復(fù)合酶輔助提取杜仲葉多酚及其應(yīng)用

柯文林，楊韌強

福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（廈門 361012）

杜仲的果實因其鮮美的風(fēng)味和營養(yǎng)價值而被用作功能性飲料的來源。除了果實，其葉也有很多用途。在巴西和中國，杜仲葉被廣泛用作功能性涼茶或飲料的來源，含有各種生物活性化合物，包括酚酸、黃酮類化合物和多糖。其中，多酚具有較強的抗氧化活性，多酚類化合物是EL資源中最豐富的生物活性成分之一。

有研究表明，植物基質(zhì)的酚類化合物通常以可溶性游離、可溶性共軛和不溶性結(jié)合的形式存在。Madhujith等[1]證實大麥中不溶性結(jié)合和可溶性共軛酚類物質(zhì)的含量高于游離酚類物質(zhì)的含量。有研究表明，不溶性結(jié)合的酚類物質(zhì)占玉米、小麥、米糠和茶葉產(chǎn)品中總酚的65%以上[2]。研究還證實：不溶結(jié)合的酚類物質(zhì)由于其通過細胞壁中的O—糖苷鍵或C—糖苷鍵與多糖或蛋白質(zhì)結(jié)合，難以提??；萃取溶劑對促進不溶性結(jié)合酚類物質(zhì)的釋放沒有顯著影響[3]。多種方法被用于改善農(nóng)副產(chǎn)品中酚類成分的釋放，如加壓液體萃取、超臨界流體萃取、微波或超聲輔助萃取、水熱萃取和遠紅外輻射。這些提取方法的優(yōu)點是可以提高提取率，縮短提取時間[4-6]。然而，這些方法存在設(shè)備昂貴、規(guī)模小和環(huán)境污染等缺點，嚴重阻礙了它們在農(nóng)副產(chǎn)品中的應(yīng)用。因此，隨著市場對酚類提取物的需求不斷增加，促使人們尋找新穎、生態(tài)友好和有效的提取方法，以提高其回收率和生物利用度。酶輔助提取在提高植物基質(zhì)酚類物質(zhì)含量方面具有規(guī)模大、效率高、環(huán)保等優(yōu)點。

試驗研究不同酶輔助提取方法對改善EL中不溶性結(jié)合酚類物質(zhì)釋放的能力；表征酶輔助提取后EL中游離、可溶性共軛和不溶性結(jié)合形式中單個酚類物質(zhì)的組成和含量的變化；考察復(fù)合酶輔助多酚杜仲葉提取物在卷煙中的應(yīng)用效果，利用自主調(diào)香手段，對杜仲葉多酚提取物的香氣特征和質(zhì)量特征進行優(yōu)化，為開發(fā)高品質(zhì)、實用性杜仲葉多酚提取物產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

干燥杜仲葉，從河南太康農(nóng)場獲得。

所有酚類標準品、Folin-Ciocalteu的苯酚試劑、過硫酸鉀、FeCl3、Trolox、ABTS、2, 4, 6-三吡啶-三嗪（TPTZ）、DPPH（＞99.5%），均購自Sigma-Aldrich；甲酸、乙腈溶劑，HPLC級，99.9%，均購自Fisher Scientific；黑曲霉纖維素酶（E.C.3.2.1.4，8 000 U/g）、木聚糖酶（E.C.3.2.1.8，8 000 U/g）、里氏木霉β-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.21，8 000 U/g）、復(fù)合酶（包括纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶），均購自Youtell Biochemical公司（上海）。

1.2 酶預(yù)處理

酶促反應(yīng)體系包括5 g干燥和研磨的EL底物和20 mL H2O（用0.02 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)至pH 5.0），在50℃下分別用0.5 g單酶（纖維素酶、木聚糖酶或β-葡萄糖苷酶）或1.5 g復(fù)合酶混合物（纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡萄糖苷酶=1∶1∶1）培養(yǎng)12 h。酶處理1式3份。反應(yīng)完成后，所有樣品在80 ℃烘箱中保持20 min使這些酶失活。收集不同酶處理的EL樣品，在60 ℃下干燥15 h，除去水分。

