射流處理后大豆分離蛋白的紅外光譜圖發(fā)生輕微差異。由—NH伸縮振動(dòng)造成的峰的波數(shù)由3 267 cm-1處分別移至3 382，3 276，3 273，3 271和3 276 cm-1，其均有紅移趨勢，亞甲基對(duì)稱伸縮振動(dòng)和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)在不同壓力下也產(chǎn)生不同趨勢的紅移現(xiàn)象。其中在80 MPa下的大豆分離蛋白在波數(shù)1 462 cm-1的位置上峰變化較大，紅移16 cm-1，在此峰位置的其他壓力下的大豆分離蛋白也發(fā)生一定紅移趨勢，表明動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的—CH基團(tuán)影響較大從而產(chǎn)生彎曲振動(dòng)。由紅外光譜圖可知?jiǎng)討B(tài)高壓微射流處理大豆分離蛋白后并沒有產(chǎn)生新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能性基團(tuán)，但吸收峰的波數(shù)因壓力的變化而變化，均發(fā)生不同程度的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象，并其峰面積也發(fā)生一定變化，故大豆分離蛋白分子中的特殊官能團(tuán)的含量也發(fā)生一定變化，造成蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，即α-螺旋、β-折疊、β-拐角和無規(guī)則卷曲的含量也隨之變化，在高壓作用下發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。

圖4 不同壓力下大豆分離蛋白的傅里葉紅外光譜圖

2.5 動(dòng)態(tài)高壓微射流對(duì)大豆分離蛋白表面特征的影響

由圖5可知，0.1 MPa下（未經(jīng)動(dòng)態(tài)高壓處理的常壓下）處理的大豆分離蛋白表面光滑，大小不一，并有團(tuán)聚現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)緊密。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間易形成聚合體，分布比較集中。20 MPa下的大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)明顯被破碎，經(jīng)壓力作用下蛋白表面不光滑，有少量被破碎的蛋白出現(xiàn)，結(jié)構(gòu)稍微開始松散，但仍有聚合現(xiàn)象產(chǎn)生。經(jīng)過動(dòng)態(tài)高壓微射流后壓力達(dá)到40 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間形成絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并未使蛋白質(zhì)破碎成小顆粒，絲狀蛋白表面光滑細(xì)膩，可能是由于大豆分離蛋白經(jīng)動(dòng)態(tài)超高壓微射流兩次微射流化，第1次時(shí)大豆分離蛋白劇烈破碎，蛋白質(zhì)分子官能團(tuán)暴露，經(jīng)第2次的微射流時(shí)由于壓力的作用使得蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用從而聚合形成絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[17-18]。壓力達(dá)到80 MPa時(shí)，由于過高壓力，使得蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)不易進(jìn)行聚合，故形不成聚合物，而蛋白質(zhì)被破碎成更小微粒。壓力達(dá)到120 MPa時(shí)，其圖像與40 MPa下相似，但其絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)部分被破壞，其粗細(xì)不均勻，顆粒較大。160 MPa下的大豆分離蛋白由于超高壓力、高剪切力及空穴作用，其形成大量的不規(guī)則小顆粒和玻片，其形貌基本與80 MPa壓力下的大豆分離蛋白形貌相似。

圖5 0.1，20，40，80，120和160 MPa處理大豆分離蛋白的掃描電鏡圖

上述變化表明，經(jīng)動(dòng)態(tài)高壓微射流處理的大豆分離蛋白的樣品顆粒形貌發(fā)生較大變化。隨著壓力升高，大豆分離蛋白的破碎程度發(fā)生不同變化，并聚集程度也有所變化。壓力達(dá)到160 MPa時(shí)，大豆分離蛋白徹底被破壞成為細(xì)小顆粒，其現(xiàn)象均與大豆分離蛋白的粒度變化和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化相一致。

3 結(jié)論

隨著壓力升高，大豆分離蛋白的粒徑逐漸減小，在不同壓力下的大豆分離蛋白平均粒徑與常壓下（0.1 MPa）大豆蛋白溶液相比有顯著性差異（p＜0.05），動(dòng)態(tài)高壓微射流下的大豆分離蛋白Zeta電位與常壓下大豆分離蛋白相比有顯著性的差異（p＜0.05）；隨著壓力升高，其溶解性也逐漸升高，壓力超過40 MPa后，其溶解性不再隨壓力變化而變化；傅里葉紅外光分析發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)高壓微射流處理大豆分離蛋白并沒有產(chǎn)生新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能性基團(tuán)，但分子中的特殊官能團(tuán)的含量發(fā)生變化，造成蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；不同壓力下的大豆分離蛋白顆粒形貌發(fā)生較大變化，隨著壓力升高，其破碎和聚集程度均發(fā)生變化。