1.3 游離酚類組分的提取

1 g預(yù)處理后的EL粉末，用70%甲醇以1∶10（g/mL）的比例進行提取。每次萃取，混合物在40 ℃水浴中保存1 h。濾液用70 mL乙酸乙酯經(jīng)液-液分層萃取3次。乙酸乙酯去除后，提取物在5 mL 50%甲醇（V/V）中重新溶解。

1.4 可溶性共軛酚類物質(zhì)的提取

游離酚類組分乙酸乙酯萃取后，從水相中提取共軛酚類組分。用40 mL的2 mol/L NaOH水解4 h，用12 mol/L HCl酸化至pH 2.0。用70 mL乙酸乙酯進行液液分層，對水解物進行3次萃取。乙酸乙酯餾分在45℃下真空蒸發(fā)至干燥，提取液在50%甲醇（V/V）的5 mL中再溶解。

1.5 不溶性結(jié)合酚類的萃取

將上述游離酚類物質(zhì)提取的干燥葉渣（0.5 g）在室溫下用50 mL的2 mol/L NaOH直接水解4 h，用12 mol/L HCl酸化為pH 2.0。用70 mL乙酸乙酯提取3次剩余的混合物。乙酸乙酯組分在45 ℃真空下蒸發(fā)直到干燥。將不溶結(jié)合的酚類物質(zhì)加入5 mL的50%甲醇（V/V）溶解。所有酚類提取物在分析前在-20 ℃處存放。

1.6 酚含量的測定

100 μL酚類提取物與30 μL的Folin-Ciocalteu試劑及150 μL的20% Na2CO3溶液混合。在黑暗處30 ℃培養(yǎng)30 min后，用Spectra Max Gemini microtiter plate reader（分子設(shè)備，Sunnyvale，CA，USA）在760 nm處測量吸光度。以沒食子酸（10～100 μg/mL）為參比標準（R2=0.999 5）。酚類含量以mg沒食子酸當量（GAE）/g樣品干質(zhì)量（DM）（mg GAE/g DM）表示。樣品測定1式3份。

1.7 黃酮類化合物含量的測定

用AlCl3比色法測定黃酮類化合物的含量。將0.1 mL上述提取物被放置在1支2 mL的Eppendorf試管中。加入70%甲醇溶液制成0.5 mL溶液，加入30 μL 5%NaNO2溶液。室溫保存5 min后，加入10% AlCl3溶液30 μL，靜置6 min。加入0.2 mL的1 mol/L NaOH用70%甲醇溶液將總體積增加到1 mL。溶液再次徹底混合，在35 ℃下靜置30 min。在510 nm處讀取吸光度。以蘆?。?0～100 μg/mL）為參考標準（R2=0.999 5）。黃酮類化合物含量以mg蘆丁當量（RE）/g樣品干燥重量（DM）（mg RE/g DM）表示。所有樣品測定1式3份。

1.8 HPLC分析

HPLC系統(tǒng)為Waters e2695，分析柱為Waters SunFireTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相由0.1%甲酸水溶液（V/V，溶液A）和乙腈溶液（溶液B）組成，以0.8 mL/min的梯度洗脫，隨時間增加，0～5 min，15% B相，5～10 min 15%～20% B相，10～20 min 20%～25% B相，20～30 min 25%～35% B相，30～40 min 35%～50% B相，40～50 min 80% B相，50～55 min 15% B相。柱溫設(shè)定為300 ℃。DAD檢測波長設(shè)置為280 nm。在HPLC分析之前，樣品通過0.25 μm膜過濾器（Millipore，Billerica，MA，USA）過濾。EL樣品中，單個酚類物質(zhì)含量以mg/100 g DM進行表示。

1.9 統(tǒng)計分析

所有試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（SD）。數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計13.0軟件進行分析。采用單因素方差分析（ANOVA）方法，評價檢驗水平均值差異的顯著性。p＜0.05和p＜0.01分別表示差異顯著和高度顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶輔助提取法下總酚和黃酮含量的變化及影響分析

不同酶輔助提取方法的EL提取物中可溶性游離多酚（FP）、可溶性共軛多酚（SCP）、不溶性結(jié)合多酚（IBP）和總多酚（TSP）的含量如圖1所示。單纖維素酶輔助提?。–AE）后，F(xiàn)P、SCP、IBP和TSP的產(chǎn)率分別為19.4，13.3，22.0和27.1 mg GAE/g DM。與未處理（CK）相比，F(xiàn)P、SCP和TSP含量分別提高37.6%，30.1%和34.8%。單木聚糖酶輔助提?。╔AE）對酚類含量無顯著影響（p=0.134）。單β-葡萄糖苷酶輔助提?。℅AE）也顯著增加FP、SCP和TSP含量，比對照組CK高1.6，1.8和1.7倍（p=0.000）。此外，復(fù)合酶輔助提?。–EAE）明顯提高FP、SCP和TSP含量，比對照組提高1.9，2.2和2.0倍，IBP的含量降低59.17%。在對照組CK中，F(xiàn)P與TP的比例僅35.7%。然而，CEAE后，該比率增加到了1.3。相應(yīng)的IBP從對照組CK的42.4%下降到CEAE組的13.1%。

圖1 不同處理方式下不同結(jié)合態(tài)多酚類化合物含量

圖2顯示EL提取物中FF、SCF、IBF和TSF的含量。在CAE后，F(xiàn)F、SCF、IBF和TSF的含量分別為17.5，15.4，22.3和30.2 mg RE/g DM。與對照組CK相比，F(xiàn)F、SCF和TSF分別增加19.2%，13.3%和12.7%。XAE對TSF含量無顯著影響（p=0.211），但GAE顯著增加FF、SCF和TSF的含量，比未處理組多1.5，1.3和1.5倍（p=0.001）。此外，CEAE明顯增加FF、SCF和TSF的含量，比未處理組增加2.1，1.4和1.8倍，IBP含量降低73.6%。FF對總酚類物質(zhì)的貢獻從CK組的37.2%增加到CEAE組的63.5%，而相應(yīng)的IBF從CK組的39.8%下降到CEAE組的8.7%。

圖2 不同處理方式下不同結(jié)合態(tài)黃酮類化合物含量

可溶性酚類物質(zhì)容易從植物基質(zhì)中釋放出來，而不溶性結(jié)合的酚類化合物的提取困難。不溶性結(jié)合形式的酚類化合物與植物細胞壁結(jié)構(gòu)元素如纖維素、半纖維素和結(jié)構(gòu)蛋白或多糖共價結(jié)合。試驗證實木聚糖酶輔助提取對提高可溶性酚類物質(zhì)和黃酮類化合物（游離和共軛形式）的產(chǎn)率沒有顯著影響。然而，纖維素酶或者β-葡萄糖苷酶輔助提取增加不溶性結(jié)合酚類物質(zhì)和黃酮類化合物的釋放。此外，復(fù)合酶輔助提取是一種更高效的方法，可以提高不溶性結(jié)合酚類物質(zhì)的釋放，獲得比單一酶輔助提取產(chǎn)生較高的酚類物質(zhì)含量。

復(fù)雜的酶輔助提取比使用單一的酶輔助提取更有效，這與以前的研究是一致的[2,7-8]。這一點是因為EL是由許多黃酮類化合物，以糖苷鍵或OH基形式附著在細胞壁、多糖或蛋白質(zhì)上而組成的。許多報道證實β-葡萄糖苷酶和纖維素酶可以更有效地破壞鍵（糖苷鍵或—OH）。然而，木聚糖酶可能在酚類物質(zhì)與植物基質(zhì)細胞壁之間的鍵破裂中起著少數(shù)作用。已有證實了與紅曲霉和釀酒酵母的固態(tài)共發(fā)酵增強EL的酚類含量，但游離、共軛和不溶性結(jié)合酚類物質(zhì)的變化與不溶性結(jié)合酚類物質(zhì)的釋放和發(fā)酵過程中的酶作用之間的關(guān)系尚不清楚[6,9]。因此，對EL中的酚類物質(zhì)進行綜合評價是很重要的，包括在特定的酶輔助提取下，游離、共軛和不溶性結(jié)合的酚類物質(zhì)的變化。

2.2 酶輔助提取下酚類化合物的變化

分析EL輔助提取后的15種酚類化合物，包括沒食子酸、對香豆酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D木糖吡喃苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、木耳素、槲皮苷、槲皮素和山奈酚（圖3）。在HPLC分析基礎(chǔ)上，酶輔助提取物后3種酚類組分的組成相似，但含量有明顯差異（p＜0.05）。從圖3（B和C）及表1可以發(fā)現(xiàn)，槲皮素-3-O-β-D木糖吡喃苷和山奈酚僅以可溶性游離形式存在，而綠原酸、蘆丁、芥子酸、?；撬岷烷纹に睾苌僮鳛榭扇苄怨曹椥问酱嬖凇４蠖鄶?shù)測定的酚類物質(zhì)以游離、可溶性共軛和不溶性結(jié)合形式存在（圖3 B～D）。在CAE后，除丁香酸和鐵酸外，EL提取物中的單個酚類物質(zhì)含量略有增加，但不顯著（p=0.39）。經(jīng)XAE后，EL提取物中單一酚類化合物含量無明顯變化（p=0.43）。

圖3 不同酶輔助提取方法色譜圖

用β-葡萄糖苷酶處理也能明顯提高單個酚類物質(zhì)的總可溶性含量，特別是沒食子酸和槲皮素的可溶性含量，分別提高35.3%和155.2%，而蘆丁、牛耳苷和槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷分別降低71.6%，71.8%和20.3%。EL提取物中每種酚類化合物含量提取物在CEAE處理后的含量增加情況為桂酸56.8%、綠原酸36.2%、對羥基苯甲酸85.1%、咖啡酸86.9%、對香豆酸75.1%、槲皮素-3-O-β-D木糖吡喃苷36.4%、槲皮苷26.7%、槲皮素251.6%、山鐵素121.7%，此外，4種酚類化合物總含量下降，分別為丁香酸68.1%、蘆丁88.7%，槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷81.8%和木耳素92.5%。

2.3 酶輔助提取對酚類物質(zhì)組成的作用

一般來說，CAE增加EL中單個酚類化合物的可溶性含量，但丁香酸除外，該酸明顯下降，這可能是由于暴露于高溫下的降解所致。GAE不僅可以促進酚類化合物的釋放，而且還可以將黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元。GAE從EL中釋放槲皮素199.1 mg/100 g DM，而CEAE增加到258.9 mg/100 g DM，是對照的3.5倍。槲皮素含量的顯著提高是由于植物細胞壁損傷所產(chǎn)生的酶效應(yīng)與槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖和牛耳素的生物轉(zhuǎn)化相互作用所致。有趣的是，CEAE帶來比單一酶處理更大的單個酚類物質(zhì)的釋放，EL提取物中可溶性游離酚類物質(zhì)大于可溶性共軛和不溶性結(jié)合形式[10-11]。研究還發(fā)現(xiàn)，纖維素酶和α-淀粉酶處理釋放的可溶性共軛物比游離酚酸更多，包括阿魏酸、香豆酸、咖啡酸和香草酸，并且釋放量在測試酶之間有顯著性差異[3,12]?？傊恍﹤€別酚類物質(zhì)的釋放方式不同，是由于它們不同細胞壁成分的附著，以及酶的特異性。

3 酶輔助杜仲葉提取物在卷煙應(yīng)用中評價

3.1 不同形態(tài)多酚杜仲葉提取物的評價

將按優(yōu)化的復(fù)合酶預(yù)處理法提取杜仲葉多酚添加至卷煙中，對其在卷煙中的作用進行感官評價，評價結(jié)果如表1。采用復(fù)合酶預(yù)處理法提取的可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物在中間香型卷煙葉組中的表現(xiàn)最好，能增加清香香韻，提升香氣質(zhì)感，甜感舒適自然；游離態(tài)多酚杜仲葉提取物會拉低煙香的清晰明亮度，且煙氣偏粗；不可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物在卷煙中應(yīng)用雖增加煙氣濃度，但風(fēng)格特征較弱，口腔干燥，口感稍欠。因此在添加量0.05%的中間香型卷煙葉組中可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物具有良好應(yīng)用效果。

表1 復(fù)合酶提取杜仲葉多酚提取物在卷煙中的感官評價結(jié)果

3.2 可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物的香味特征優(yōu)化

復(fù)合酶酶預(yù)處理法提取的可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物能增加卷煙的青香香韻，提升香氣質(zhì)感，甜感舒適自然，這方面的作用對于提取物來說較有優(yōu)勢，但是杜仲葉提取物因原料價格及提取率的限制，單獨使用成本較高。在香基的基礎(chǔ)上，通過復(fù)合酶預(yù)處理法提取的可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物對其香原料自然感進行修飾，并用體現(xiàn)煙草本香（巨豆三烯酮、茄酮）、清香及清甜香（苯乙醇、β-大馬酮、樹蘭花油、春黃菊油）等原料對煙草香及清香、花香進行銜接，獲得復(fù)配的可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物。

調(diào)香試驗及不同比例配方的感官評價結(jié)果如表2和表3所示。DZYTQW-1的清甜香韻稍有增加，甜香較明顯，香氣質(zhì)提升，煙氣較細膩柔和，但清香、清甜香韻不夠明顯，煙草本香底蘊和厚實感也稍欠，且略有花粉氣息；在DZYTQW-1配方的基礎(chǔ)上，通過增加茄酮和巨豆三烯酮的用量提升煙草底蘊質(zhì)感，增加可溶性多酚杜仲葉提取物、大馬酮和春黃菊油的比例來增強煙香的自然感、厚實度和掩蓋雜氣，降低樹蘭花油和苯乙醇的含量來減少花粉氣息形成配方DZYTQW-2，該配方清香、清甜香韻增加明顯，煙草底蘊厚實飽滿，但煙香略顯粗糙，余味欠干凈，且透發(fā)性不夠。再次適當減少茄酮和巨豆三烯酮的用量形成DZYTQW-3配方，該配方的清香、清甜香韻增加明顯，香氣甜醇、質(zhì)感提升且與煙草本香協(xié)調(diào)性好，煙氣豐滿又醇和細膩，較飄逸透發(fā)，余味干凈舒適自然。

表2 可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物配方

表3 不同配方的可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物感官評價結(jié)果

4 結(jié)論

試驗表明，單木聚糖酶輔助提取不改變EL中可溶性酚類物質(zhì)的組成和產(chǎn)率。單纖維素酶或β-葡萄糖苷酶輔助提取顯著提高EL的可溶性酚類物質(zhì)含量。同時，復(fù)合酶輔助提取不僅提高EL中可溶性酚類物質(zhì)的產(chǎn)率，且大部分酚類物質(zhì)以可溶性形式存在，很少以不溶結(jié)合的形式存在。還能將黃酮苷元轉(zhuǎn)化為具有較強抗氧化活性的黃酮苷（槲皮素和山奈酚）。更重要的是，CEAE后EL的總可溶性酚類提取物，顯示最高的抗氧化活性和超螺旋DNA抗損傷的保護作用。利用復(fù)合酶對杜仲葉可溶性結(jié)合態(tài)多酚提取能力較強，所得可溶性結(jié)合態(tài)多酚杜仲葉提取物可以增加卷煙清香韻，提升煙氣細膩柔和度及香氣質(zhì)感，改善口感。因此復(fù)合酶輔助提取法作為杜仲葉多酚提取物的前處理方法具有優(yōu)勢。通過對體現(xiàn)煙草本香、清香及清甜香等原料的篩選，對杜仲葉多酚的香味特征進行修飾優(yōu)化，將為EL加工成以多酚為基礎(chǔ)的食物來源或杜仲葉產(chǎn)品提供有用信息，提升產(chǎn)品品質(zhì)和實用性，且獲得的產(chǎn)品更具健康益處?？傊?，復(fù)合酶輔助提取技術(shù)可用于從植物基質(zhì)中提取生化成分，在煙草和制藥工業(yè)中具有良好的應(yīng)用潛力。